Artykuł metodologiczny

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

DOI:

10.3791/59212

⸱

1 marca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ca2+-sygnalizacja jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania plemników i męskiej płodności. Podobnie reakcja akrosomowa jest niezbędna dla zdolności ludzkiego plemnika do przenikania przez osłonę przejrzystą i zapłodnienia komórki jajowej. Dlatego bardzo interesujące jest testowanie związków (np. chemikaliów środowiskowych lub kandydatów na leki) pod kątem ich wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w nasieniu ludzkim, albo w celu zbadania potencjalnego niekorzystnego wpływu na funkcję plemników ludzkich, albo w celu zbadania możliwej roli jako środka antykoncepcyjnego. W tym miejscu opisano dwa testy średnioprzepustowe: 1) test oparty na fluorescencji do oceny wpływu na sygnalizację Ca2 + w nasieniu ludzkim oraz 2) test cytometrii obrazowej do oceny reakcji akrosomów w nasieniu ludzkim. Testy te mogą być stosowane do badań przesiewowych dużej liczby związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach. Ponadto testy mogą być wykorzystywane do generowania wysoce specyficznych krzywych dawka-odpowiedź poszczególnych związków, określania potencjalnej addytywności/synergizmu dla dwóch lub więcej związków oraz do badania farmakologicznego sposobu działania poprzez eksperymenty z hamowaniem konkurencyjnym z inhibitorami CatSper.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem dwóch opisanych tutaj testów jest zbadanie wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w ludzkim plemniku, jak wykazano dla wielu związków w kilku publikacjach wykorzystujących te testy1,2,3,4,5,6,7. Sygnalizacja Ca2+ i reakcja akrosomów są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania plemników i męskiej płodności.

Ogólnym celem ludzkiej komórki plemnika jest zapłodnienie komórki jajowej. Aby móc skutecznie i naturalnie zapłodnić komórkę jajową, funkcje plemnika muszą być ściśle regulowane podczas podróży plemnika przez żeński układ rozrodczy8,9. Wiele funkcji plemników jest regulowanych przez wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ [Ca2+]i (np. ruchliwość plemników, chemotaksja i reakcja akrosomowa)10. Również proces dojrzewania zwany kapacytacją, który sprawia, że plemnik jest zdolny do zapłodnienia komórki jajowej, jest częściowo regulowany przez [Ca2+]i10. Pompy Ca2+-ATPazy wytłaczające Ca 2+ sup class<="xref">11 utrzymują około 20 000 krotny gradient Ca2+ nad błoną ludzkich plemników, z spoczynkowym [Ca2+]i wynoszącym 50-100 nM. Jeśli Ca2+ może przejść przez błonę komórkową (np. Przez otwarcie kanałów Ca2+), następuje znaczny napływ Ca2+, powodując wzrost [Ca2+]i. Jednak plemnik przenosi również wewnątrzkomórkowe zapasy Ca2 +, które mogą uwalniać Ca2 +, a zatem powodować również wzrost [Ca2 +] i12. Co ciekawe, do tej pory stwierdzono, że cały napływ Ca2+ do ludzkich plemników za pośrednictwem kanału zachodzi za pośrednictwem CatSper (Cat ionic channel of Sperm), który ulega ekspresji tylko w plemnikach11. W ludzkich plemnikach CatSper jest aktywowany przez endogenne ligandy progesteron i prostaglandyny poprzez różne miejsca wiązania ligandów13,14,15, co prowadzi do szybkiego napływu Ca2+ do plemnika. Dwa główne źródła w pobliżu jaja zapewniają wysoki poziom tych endogennych ligandów. Jednym z nich jest płyn pęcherzykowy, który zawiera wysoki poziom progesteronu16. Płyn pęcherzykowy jest uwalniany z dojrzałych pęcherzyków wraz z komórką jajową podczas owulacji i miesza się z płynem w jajowodach17. Innym głównym źródłem są komórki wzgórka, które otaczają jajo i uwalniają wysoki poziom progesteronu i prostaglandyn. Wykazano, że indukowany progesteronem napływ Ca2+ do plemników pośredniczy w chemotaksji w kierunku komórki jajowej9,18, kontroluj ruchliwość plemników19,20 i stymuluj reakcję akrosomów21. Wyzwolenie tych indywidualnych [Ca2+]i-regulowanych funkcji plemników we właściwej kolejności i we właściwym czasie jest kluczowe dla zapłodnienia komórki jajowej8. W związku z tym stwierdzono, że nieoptymalny napływ Ca2+ wywołany progesteronem wiąże się ze zmniejszoną płodnością mężczyzn22,23,24,25,26,27,28,29 i funkcjonalny CatSper jest niezbędny dla mężczyzn Fertility26,30,31,32,33,34,35,36.

Gdy plemniki docierają do komórki jajowej, musi zajść sekwencja zdarzeń, aby doszło do zapłodnienia: 1) Plemniki muszą przeniknąć do otaczającej warstwy komórek wzgórka, 2) związać się z osłonką przejrzystą, 3) egzocytoza zawartości akrosomalnej, tak zwana reakcja akrosomowa37, 4) przeniknąć do osłonki przejrzystej, i 5) połączyć się z błoną jajową, aby zakończyć zapłodnienie38. Aby móc przejść przez te etapy i zapłodnić komórkę jajową, plemnik musi najpierw przejść kapacytację11, która rozpoczyna się, gdy plemniki opuszczają płyn nasienny zawierający czynniki "dekapacytujące"39 i wpływają do płynów żeńskiego układu rozrodczego o wysokim poziomie wodorowęglanów i albuminy37. Kapacytacja sprawia, że plemniki są zdolne do hiperaktywacji, formy ruchliwości z energicznym uderzeniem wici i reakcją akrosomalną37. Hiperaktywna ruchliwość jest wymagana do penetracji strefy przejrzystej40, a akrosom zawiera różne enzymy hydrolityczne, które wspomagają ten proces penetracji41. Dodatkowo, reakcja akrosomowa sprawia, że plemniki są zdolne do łączenia się z komórką jajową poprzez odsłonięcie specyficznych białek błonowych na powierzchni plemnika, niezbędnych do fuzji plemnika z jajem42. W związku z tym zdolność do ulegania hiperaktywacji i reakcji akrosomowej jest wymagana do pomyślnego zapłodnienia jaja40,42. W przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano w przypadku plemników myszy43,44,45, tylko ludzkie plemniki, które są nienaruszone pod względem akrosomu, mogą wiązać się z osłoną przejrzystą46. Kiedy ludzkie plemniki są związane z osłonką przejrzystą, muszą przejść reakcję akrosomalną, zarówno w celu przeniknięcia do osłonki przejrzystej41, jak i w celu odsłonięcia specyficznych białek błonowych, które są potrzebne do fuzji z jajem38. Czas reakcji akrosomów w plemnikach ludzkich ma zatem kluczowe znaczenie dla zajścia zapłodnienia.

Jak opisano powyżej, sygnalizacja Ca2+ jest niezbędna dla prawidłowego funkcjonowania plemników8, a zatem bardzo interesujące jest możliwość badania dużej liczby związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2+ w ludzkich plemnikach. Podobnie, ponieważ tylko ludzkie plemniki, które przechodzą reakcję akrosomową we właściwym czasie i miejscu, mogą przeniknąć do osłonki przejrzystej i zapłodnić komórkę jajową46,47, bardzo interesująca jest również możliwość testowania związków pod kątem ich zdolności do wpływania na reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach. W tym celu opisano dwa średnioprzepustowe testy przesiewowe: 1) test wpływu na sygnalizację Ca2 + w ludzkich plemnikach oraz 2) test zdolności do indukowania reakcji akrosomów w plemnikach ludzkich.

Test 1 jest średnioprzepustowym testem sygnalizacyjnym Ca2+. Ta technika oparta na czytniku płytek fluorescencyjnych monitoruje zmiany fluorescencji w funkcji czasu jednocześnie w wielu studzienkach. Wrażliwy na Ca2+ barwnik fluorescencyjny, Fluo-4 ma Kd dla Ca2 + ≈ 335 nM i jest przenikany komórkowo w postaci estru AM (acetoksymetylowego). Za pomocą Fluo-4 można zmierzyć zmiany w [Ca2+]i w czasie i po dodaniu do plemników interesujących ich związków. Test został opracowany przez laboratorium Timo Strünkera w 2011 roku13 i od tego czasu został wykorzystany w kilku badaniach przesiewowych do badań przesiewowych związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2+ w ludzkim nasieniu1,2,3,4,5. Podobna metoda została również wykorzystana do przesiewania wielu kandydatów na leki48. Ponadto test ten jest również przydatny do oceny farmakologicznego sposobu działania1,2,3,4,5, krzywe dawka-odpowiedź1,2,3,4,5, Inhibicja rywalizacji1,2, additivity1,2, and synergism3 związków będących przedmiotem zainteresowania.

Test 2 to średnioprzepustowy test reakcji akrosomalnej. Ta technika oparta na cytometrze obrazowym mierzy ilość żywotnych plemników reagujących na akrosom w próbce przy użyciu trzech barwników fluorescencyjnych: jodku propidyny (PI), lektyny Pisum sativum sprzężonej z FITC (FITC-PSA) i Hoechst-33342. Test został zmodyfikowany na podstawie podobnej metody opartej na cytometrii przepływowej przez Zoppino et al.49 i był używany w kilku badaniach6,7. Jeśli chodzi o test sygnalizacji Ca2 +, ten test reakcji akrosomów można również wykorzystać do oceny krzywych dawka-odpowiedź, hamowania, addytywności i synergizmu interesujących związków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie i analiza próbek ludzkiego nasienia w protokołach jest zgodna z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Regionu Stołecznego Danii. Wszystkie próbki nasienia zostały pobrane po uzyskaniu świadomej zgody od dawców-ochotników. Po dostarczeniu próbki zostały w pełni zanonimizowane. Za niedogodności każdy dawca otrzymał opłatę w wysokości 500 DKK (około 75 dolarów amerykańskich) za próbkę. Próbki poddano analizie w dniu dostawy, a następnie zniszczono je natychmiast po przeprowadzeniu eksperymentów laboratoryjnych.

UWAGA: Test sygnalizacji Ca2+ o średniej przepustowości jest opisany w krokach 4-5, a test reakcji akrosomów o średniej przepustowości w krokach 6-7. Protokół przygotowania pożywki z płynu z jajowodów ludzkich (HTF+) opisano w kroku 1, a oczyszczanie plemników do testów opisano w krokach 2-3.

1. Przygotowanie płynu z ludzkich jajowodów (HTF+) Medium

UWAGA: Użyj kolb miarowych o odpowiednich rozmiarach, cylindra miarowego o pojemności 1 l, mieszadła magnetycznego, soli wymienionych w Tabeli 1 i Tabeli 2, oczyszczonej wody, filtra porów 0,2 μm i plastikowych probówek o pojemności 50 ml.

  1. Przygotować roztwory podstawowe soli w oczyszczonej wodzie (Tabela 1).
    1. Dodać ilość soli wymienioną w tabeli 1 do kolby miarowej o odpowiedniej wielkości, dodać oczyszczoną wodę do ilości nieco poniżej pożądanej objętości i dobrze wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.
    2. Gdy sól całkowicie się rozpuści, wyjmij magnes i napełnij oczyszczoną wodą do pożądanej końcowej objętości.
  2. Przenieść roztwór podstawowy do butelki i przechowywać do użycia.
    nuta: Roztwory podstawowe mogą być przechowywane i ponownie używane przez dłuższy czas: glukoza i HEPES w temperaturze -20 °C, a pozostałe roztwory podstawowe w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Przygotować 1 l pożywki HTF+ z roztworów podstawowych (Tabela 2).
    1. Przed użyciem upewnić się, że wszystkie roztwory podstawowe są całkowicie rozpuszczone i dobrze wymieszane.
    2. Dodać ilość roztworu podstawowego i soli wymienioną w tabeli 2 do cylindra miarowego o pojemności 1 litra i dodać oczyszczoną wodę do 900 ml.
    3. Dobrze wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego i dostosować pH do 7,35 za pomocą roztworu NaOH.
    4. Zdejmij magnes i dodaj oczyszczoną wodę do 1,000 ml.
  4. Sterylną pożywkę HTF+ przefiltrować przez filtr porowy 0,2 μm, podaszkę HTF+ do 50 ml plastikowych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  5. Tuż przed przeprowadzeniem eksperymentu dodaj 165 μl na-pirogronianu do 50 ml podwielokrotności, aby uzyskać końcowe stężenie Na-pirogronianu 0,33 mM.
    nuta: Podłoże z płynem z jajowodów można również uzyskać od różnych dostawców komercyjnych. W przypadku stosowania pożywki 4 mM HCO3-, próbki mogą być inkubowane z zamkniętymi pokrywkami w inkubatorze bez dodatkowego CO2 w powietrzu bez dużych wahań pH. Jeżeli dostępny jest inkubator CO2 , odpowiednią ilość CO2 można obliczyć za pomocą równania Hendersona-Hasselbalcha i zastosować. W przypadku stosowania pożywki o stężeniu 25 mMHCO 3 próbki należy inkubować z otwartymi pokrywkami w inkubatorze CO2 z powietrzem zawierającym odpowiednią ilość CO2 (w zależności od ciśnienia atmosferycznego, zwykle między 5-10%), aby uniknąć dryftu pH. Dokładna ilość CO2 może być obliczona za pomocą równania Hendersona-Hasselbalcha.

2. Oczyszczanie ruchomych plemników za pomocą Swim-up (Rysunek 1)

UWAGA: Użyj czystego plastikowego pojemnika z szerokim otworem na próbkę nasienia, inkubatora, plastikowych probówek o pojemności 50 ml, stojaka do umieszczenia 50 ml plastikowych probówek pod kątem 45°, podłoża HTF+ (przygotowanego w kroku 1 lub uzyskanego od komercyjnego dostawcy), wirówki i albuminy surowicy ludzkiej (HSA).

  1. Uzyskaj świeżo oddaną próbkę ludzkiego nasienia pobraną w wyniku masturbacji i wytryskującą do czystego plastikowego pojemnika z szerokimi ustami. Używaj wyłącznie próbek nasienia, które spełniają parametry określone w podręczniku laboratoryjnym WHO do badania i przetwarzania nasienia ludzkiego.
  2. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 15–30 minut, aby umożliwić jej upłynnienie.
  3. Podgrzej 50 ml pożywki HTF+ z 4 mM HCO 3- do 37 °C.
  4. Umieść czyste plastikowe probówki o pojemności 50 ml w stojaku pod kątem 45° (aby zwiększyć powierzchnię między płynami). Użyj 1 probówki na ml surowego nasienia.
  5. Dodać 4 ml podgrzanej pożywki HTF+ do każdej z probówek.
  6. Ostrożnie odpipetować 1 ml próbki skroplonego nasienia na dno każdej probówki zawierającej 4 ml podgrzanego HTF+. Unikaj uwalniania pęcherzyków powietrza.
  7. Zamknąć pokrywki i inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Delikatnie odessać i przenieść jak najwięcej górnej frakcji (HTF+ z ruchliwymi plemnikami) do nowej plastikowej probówki o pojemności 15 ml, zwracając uwagę, aby nic z dolnej frakcji (nasienie z nieruchomymi i martwymi komórkami) nie zostało uwzględnione. Ogólnie rzecz biorąc, można bezpiecznie przenieść 3,5 ml górnej frakcji, nie naruszając dolnej frakcji. Aby uniknąć turbulencji ssania, odetnij najbardziej zewnętrzną 1-2 mm końcówkę pipety pod kątem 45°, aby uzyskać większy otwór.
  9. Napełnij plastikową probówkę o pojemności 15 ml HTF+, aby umyć komórki i odwirować probówkę o sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Delikatnie odessać i usunąć supernatant oraz ponownie zawiesić osad plemników w 2 ml HTF+.
  11. Przenieś 20 μl zawiesiny nasienia do dwóch małych plastikowych probówek w celu oceny stężenia plemników (patrz krok 3).
  12. Napełnij plastikową probówkę o pojemności 15 ml HTF+, aby umyć komórki i odwirować probówkę o sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Delikatnie odessać i usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad plemników do 10 x 106 komórek/ml (w oparciu o stężenie komórek ocenione w kroku 2.11).
    1. Do eksperymentów z wykorzystaniem plemników bez uzdolnienia (rutynowy test sygnalizacjiCa2+)
      1. Zawieś ogniwa w HTF+ za pomocą 4 mM HCO3-.
      2. Dodać 30 μl albuminy surowicy ludzkiej (HSA) (100 mg/ml) na ml HTF+, aby uzyskać końcowe stężenie 3 mg/ml.
      3. Zamknąć pokrywki i inkubować przez ≥1 h w temperaturze 37 °C.
    2. Do eksperymentów z wykorzystaniem zpojemnościowych plemników (test reakcji akrosomowej)
      1. Zawieś ogniwa w HTF+ za pomocą 25 mM HCO3-.
      2. Dodać 30 μl HSA (100 mg/mL) na ml HTF+, aby uzyskać końcowe stężenie 3 mg/mL.
      3. Luźno przykryć pokrywki i inkubować przez ≥3 godziny w temperaturze 37 °C z odpowiednią ilością CO2 (patrz krok 1, zwykle między 5 a 10 % CO2 ).

3. Liczenie plemników

UWAGA: Plemniki mogą być liczone ręcznie50 lub za pomocą cytometru obrazowego51, jak opisano tutaj. Użyj cytometru obrazowego, wirownika, bufora S100, kasety SP1, oczyszczonych plemników (przygotowanych w kroku 2).

  1. Rozcieńczyć podwielokrotność 20 μl do współczynnika 10, 20, 30, 50 lub 90 w buforze S100 za pomocą probówki o okrągłym dnie 2 ml zgodnie z oczekiwanym stężeniem (ocenianym przez ręczną kontrolę osadu w kroku 2.10). Stosować rozcieńczenie, które jest najbliższe oczekiwanemu stężeniu (tj. jeśli spodziewane jest stężenie 15 x 106 plemników na ml po kąpieli, należy rozcieńczyć próbkę plemników o objętości 20 μl 380 μl buforu S100 [współczynnik rozcieńczenia 20]).
  2. Dobrze mieszać przez 10 s za pomocą mieszalnika wirowego przy maksymalnej prędkości 700 obr./min, zanurzyć kasetę SP1 w próbce i całkowicie docisnąć biały tłok, aby zassać porcję próbki do kasety.
  3. Otwórz cytometr obrazowy, umieść kasetę w tacy i uruchom test Count of PI Stained Human Sperm Cells Test zgodnie z zastosowanym współczynnikiem rozcieńczenia (wybranym w kroku 3.1).
  4. Powtórzyć krok 3.1-3.3 z kolejną próbką o objętości 20 μl, stosując współczynnik rozcieńczenia najbliższy zmierzonemu stężeniu uzyskanemu z pierwszych 20 μl próbki.
  5. Oblicz średnie stężenie plemników na podstawie dwóch pomiarów.
  6. Pomnóż średnie stężenie plemników przez pierwotną objętość, aby uzyskać całkowitą liczbę plemników (w kroku 2 ta pierwotna objętość wynosi 2 ml).

4. Pomiar zmian w swobodnym wewnątrzkomórkowym stężeniu Ca2+ ([Ca2+]i) za pomocą fluorymetrii Ca2+ (Rysunek 2)

UWAGA: Użyj czytnika płytek fluorescencyjnych, 384 płytek wielodołkowych, Fluo-4 AM, oczyszczonych plemników (przygotowanych w kroku 2), interesujących nas związków, a także kontroli pozytywnych i negatywnych, automatycznej pipety powtarzalnej i pipety 12-kanałowej.

  1. Przygotować 2 mM Fluo-4 AM, dodając 22,7 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do fiolki z 50 μg Fluo-4 AM i dobrze wymieszać probówkę.
  2. Dodaj podwielokrotność 700 μl zawiesiny nasienia odzyskanego z pływania (zpojemnościonej lub nieuzdolnionej, jak opisano w kroku 2) do nowej probówki. 700 μl próbki nasienia to ilość potrzebna do analizy jednego rzędu 24 dołków w płytce 384-mikrodołkowej (używanej do testowania 3 kontrolnych i 9 związków w dubletach).
  3. Dodać 3,5 μl roztworu podstawowego Fluo-4 AM do 700 μL zawiesiny nasienia, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM Fluo-4 AM.
  4. Inkubować próbkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc ją przed światłem.
  5. Odwirować próbkę o masie 700 x g przez 10 minut, odessać i odrzucić supernatant w celu usunięcia nadmiaru Fluo-4.
  6. Zawiesić barwiony osad w HTF+ do 5 x 106 komórek/ml (tj. użyć 2x objętości zawiesiny komórek pobranej w kroku 4.2)
  7. Przygotować rozcieńczenia związków i próby kontrolne (można to zrobić w okresie inkubacji i wirowania odpowiednio w kroku 4.4 i 4.5).
    1. Rozcieńczone związki, a także kontrola ujemna (bufor z nośnikiem) i kontrola pozytywna (progesteron) w HTF+. Rozcieńczyć związki i kontrole do 3-krotności pożądanego stężenia końcowego, tak jak są one rozcieńczane w stosunku 1:3 po dodaniu do plemników w kroku 4.16.
    2. Umieścić probówki z rozcieńczeniami w stojaku z odległością między probówkami odpowiadającą odległości między końcówkami pipet 12-kanałowej użytej w kroku 4.16.
  8. Użyj automatycznej pipety powtarzalnej (24 kroki po 50 μl).
    1. Delikatnie wymieszaj barwioną próbkę nasienia Fluo-4, pipetując całą ilość raz w górę iw dół.
    2. Dodać podwielokrotności po 50 μl do 24 dołków w rzędzie na płytce 384-dołkowej.
  9. Umieścić płytkę mikrodołkową w czytniku płytek fluorescencyjnych w temperaturze 30 °C i zamknąć szufladę.
  10. Wybierz odpowiedni protokół dla Fluo-4. Wzbudzić fluorescencję przy 480 nm i rekordową emisję przy 520 nm. Użyj najkrótszego możliwego czasu cyklu przy ustawieniu.
    nuta: Jeśli to możliwe, użyj co najmniej 10 lamp błyskowych na studzienkę i dolną optykę.
  11. Wybierz dołek w rzędzie i dostosuj wzmocnienie do wartości docelowej 20%.
  12. Rozpocznij pomiar.
  13. Kontroluj linię bazową podczas pierwszych 5 cykli.
    1. Jeśli odczyt fluorescencyjny rośnie lub maleje w czasie, przerwij eksperyment, ponownie wyreguluj wzmocnienie i rozpocznij eksperyment od nowa.
    2. Jeśli linia podstawowa różni się znacznie między poszczególnymi studzienkami z rzędu, oznacza to, że pipetowanie w kroku 4.8 było nieprecyzyjne lub próbka nie została wystarczająco dobrze wymieszana przed pipetowaniem. Odrzuć eksperyment.
    3. Jeśli odczyt fluorescencyjny jest porównywalny między studzienkami w rzędzie i stały podczas pierwszych 5 cykli, przejdź do następnego kroku.
  14. Po 10 cyklach (używanych jako wartość wyjściowa) przerwij eksperyment.
  15. Wysuń szufladę z płytką mikrodołkową.
  16. Za pomocą pipety 12-kanałowej (2 etapy po 25 μl) szybko dodaj 25 μl przygotowanych roztworów związków i kontroli (od kroku 4.7) do 12 duplikatów dołków (24 dołki) w rzędzie. Roztwory zostaną rozcieńczone w stosunku 1:3, ponieważ studzienki zawierają już 50 μl barwionej próbki nasienia.
  17. Kontynuuj pomiar tak szybko, jak to możliwe (szuflada zamknie się automatycznie), aby uniknąć przegapienia sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez dodane związki i kontrole. Zmiany fluorescencji (ΔF) po dodaniu związków i kontroli będą teraz rejestrowane.
  18. Przeprowadzaj eksperyment do momentu, gdy zostaną zarejestrowane sygnały fluorescencyjne z kontroli pozytywnej i związków będących przedmiotem zainteresowania.
  19. Przerwij eksperyment i wyeksportuj surowe dane fluorescencji, aby je przeanalizować, jak w kroku 5.
    nuta: Ogólnie rzecz biorąc, Fluo-4 AM był używany jako fluorofor wrażliwy na Ca2 + w teście, ale inne fluorofory wrażliwe na Ca2 + mogą być również używane, jeśli widma wzbudzenia i emisji pasują do filtrów w czytniku płytek fluorescencyjnych. W zależności od wyboru fluoroforu, upewnij się, że poziom wzmocnienia jest ustawiony na "bezpiecznym" poziomie, na którym indukowane piki fluorescencyjne mieszczą się w zakresie pomiarowym przyrządu. Można to przetestować, dodając jonomycynę do pojedynczego dołka przy określonym ustawieniu wzmocnienia. Jeśli wywołało to sygnał fluorescencyjny powyżej progu, zmniejsz wzmocnienie i spróbuj ponownie. Niektórzy używają Pluronic F-127 do wspomagania ładowania Fluo-41,13, ale stwierdzono, że nie jest to konieczne2. Maksymalna liczba rzędów mierzonych jednocześnie zależy od dwóch czynników. 1) Czas cyklu przyrządu: Jeśli czas cyklu jest zbyt długi, indukowane piki w [Ca2 +] i mogą zostać pominięte. Zmierz maksymalnie dwa rzędy jednocześnie, aby utrzymać krótki czas cyklu; 2) Szybkość pipetowania w kroku 4.16: Za pomocą pipety 12-kanałowej można szybko dodać 12 różnych roztworów do 12 zduplikowanych dołków (24 dołków) w 1 lub 2 rzędach (np. jeden rząd wstępnie inkubowany z nośnikiem i jeden rząd wstępnie inkubowany z inhibitorem), nie tracąc indukowanych pików Ca2+. Nie zaleca się jednak dodawania 24 różnych roztworów do dwóch rzędów w celu jednoczesnego pomiaru, ponieważ końcówki pipetujące będą musiały zostać wymienione pomiędzy dwoma sekwencyjnymi etapami pipetowania, w wyniku czego indukowane piki Ca2+ mogą zostać pominięte.

5. Analiza danych z fluorymetrii Ca2+

  1. Otwórz surowe dane fluorescencji uzyskane i wyeksportowane w kroku 4.
  2. Oblicz średnią ze zduplikowanych studni. Jeśli istnieją duże różnice między duplikatami, odrzuć dane z określonych studni.
  3. Zdefiniuj linię bazową jako 10 pierwszych cykli.
  4. Obliczyć ΔF/F0 (%) jako procentową zmianę fluorescencji (ΔF) w czasie po dodaniu związków i kontroli w odniesieniu do średniej fluorescencji podstawowej (F0) podczas 10 pierwszych cykli (linia podstawowa).
  5. W przypadku wykorzystywania danych do generowania krzywych dawka-odpowiedź, należy odjąć odczyt kontroli ujemnej z innych studzienek, aby usunąć artefakty pipetowania.

6. Pomiar reakcji akrosomowej

UWAGA: Użyj cytometru obrazowego, inkubatora, barwników fluorescencyjnych: PI, FITC-PSA i Hoechst-33342, interesujących związków oraz kontroli pozytywnych i negatywnych, roztworu unieruchamiającego zawierającego 0,6 M NaHCO3 i 0,37% (v/v) formaldehydu w wodzie destylowanej, szkiełka A2 i oczyszczonych plemników o pojemności (przygotowanych w kroku 2).

  1. Przygotować roztwór barwiący zawierający PI (5 μg/mL), FITC-PSA (50 μg/mL) i Hoechst-33342 (100 μg/mL) w HTF+, dobrze wymieszać za pomocą mieszadła wirowego i chronić przed światłem do czasu użycia.
  2. Przygotować roztwory związków i roztwory kontrolne o stężeniu 10-krotnym od pożądanego stężenia końcowego, rozcieńczając je w stosunku 1:10 w kroku 6.5. Należy zawsze uwzględnić kontrolę ujemną (nośnik) i dwie kontrole dodatnie: stężenie końcowe progesteronu 10 μM i stężenie końcowe jonomycyny 2 μM.
  3. Przenieś porcje 240 μl zpojemnościonych plemników (przygotowanych w kroku 2) do plastikowych probówek.
  4. Do każdej probówki dodać 30 μl roztworu barwiącyego. Końcowe stężenie barwników wynosi: 0,5 μg/ml PI, 5 μg/mL FITC-PSA, i 10 μg/ml Hoechst-33342.
  5. Do każdej probówki dodać 30 μl roztworów z kontrolami lub związkami (rozcieńczenie 1:10).
  6. Próbki należy delikatnie wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół lub delikatnie wirując. Ze względu na naprężenia mechaniczne należy unikać nadmiernego mieszania.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  8. Przygotować nowe probówki z tworzywa sztucznego zawierające 100 μl roztworu unieruchamiającego zawierającego 0,6 MNaHCO3 i 0,37% (v/v) formaldehydu w wodzie destylowanej, po jednej na probówkę.
  9. Po inkubacji dobrze wymieszać próbki przez pipetowanie i dodać 50 μl badanej próbki do probówki ze 100 μl roztworu unieruchamiającego.
  10. Przed załadowaniem komór szkiełka A2 należy dobrze wymieszać próbkę przez pipetowanie. Ostrożnie napełnić komory około 30 μl, nie tworząc pęcherzyków powietrza.
    nuta: Podczas inkubacji ruchliwe plemniki mają tendencję do agregacji. Skupiska komórek mogą zakłócać pomiary (nawet jeśli są wykluczone). Dlatego bardzo ważne jest dokładne wymieszanie przez pipetowanie po inkubacji. Podobnie pęcherzyki powietrza w komorach mogą zakłócać pomiary. Dlatego należy powoli napełniać komorę i zmieniać kąt nachylenia pipety, jeśli krawędzie cieczy mają się spotkać i utworzyć pęcherzyk powietrza.
  11. Umieść załadowany szkiełko na tacy cytometru obrazowego i zamknij tacę.
  12. Wybierz protokół FlexiCyte i naciśnij Uruchom.
    1. Wybierz następujące ustawienia protokołu FlexiCyte: Liczba kanałów analitycznych: 2; Kanał maskujący: UV (LED365), Jest to kanał używany do segmentacji obrazu; Kanał 1: niebieski (LED475), czas naświetlania 3 000 ms, filtr emisyjny 560/35; Kanał 2: zielony (LED530), czas naświetlania 500 ms, filtr emisyjny 675/75; Minimalna liczba analizowanych komórek: 5000; Wyklucz zagregowane komórki: Tak.
  13. Powtarzać kroki 6.9-6.12, aż wszystkie próbki zostaną zmierzone.

7. Analiza danych z cytometrii obrazowej

  1. Otwórz dane uzyskane w kroku 6.
  2. Utwórz dwa poniższe wykresy, aby ocenić pomiary.
    1. Utwórz wykres punktowy intensywności Hoechst-33342 w funkcji obszaru Hoechst-33342 w skalach dwuwykładniczych. Ten wykres może być wykorzystany do wykluczenia obiektów dodatnich Hoechst-33342, które są albo zbyt małe, albo zbyt duże, aby mogły być ludzkimi plemnikami.
    2. Utwórz wykres punktowy intensywności FITC-PSA i intensywności PI w skalach dwuwykładniczych. Wykres ten można wykorzystać do oceny ilości plemników reagujących na akrosom za pomocą bramki kwadrantowej, która oddziela cztery grupy na wykresie (Rysunek 3): 1) grupa PI dodatnia i FITC-PSA dodatnia: Niezdolne do życia plemniki reagujące na akrosom; 2) grupa PI ujemna i FITC-PSA dodatnia: Acrosome reagowały żywotne plemniki; 3) grupa PI dodatnia i FITC-PSA ujemna: nienaruszone niezdolne do życia plemniki Acrosome; oraz 4) grupa PI ujemna i FITC-PSA ujemna: nienaruszone żywotne plemniki Acrosome.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki eksperymentu testującego wpływ 4 związków (A, B, C i D) wraz z kontrolą pozytywną (progesteron) i ujemną (bufor) na [Ca2+]i w nasieniu ludzkim przy użyciu średnioprzepustowego testu sygnalizacji Ca2+ można zobaczyć w Rysunek 4a. W Rysunek 4b, pokazana jest krzywa odpowiedzi na dawkę progesteronu, która została uzyskana z danych szczytowych ΔF/F0 (%) indukowanych przez ser...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test sygnalizacji Ca2 + o średniej przepustowości opiera się na pomiarach fluorescencji z pojedynczych mikrostudzienek, z których każda zawiera około 250 000 plemników. Przechwycony sygnał jest uśredniany ze wszystkich pojedynczych plemników w studzience. Test nie dostarcza zatem żadnych informacji przestrzennych na temat tego, gdzie konkretnie w plemniku [Ca2+]i jest zmieniany, w jak dużym odsetku plemników zachodzi zmiana w [Ca2+]i lub jak niejednorodna jest odpowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować laboratorium Timo Strünkera za nadzór nad AR i DLE podczas ich pobytu w jego laboratorium. Ponadto chcielibyśmy podziękować naszym kolegom z Oddziału Wzrostu i Rozrodu Szpitala Uniwersyteckiego w Kopenhadze, Rigshospitalet za pomoc w przygotowaniu tych dwóch testów. Projekt ten był wspierany przez Duńską Agencję Ochrony Środowiska jako projekt w ramach Centrum ds. Substancji Zaburzających Funkcjonowanie Układu Hormonalnego oraz poprzez dotacje z Funduszu Innowacyjnego Danii (granty o numerach 005-2010-3 i 14-2013-4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtr porowyThermo Fisher Scientific, USA296-4545
Cylinder miarowy 1 LThermo Fisher Scientific, USA3662-1000
1, 4 i 2 ml probówki plastikoweEppendorf, Niemcy30120086 i 0030120094
pipeta 12-kanałowaEppendorf, Niemcy4861000813
384 płytki wielodołkoweGreiner Bio-One, Niemcy781096
Probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 15 i 50 mlEppendorf, Niemcy0030122151 i 30122178
Suwak A2ChemoMetec, Dania942-0001
Automatyczna pipeta powtarzalnaEppendorf, Niemcy4987000010
Wirówka
CaCl2
Czysta, z szerokim otworem plastikowy pojemnik na próbkę
Dimetylosulfotlenek (DMSO)
Lektyna Pisum sativum sprzężona z FITC (FITC-PSA)Sigma-Aldrich, NiemcyL0770
Fluo-4 AMThermo Fisher Scientific, USAF14201
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych FLUOstar OMEGABMG Labtech, Niemcy
Glukoza
HEPES
Hoechst-33342ChemoMetec, Dania910-3015
Albumina surowicy ludzkiej (HSA)Irvine Scientific9988Do dodania do HTF+
Roztwór unieruchamiający zawierający 0,6 M NaHCO3 i 0,37% (v/v) formaldehydu w wodzie
destylowanejInkubator
KCl
KH2PO4
Mieszadło
MgSO4Na-mleczan
NaCl
NaHCO3
NC-3000ChemoMetec, Dania970-3003
Pipety i końcówki
jodku propidyny (PI)ChemoMetec, Dania910-3002
wodę
do umieszczania plastikowych probówek o pojemności 50 ml pod kątem
Bufor S100ChemoMetec, Dania910-0101
SP1-kasetaChemoMetec, Dania941-0006
Kolby miarowe o odpowiednich rozmiarach
Vortexer
nasieniabezwodnamagnetycznedo pipetowania Stojak na oczyszczoną 45 stopni

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40(2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344(2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza sygnalizacji wapniowejAnaliza reakcji akrosomalnejAnaliza fluorescencyjnaAnaliza cytometryczna obrazowaKrzywe zale no ci dawka odpowiedHamowanie konkurencyjneInhibitory kana w CatSperFunkcje kom rek plemnik w

Powiązane artykuły