Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Streszczenie

Proteomy komórek są często charakteryzowane za pomocą testów elektroforezy, gdzie wszystkie gatunki białek w komórkach są niespecyficznie znakowane barwnikiem fluorescencyjnym i są wykrywane przez fotodetektor po ich rozdzieleniu. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki może zapewnić ultraczułe wykrywanie białek dzięki możliwości wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. Jednak zastosowanie tej potężnej metody obrazowania do testów elektroforetycznych jest utrudnione ze względu na brak sposobów scharakteryzowania jednorodności znakowania fluorescencyjnego każdego rodzaju białka w proteomie. W tym miejscu opracowaliśmy metodę oceny jednorodności znakowania w całym proteomie w oparciu o test obrazowania fluorescencji pojedynczej cząsteczki. W naszym pomiarze z wykorzystaniem próbki komórek HeLa, proporcja białek znakowanych co najmniej jednym barwnikiem, który nazwaliśmy "zajmowaniem znakowania" (LO), została określona na zakres od 50% do 90%, co potwierdza wysoki potencjał zastosowania obrazowania pojedynczej cząsteczki do czułej i precyzyjnej analizy proteomu.

Wprowadzenie

Analiza proteomu, która ma na celu ilościowe określenie całego zestawu cząsteczek białka wyrażanych w komórce, jest cennym podejściem w obecnych badaniach biologicznych i medycznych. Analiza ta zwykle opiera się na spektrometrii mas, która identyfikuje gatunki białek na podstawie widm generowanych przez jonizację białek^1,2,3. Alternatywną metodą analizy proteomu jest elektroforeza, w tym elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE), elektroforeza kapilarna oraz dwuwymiarowa (2D) elektroforeza żelowa. Metoda ta polega na niespecyficznym znakowaniu fluorescencyjnym wszystkich cząsteczek białka w analizowanych komórkach, a następnie na separacji elektroforetycznej oraz wykrywaniu i oznaczaniu ilościowym każdego rodzaju białka. Aby osiągnąć wymagane niespecyficzne znakowanie białek, jedną ze strategii jest użycie barwników fluorescencyjnych, które mogą wiązać się z białkami poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe, takich jak Coomassie Blue i Sypro-Ruby^4,5,6. Alternatywną strategią jest zastosowanie znakowania kowalencyjnego barwnikami zawierającymi ester N-hydroksysukcynimidu (NHS) lub maleimid, które mogą kowalencyjnie wiązać się z białkami poprzez wspólne reszty, takie jak odpowiednio aminy pierwszorzędowe i tiole^7,8.

Tymczasem, czułość wykrywania fluorescencji jest idealna do analizy białek o niskiej obfitości i małej liczby komórek. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki jest jedną z najbardziej czułych metod, która umożliwia wykrywanie pojedynczych barwników fluorescencyjnych i znakowanych białek in vitro i in vivo^{9,10,11,12,13,14,15}. Oczekuje się, że zastosowanie tej metody obrazowania do analizy proteomu opartej na elektroforezie umożliwi wysoce czułe i ilościowe testy poprzez zliczanie pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie. Nie jest jednak jasne, czy znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi jest wystarczająco jednorodne we wszystkich cząsteczkach białka i jak na tę jednorodność wpływają różne gatunki białek (Rysunek 1). Proste pomiary roztworu masowego mogą być wykorzystane do uzyskania stosunku molowego barwników fluorescencyjnych do białek zwanego "wydajnością sprzężenia"⁸ lub "wydajnością znakowania", ale ta właściwość nie dostarcza informacji na temat jednorodności znakowania między cząsteczkami białka.

Tutaj opisujemy protokół testu do zbadania jednorodności etykietowania dla wszystkich gatunków białek w komórce (Rysunek 2)¹⁶. Dwa kluczowe etapy tego testu to oczyszczanie białek i obrazowanie. W pierwszym etapie wszystkie białka w komórkach są znakowane fluorescencyjnie i biotynylowane, a następnie ekstrahowane oddzielnie za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie elektroelucji. W drugim etapie oceniane są właściwości fluorescencyjne poszczególnych cząsteczek białek w wyekstrahowanych próbkach na podstawie obrazowania pojedynczych cząsteczek. Na podstawie tych danych można scharakteryzować parametry ważne dla analizy zliczania, takie jak procent białek znakowanych co najmniej jednym barwnikiem, który nazywamy tagowaniem zajętości (LO)¹⁶, oraz średnia liczba barwników fluorescencyjnych związanych z pojedynczą cząsteczką białka (barwnik n̄). W protokole jako przykład przedstawiono zoptymalizowaną procedurę znakowania proteomu komórek HeLa barwnikiem cyjaniny 3 (Cy3) na bazie estrów NHS, która może być modyfikowana za pomocą innych procedur znakowania zgodnie z pożądanymi celami badawczymi.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Hodować komórki HeLa w 10-centymetrowym naczyniu w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ w zmodyfikowanym pożywce Eagle's firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.
2. Zbieraj wykładniczo rosnące komórki, gdy osiągną 70% konfluencji, postępując zgodnie z instrukcjami ATCC¹⁷.
   1. Przepłukać komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (pH 7,4). Usuń PBS.
   2. Dodać 1 ml 0,1% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Monitoruj postęp dysocjacji komórek za pomocą mikroskopii.
   4. Gdy komórki staną się okrągłe i zostaną odłączone od naczynia, dodaj 4 ml pożywki wzrostowej i przerwij aglomerację komórek przez pipetowanie.
   5. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
   6. Wirować przy 150 x g przez 10 minut w probówce wirówkowej. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml 1x PBS (pH 7,4).
   7. Powtórz krok 1.2.6. Ponownie zawiesić komórki w 1x PBS (pH 7,4) do końcowego stężenia 10⁶ komórek/ml, używając liczby liczby w kroku 1.2.5.
      UWAGA: Zawiesinę komórek można porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Należy unikać powtarzania cyklu zamrażania/rozmrażania.

2. Liza komórek i znakowanie fluorescencyjne

1. Przygotować 10 ml buforu lizującego (0,1 M boranu, 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1% Tween 20). Dostosować do pH 12 za pomocą 2 M NaOH.
   UWAGA: Skoncentrowany NaOH jest. Podczas przygotowywania tego roztworu należy nosić odpowiednie rękawice i okulary.
   UWAGA: Bufor lizujący może być przechowywany do tygodnia w temperaturze pokojowej.
2. Zmieszać 100 μl buforu lizującego z 1 μl 1 M ditiotreitolu (DTT) i 4 μl 50% 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS).
3. Wymieszać 1 μl kultury komórkowej (około 1 000 komórek) z mieszanym buforem lizującym z kroku 2.2. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając. Ponownie homogenizować roztwór, powoli pipetując.
4. Dodać 1 μl 2 μg/ml barwnika estrowego Cy3 NHS. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
   UWAGA: Wysokie pH tego buforu powoduje neutralizację reszt lizyny w białkach, co prowadzi do wyższej reaktywności.
5. Powtórzyć dodawanie 1 μl 2 μg/ml barwnika estrowego Cy3 NHS. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
   UWAGA: To wielokrotne dodawanie barwnika estrowego NHS może zwiększyć skuteczność znakowania, ponieważ część barwnika estrowego Cy3 NHS jest hydrolizowana i dezaktywowana przez wysokie pH buforu reakcyjnego.
6. Doprowadzić do pH 7,2 przez dodanie 100 μl 0,8 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)-NaOH o pH 7,2 w celu wygaszenia reakcji. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
7. Dodać 20 μl 19 mg/ml biotyny-(glikolu polietylenowego (PEG)_)2-aminy i 5 μl 20 mg/ml 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) o stężeniu 20 mg/mL. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
   UWAGA: Ten etap biotynylacji jest niezbędny do utrwalenia cząsteczek białka na szkiełku nakrywkowym mikroskopu o ustalonej gęstości i bez odchylenia dla gatunków białek.
8. Usunąć nieprzereagowane odczynniki do etykietowania i zagęścić próbkę za pomocą kolumny ultrafiltracyjnej z odcięciem 10 kDa, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.

3. Separacja i odzyskiwanie proteomu

1. Dodać 4x bufor próbki SDS (200 mM Tris-HCl pH 6,8, 4% SDS, 4% glicerolu i 0,4% błękitu bromofenolowego).
   UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia barwnika, próbka białka nie powinna być podgrzewana, jak to ma miejsce w standardowym SDS-PAGE, i powinna być przechowywana w temperaturze pokojowej.
2. Wykonaj standardową SDS-PAGE dla próbki białka i drabinki molekularnej, używając 20% żelu akrylowego. Migrować próbkę w żelu pod stałym napięciem (160 V), aż front migracji opuści żel.
3. Zobrazuj żel, aby zidentyfikować położenie prążków białkowych (Rysunek 3).
4. Wytnij porcje żelu, w tym interesujące frakcje białkowe, za pomocą ostrego ostrza, w oparciu o lokalizacje pasków. Frakcjonowanie przy pikach 16, 23, 55 i 120 kDa oraz przy 19–25, 25–32, 32–42, 42–54, 54–69, 69–97, 97–136 i 136–226 kDa regiony są pokazane w Rysunek 3.
5. Za pomocą dializatora ekstrahować białka metodą elektroelucji o wielkości porów 6–8 kDa, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Wyekstrahowaną próbkę można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.

4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pod mikroskopem

1. Przygotować 200 μl buforu awidyny (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/ml awidyny i 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) dla każdej próbki.
2. Przygotować szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm i grubości 0,15 mm. Wystaw szkiełka nakrywkowe na działanie plazmy powietrznej za pomocą środka do czyszczenia plazmowego przez 1 minutę, aby oczyścić i aktywować ich powierzchnie.
3. Pokryj szkiełka nakrywkowe awidyną, obracając 200 μl buforu awidyny za pomocą powlekarki wirowej przez 5 sekund przy 500 obr./min, a następnie przez 30 sekund przy 1 000 obr./min. Inkubuj szkiełka nakrywkowe przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby wyschły.
4. Przygotować szkiełka nakrywkowe do próbki białka.
   1. Rozcieńczyć próbkę białka (od 3,5) 100 razy w 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
   2. Umieścić 100 μl rozcieńczonej próbki na powierzchni pośrodku szkiełka nakrywkowego pokrytego awidyną (od kroku 4.3).
   3. Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przygotować kontrolę pozytywną.
   1. Umieścić 100 μl 10 ng/ml oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w 5 mM HEPES-NaOH o pH 7,2 na środku szkiełka nakrywkowego pokrytego awidyną (od kroku 4.3).
   2. Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: To szkiełko nakrywkowe z kontrolą pozytywną zapewnia gęstość plam wiązania awidyny, która służy do obliczania LO.
6. Przygotować kontrolę ujemną.
   1. Oczyszczone plazmowo szkiełko nakrywkowe należy obtoczyć 200 μl 5 mM HEPES-NaOH i 2 mg/ml BSA (bez awidyny).
   2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
   3. Dodać 100 μl 10 ng/ml oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
   4. Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: To szkiełko nakrywkowe z kontrolą ujemną zapewnia ilość niespecyficznego wiązania fluorescencyjnej biotyny ze szkiełkiem nakrywkowym bez awidyny.
7. Przepłukać każde szkiełko nakrywkowe 200 μl wody destylowanej, pipetując krawędzie szkiełka nakrywkowego tak, aby nie dotykać końcówką środka szkiełka nakrywkowego. Powtórz to pranie trzy razy.
   UWAGA: Po zassaniu wody na szkiełku nakrywkowym, wodę należy natychmiast umieścić z powrotem na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec jego całkowitemu wyschnięciu.
8. Poddać plazmę powietrzną takiej samej liczbie szkiełek nakrywkowych, jak w kroku 4.2.
9. Umieścić oczyszczone szkiełko nakrywkowe na szkiełku nakrywkowym związanym z próbką z kroku 4.7, aby uniknąć wyschnięcia.

5. Obserwacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

1. Uruchomić mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu widzenia lub w polu ulotnym.
   UWAGA: Bezpośrednie lub rozproszone promieniowanie laserowe może spowodować uszkodzenie oczu lub skóry. Nosić odpowiednie okulary ochronne i osłaniać ścieżkę światła lasera.
   UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji mikroskopu, zapoznaj się z naszą poprzednią publikacją¹⁶. Krótko mówiąc, do tego pomiaru można użyć mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu lub pola ulotnego, wyposażonego w wzbudzenie laserowe o dużej mocy 488 nm, obiektyw o dużej aperturze numerycznej i kamerę o wysokiej czułości. Ponadto, w celu zautomatyzowanego pomiaru, zaleca się zainstalowanie sterowanego komputerowo stolika na próbki translacyjne XY, mechanicznych przesłon do wzbudzeń laserowych oraz systemu automatycznego ustawiania ostrości.
2. Umieść szkiełko nakrywkowe na mikroskopie i znajdź ostrość.
3. Wykonaj skanowanie kafelków, aby uzyskać co najmniej 100 obrazów.
   UWAGA: Oświetlenie laserowe powinno być kontrolowane za pomocą mechanicznych przesłon, aby można je było naświetlić próbkę tylko podczas nagrywania obrazów aparatem, aby zminimalizować fotowybielanie. Jeśli próbek jest dużo, zaleca się automatyczny pomiar za pomocą programu komputerowego do sterowania urządzeniami mikroskopowymi. Każdy obraz zazwyczaj zawiera 100–500 plamek pojedynczych cząsteczek w przypadku korzystania z soczewki obiektywowej o powiększeniu 60x.

6. Analiza obrazu i ekstrakcja informacji

1. Jeśli obraz ma nierówności spowodowane wzorem oświetlenia laserowego, przeprowadź przetwarzanie obrazu, aby go poprawić¹⁸.
   1. Uzyskać obraz referencyjny, dokonując pomiaru za pomocą próbki szkiełka nakrywkowego składającej się z równomiernie rozprowadzonych barwników, przy ustawieniu kamery takim samym jak w kroku 5.3.
   2. Uzyskaj obraz offsetowy, mierząc bez wzbudzenia laserowego przy użyciu tego samego ustawienia kamery.
   3. Odejmij każdą wartość piksela na każdym przykładowym obrazie i obrazie referencyjnym od wartości obrazu przesuniętego.
   4. Podziel każdą wartość piksela na odjętych przykładowych obrazach przez wartość na odjętym obrazie referencyjnym.
2. Zbierz prawidłowo pozyskane obrazy i usuń tło obrazu.
   1. Obrazy zawierające duże agregaty fluorescencyjne można usuwać ręcznie.
   2. Usuń tło obrazu, stosując algorytm toczącej się kuli¹⁹ o promieniu kuli 50 pikseli za pomocą ImageJ²⁰.
   3. Wyostrz obrazy, odejmując rozmyte obrazy za pomocą ImageJ (funkcja wyostrzania obrazu).
3. Znajdowanie i analizowanie plam pojedynczych cząsteczek na obrazach.
   1. Zidentyfikuj plamki pojedynczej cząsteczki za pomocą algorytmu progu Yena²¹ za pomocą ImageJ.
   2. Filtruj plamki zawierające mniej niż dwa piksele, aby wykluczyć ciemny szum kamery i plamki większe niż 20 pikseli, aby wykluczyć agregacje białek za pomocą ImageJ (menedżer ROI).
   3. Policz liczbę plam na każdym obrazie. Korzystając z obrazów z korekcją oświetlenia (krok 6.1.4), przeanalizuj całkowite intensywności w pikselach dla każdego punktu za pomocą ImageJ.
4. Oblicz zajętość etykietowania (LO) za pomocą następującego wzoru:
   LO = (liczba zliczeń w próbce / liczba liczb w kontroli dodatniej) x 100
5. Obliczyć średnią liczbę barwników fluorescencyjnych związanych z pojedynczą cząsteczką białka (barwnik n̄).
   1. Przeanalizuj histogram intensywności każdego punktu.
      UWAGA: Histogram ma zwykle kilka pików, a każdy pik reprezentuje inną liczbę cząsteczek barwnika związanych z białkiem. Pierwszy, drugi i trzeci pik na histogramie odpowiadają odpowiednio 1, 2 i 3 cząsteczkom.
   2. Oblicz średnią intensywność na podstawie histogramu. Oblicz również intensywność piku pierwszego piku, stosując dopasowanie Gaussa.
   3. Oblicz barwnik n̄, dzieląc średnią intensywność przez intensywność szczytową.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia surowe dane obrazowe dla różnych frakcji masowych białek z lizatu komórkowego HeLa, a także kontroli pozytywnej i negatywnej. Podczas gdy zarówno próbka białka, jak i kontrola pozytywna wykazują 100–500 plamek na obrazie, kontrola ujemna nie wykazuje żadnych plamek lub wyświetla ich kilka, co pokazuje, że protokół w wystarczającym stopniu hamuje niespecyficzne wiązanie barwników z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Histogramy intensywno...

Dyskusja

W artykule opisano protokół ilościowego oznaczania jednorodności znakowania każdego znakowanego gatunku białka w komórkach po separacji za pomocą SDS-PAGE (krok 3). Metodę rozdzielania można zastąpić innymi metodami, takimi jak chromatografia cieczowa lub elektroforeza kapilarna, które umożliwiają separację i frakcjonowanie białek komórkowych z wysoką rozdzielczością, przy czym wymagają specjalnego sprzętu²³. Metoda znakowania przy użyciu estru NHS w obecnym protokole może zostać zastąpiona innymi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełko nakrywkowe 22x22x0,15 mm	VWR	470019-004
488 nm Laser argonowy	Coherent	Innova 70C
488 nm lustro dichroiczne	Semrock	FF495-Di03
Filtr emisyjny 488 nm	Semrock	FF02-520/28
Filtr dichroiczny 560 nm	Filtr
560 nm	Laser światłowodowy Semrock	FF02-617/73
560 nm	MBP Communications	F-04306-2 60-krotna
soczewka olejowa	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotyna-PEG-amina	Thermo Scientific	21346
Biotynylowana Alexa Fluor 488	Nanocs
Boran	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-ester dye	GE Healthcare	PA13101
Dializator  - D-tube, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD	kamera Andor	IiXon 897
Epi mikroskop fluorescencyjny	Olympus	IX81
Przeglądarka żelowa	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Mieszanka penicyliny, streptomycyny i amfoteryny	Gibco
Myjka plazmowa	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Rozmiar kolumny oczyszczającej 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416