Artykuł metodologiczny

Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 kwietnia 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy prostą technikę cytogenetyczną z użyciem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do określenia wskaźnika zapłodnienia i pierwotnego stosunku płci haplodifidowego szkodnika inwazyjnego Bemisia tabaci.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka gatunków mączlików wysysających soki to jedne z najbardziej szkodliwych szkodników lądowych na świecie ze względu na szkody w uprawach, które wyrządzają i wirusy roślinne, które przenoszą. Pomimo licznych badań nad biologią tych gatunków w różnych środowiskach, kluczowy parametr historii życia, stosunek płci potomstwa, nie cieszy się dużym zainteresowaniem, a jest ważny dla przewidywania dynamiki populacji. Pierwotny stosunek płci (stosunek płci przy składaniu jaj) Bemisia tabaci nigdy nie został opisany, ale można go znaleźć, określając szybkość zapłodnienia jaj tego haploidalnego owada. Technika ta obejmuje dechorionację jaj za pomocą wybielacza, szereg etapów utrwalania i zastosowanie ogólnego barwienia fluorescencyjnego DNA, DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol, barwnik fluorescencyjny wiążący DNA), w celu związania się z żeńskimi i męskimi przedjądrzami. W tym miejscu przedstawiamy technikę i przykład jej zastosowania do sprawdzenia, czy endosymbiotyczna bakteria Rickettsia sp. nr. bellii, wpłynęły na pierwszorzędowy stosunek płci B. tabaci. Metoda ta może pomóc w badaniach populacyjnych mączlików lub w ustaleniu, czy istnieje przypisanie płci do pewnych bodźców środowiskowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie alokacji płci, czyli względnego inwestowania w potomstwo płci męskiej i żeńskiej, jest kamieniem węgielnym ekologii behawioralnej1,2,3. Oprócz możliwości testowania adaptacyjnych modeli zachowań, znajomość strategii alokacji płci organizmu może poprawić modele dynamiki jego populacji. U wielu gatunków przypisanie płci jest kontrolowane przez matki. Aby określić przydział płci, ważne jest określenie pierwotnego stosunku płci lub proporcji samic w momencie składania jaj. Chociaż stosunek płci w momencie pojawienia się dorosłego osobnika może dostarczyć wskazówek co do alokacji płci, zróżnicowana śmiertelność rozwojowa między młodymi samcami i samicami może często znacznie zniekształcić stosunek płci dorosłej. U niektórych gatunków błonkoskrzydłych, rzędu owadów obejmującego mrówki, pszczoły i osy, pierwszorzędowy stosunek płci został określony za pomocą testów cytogenetycznych, barwiących zarodki w celu wyświetlenia genetycznego DNA. Ponieważ błonkoskrzydłe są haplodiploidalne, początkowe jajo męskie jest haploidalne i zawiera tylko żeńskie przedjądrze (n), podczas gdy początkowe jaja żeńskie są diploidalne i zawierają zarówno męskie, jak i żeńskie przedjądrza (2n). Chociaż Aleyrodidae, żywiąca się sokami rodzina prawdziwych owadów (Hemiptera) znanych jako mączliki, jest również haplodiploidalna, nie ma ustalonego testu, aby znaleźć pierwotny stosunek płci u tych owadów. Jest to być może zaskakujące, biorąc pod uwagę intensywność badań nad kilkoma kosmopolitycznymi poważnymi szkodnikami z tej rodziny oraz znaczenie proporcji płci w konkurencyjnych interakcjach mączlików4,5,6,7,8,9,10 i ogólnie w dynamice populacji. Również u owadów haploidalnych proporcje płci nie są ograniczone przez systemy determinacji płci, co pozwala na selektywne zapłodnienie i labilne proporcje płci, które różnią się w zależności od środowiska2. W tym miejscu przedstawiamy technikę określania pierwotnego stosunku płci kompleksu gatunków mączlików znanego zbiorczo jako mączlik ziemniaczany, B. tabaci. Ta jedna nazwa gatunku obejmuje ponad 28 gatunków na całym świecie11i obejmuje niektóre z najbardziej szkodliwych globalnych szkodników inwazyjnych12,13. Zastosowanie tej techniki do określenia wzorców alokacji płci u B. tabaci i innych Aleyrodidae pozwoli na bardziej rygorystyczne badanie zmiennych, w tym temperatury, rośliny żywicielskiej, bakterii endosymbiotycznych lub patogenów roślin/mączlików, które mogą wpływać na pierwotne proporcje płci mączlika i dynamikę populacji mączlików.

Nie znamy żadnych porównywalnych technik barwienia jaj dla B. tabaci. Protokół jest wygodny w porównaniu z metodami barwienia stosowanymi do innych jaj owadów14, ponieważ pomija etap utrwalania przez noc, a zatem może być zakończony w ciągu 3 godzin. Jednym z przykładów zastosowania jest endosymbiotyczna bakteria Rickettsia sp. nr. bellii, jest związany z uprzedzeniami żeńskimi w naszych liniach laboratoryjnych B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1)15,16. W jednej linii laboratoryjnej B. tabaci MEAM1 ("MAC1", pobranej z Centrum Rolniczego Maricopa) sprawdzamy, czy samice zakażone riketsją (R+) zapładniają więcej jaj niż samice niezakażone (R-).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie prace są wykonywane w temperaturze pokojowej, w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Wszystkie "krople" w tym protokole są zdefiniowane jako 5–20 μl, w zależności od preferencji operatora.

1. Wstępna konfiguracja

  1. Pozwól samicom mączlików złożyć jaja na czystych liściach. Przykładami aren do składania jaj są klatki z klipsami lub liście przycięte tak, aby pasowały do agatora na szalce Petriego. Zrób zakrywany otwór w klatce z klipsem lub pokrywie szalki Petriego, aby wkładać i wyjmować dorosłe osobniki. Alternatywnie, szybko umieść naczynie z zebranymi dorosłymi osobnikami na lodzie, a następnie umieść je na liściu. Ogranicz czas między złożeniem jaj a utrwaleniem komórki jajowej do nie więcej niż 60 minut, aby zapewnić obserwację przejścia plemników do ojcowskiego przedjądrza w komórkach jajowych.
    nuta: Jaja, które nie zostały usunięte z liścia, mogą być hodowane do dorosłości, aby zarejestrować proporcje płci dorosłej.
  2. Przed lub w trakcie składania jaj mączlika przygotuj szkiełko mikroskopowe, czyszcząc je wodą z mydłem, dobrze wysuszając, a następnie rozciągając kawałek filmu parafinowego na jednym końcu, upewniając się, że powierzchnia filmu parafinowego nie pęka (Rysunek 1).
    nuta: Film parafinowy jest hydrofobowy i półprzezroczysty, dzięki czemu płyny tworzą krople, a jaja są lepiej widoczne.

2. Dechorionacja

  1. Za pomocą szklanej pipety Pasteura dodaj krople roztworu wybielacza (0,83% podchlorynu sodu) do filmu parafinowego.
    nuta: Łatwiej jest śledzić jaja, jeśli w każdej kropli znajdują się tylko 2-3 jaja. Alternatywnie, aby poradzić sobie z dużą liczbą jaj, zbierz jaja w kroplach 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    ostrożność: Wybielacz jest; Podczas obchodzenia się z wybielaczem należy nosić rękawice i nie wdychać.
  2. Usuń dorosłe mączliki z liścia.
  3. Umieść liść pod mikroskopem, aby wyraźnie zobaczyć jaja i zbieraj jaja pojedynczo i ostrożnie za pomocą cienkiej sondy. Aby wykonać sondę, włóż maleńki trzpień nadel pod kątem 45° lub pod wygodnym kątem roboczym do stopionej końcówki pipety (Rysunek 2).
  4. Przenieś jajka do wybielacza lub 1x PBS. Jeśli używasz 1x PBS, usuń 1x PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura po zebraniu wszystkich jaj, a następnie dodaj wybielacz do jaj.
    nuta: Podczas zbierania jaj powoli podnoś jajko z podstawy, aż szypułka zostanie usunięta z liścia. Szypułka jest lepka, a jajko zwykle przykleja się do końcówki sondy, dopóki nie zostanie zanurzone w wybielaczu.
    UWAGA: Zaleca się używanie oddzielnych szklanych pipet Pasteura do wszystkich odczynników, a pipety mogą być modyfikowane pod wpływem ciepła, aby zwęzić końcówki i zmniejszyć ryzyko przypadkowego zassania jaj mączlika. Aby zapobiec pozostałościom i zanieczyszczeniom, po każdym użyciu należy czyścić pipety wodą dejonizowaną.
  5. Odczekaj 10 min. Jeśli istnieje zainteresowanie embriogenezą w jajach starszych niż 1 godzina, pozostaw jaja w wybielaczu do 15 minut.
    nuta: W przypadku jaj, które mają do 1 godziny, wystarczy 10 minut.

3. Fiksacja

UWAGA: Te kroki są zaczerpnięte z protokołu błonkoskrzydłych17.

  1. Usuń wybielacz (zawierający fragmenty kosmówki) szklaną pipetą Pasteura i wyrzuć go. Dodać krople lodowatego kwasu octowego za pomocą szklanej pipety Pasteura i odczekać 3 min.
    ostrożność: Wykonaj ten krok pod wyciągiem. Lodowaty kwas octowy jest; Podczas pracy z lodowatym kwasem octowym należy nosić rękawice i nie wdychać, zwłaszcza w połączeniu z resztkami wybielacza.
  2. Usunąć lodowaty kwas octowy szklaną pipetą Pasteura i dodać krople roztworu Clarke'a (3:1 absolutnego etanolu: lodowaty kwas octowy) za pomocą szklanej pipety Pasteura. Poczekaj, aż większość roztworu wyparuje (lub maksymalnie 10 minut).
  3. Dodaj krople 70% etanolu do jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura i poczekaj, aż większość etanolu wyparuje (lub maksymalnie 10 minut).

4. Barwienie

  1. Usuń resztki etanolu za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodaj krople 1x PBS do jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby uzyskać pH zbliżone do 7,0. Umieść szkiełko mikroskopowe w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysuszeniu, na przykład w pustym pudełku z końcówkami do pipet z mokrym ręcznikiem papierowym w środku (Rysunek 3). Odczekaj co najmniej 30 min.
    nuta: Jest to najlepszy moment, jeśli potrzebna jest przerwa, o ile komora wilgotnościowa może zapobiec wysuszeniu.
  2. Usuń 1x PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodaj krople 0,1 μg/mL DAPI, barwienia fluorescencyjnego DNA, za pomocą szklanej pipety Pasteura. Umieść szkiełko mikroskopowe w ciemnej komorze wilgotnościowej i odczekaj co najmniej 15 min.
    ostrożność: DAPI jest środkiem drażniącym, więc należy obchodzić się z nim w rękawiczkach.

5. Mycie

  1. Wyjmij DAPI za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  2. Dodaj krople 1x TBST (5x roztwór sporządzony z 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 ml polisorbatu 20 i 1,0 g NaN3 [pH 7,5] i doprowadź do 1 l wodą klasy PCR) do jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura. Odczekaj 5 minut przed wyjęciem 1x TBST za pomocą szklanej pipety Pasteura. Powtórz ten krok 2 razy.

6. Montaż

  1. Po ostatnim umyciu ostrożnie odpipetować wszystkie jaja z filmu parafinowego na czystą część szkiełka mikroskopowego. Usuń nadmiar 1x TBST; następnie dodaj 20 μl podłoża montażowego (80% glicerolu i 20% 1x TBST z 2% galusanu n-propylu) i umieść czyste szkiełko przykrywające na wierzchu jaj
    2. .
  2. W celu długotrwałego przechowywania należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci, a następnie przechowywać szkiełko w ciemności w temperaturze 2 °C lub natychmiast obejrzeć je pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby sprawdzić, czy Rickettsia wpływa na tempo zapłodnienia samic B. tabaci MEAM1, hodowaliśmy zakażone riketsją (R+) lub niezakażone (R-) B. tabaci na roślinach cowpea (Vigna unguiculata) w oddzielnych klatkach w temperaturze 27 °C, wilgotności względnej 70% i ciemnym fotoperiodze 16 h / 8 h. Mączliki R+ i R- w czwartym stadium rozwojowym ostrożnie usunięto z liści i wyizolowano w probówkach paskowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest pierwszym, który rejestruje wskaźnik zapłodnienia lub pierwotny stosunek płci B. tabaci. Wyzwanie związane z tym protokołem polega na tym, że wymaga on od naukowców nauczenia się, jak szybko obchodzić się z jajami mączlika, upewniając się, że nie minęło więcej niż 1 godzina od złożenia jaj do momentu ich utrwalenia. Podczas wstępnych eksperymentów jaja, które zostały utrwalone po 3 godzinach lub więcej po złożeniu jaj, były zbyt stare, aby zaobserwować zapłodnienie, ponieważ nastąpiła syngamia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantu NSF (DEB-1020460) dla M.S.H. oraz grantu USDA AFRI (2010-03752) dla M.S.H. Autorzy dziękują Brennanowi Zehrowi za barwienie jaj mączlika z dużą wprawą i Zen. Autorzy dziękują Mike'owi Riehle za zgodę na użycie jego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania. Autorzy dziękują Suzanne Kelly i Marco Gebioli za zdjęcia jaj. Autorzy dziękują Suzanne Kelly i Jimmy'emu Conwayowi za pomoc w kluczowych momentach eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBSDowolna
1x TBSTDowolna5x roztwór wykonany z 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 ml Tween-20 i 1,0 g NaN3 pH 7,5 i doprowadzony do 1 l wodą klasy PCR
WybielaczCloroxKażdy domowy wybielacz będzie działał, o ile można go rozcieńczyć do 0,83% Podchloryn sodu
Bezbarwny lakier do paznokciDowolna
DAPI dilactateSanta Cruz Biotechnologysc300415
EtanolDowolnyRozcieńczony do 70% EtOH
Mikroskop fluorescencyjnyNikon NikonEclipse 50i został użyty w tym eksperymencie, ale można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wzbudzenia 340/380 nm i co najmniej 4-10-krotnym powiększeniem
Lodowaty kwas octowyMallinckrodtUN2789
GlicerolDowolny
Wild M5A, ale można użyć dowolnego mikroskopu, w którym operator wyraźnie widzi jaja mączlika.
W przypadku większych pokryw przesuwnych konieczne będzie dodanie większej liczby nośników montażowych.
Szkiełka mikroskopoweDowolne
szpilki Minuten NadelBioQuip1208SASzpilki Minuten nadel są opcjonalne do modelowania jako sondy z końcówkami do pipet
NaClDowolna
NaN3Any
N-galusan propyluSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmPipety Bemis
PasteurFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego 5,75 cala. Palnik Bunsena może być również potrzebny, jeśli operator chciałby wydłużyć i zwęzić pipety Woda
klasy PCRDowolne
końcówki do pipetDowolnekońcówki do pipet są opcjonalne do modelowania jako sondy z drobnymi szpilkami Nadel Mała
żarówka z zakraplaczemDowolnaMusi pasować do pipety Pasteura
TrisDowolna
Tween-20Dowolna
mikroskop Wild Do tego eksperymentu użyto mikroskopu Osłony szkiełek mikroskopowych Dowolne metody dotyczą pokryw szkiełek o wymiarach 18 mm x 18 mm.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wska nik zap odnienia m czlikadechorionizacja jajbarwienie j der DAPImikroskopia fluorescencyjnahaplodiploidalny stosunek p cipierwotny stosunek p ciendosymbiont Rickettsiaprotok utrwalania jaj

Powiązane artykuły