Method Article

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

DOI:

10.3791/59214

⸱

March 21st, 2019

 ,  , 
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie hodowli 3D in vitro jest znacznie podkreślone w hodowli komórek/tkanek. Jednym z jego ograniczeń jest jednak brak powtarzalności eksperymentalnej. Wytwarzanie niewielu powtarzalnych wyników tworzenia wzorców pogarsza analizę mechanizmów leżących u podstaw samoorganizacji. Zmniejszenie zmienności w początkowych warunkach hodowli, takich jak gęstość i rozmieszczenie komórek w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia powtarzalności hodowli 3D. W tym artykule przedstawiamy prostą, ale solidną procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w macierzy zewnątrzkomórkowej 3D w celu uzyskania wysoce powtarzalnych formacji wzorcowych. Mikroforma o pożądanym kształcie została wytworzona za pomocą fotolitografii lub procesu obróbki skrawaniem i utworzyła kieszeń 3D w ECM zawartą w hybrydowym kostce żelowej (HGC). Wysoce skoncentrowane komórki zostały następnie wstrzyknięte do kieszeni, tak aby kształt klastra komórek pasował do wyprodukowanego kształtu formy. Zastosowany HGC pozwolił na wielokierunkowe skanowanie poprzez jego rotację, co umożliwiło obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i uchwycenie całej struktury tkanki, mimo że zastosowano soczewkę o małym powiększeniu. Do zademonstrowania metodologii wykorzystano normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie kultury 3D, która lepiej naśladuje środowiska biologiczne niż kultura 2D, jest znacznie podkreślone w hodowli komórek/tkanek1,2,3. Interakcja między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) dostarcza ważnych wskazówek dotyczących morfogenezy4,5. Wiele formacji tkankowych może powstać tylko w środowiskach 3D, takich jak proces składania6,7, invagination8 i formacja rurkowa9,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja hybrydowego urządzenia do kostki żelowej

  1. Przygotuj sześcienną ramę z poliwęglanu (PC) za pomocą procesu obróbki skrawaniem lub drukarki 3D. Wielkość ramki PC zależy od wielkości próby. W tym badaniu użyliśmy ramy o grubości 5 mm z każdej strony, aby gałęzie miały wystarczająco dużo miejsca na wydłużenie podczas hodowli.
  2. Umieść ramę komputera na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym lub innej gładkiej powierzchni w pojemniku na lód (<0 °C) (Rysunek 1A).
  3. Dodać pipetą 12 μl wstępnie podgrzanej 1,5% agarozy (w/v) z górnej powierzchni ramy sześciennej na dolną powierzchnię. Pogłaszcz pipetę tak, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE) zostały użyte do zademonstrowania ilustrowanej metodologii i kontrolowania początkowej geometrii komórek zbiorowych w celu uzyskania kształtu cylindra i kształtu graniastosłupa, odpowiednio w środowisku ECM. Przedstawiono wyniki obrazowania wielokierunkowego uzyskane za pomocą kontrastu fazowego oraz barwienia falloidyną w kształcie walca (Rysunek 4A,B) i kształt pryzmatu (Rysunek 4C.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda przedstawiona w tym artykule jest prosta i może być wykonywana bez użycia zaawansowanego technologicznie sprzętu. Jednocześnie można uzyskać precyzyjny wynik kontroli kształtu klastra komórkowego w przestrzeni 3D hydrożelu. Po wstępnej kontroli komórki mogą rosnąć w HGC w takim samym stopniu, w jakim są hodowane na szalce. Obrazowanie wielokierunkowe odbywa się poprzez obracanie próbki za pomocą HGC przy użyciu dowolnego systemu mikroskopowego, co znacznie poprawia jakość obrazowania. Wybór materiałów na ramę HGC .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wraz z Uniwersytetem Prefektury Osaka i Instytutem Technologii Kyushu złożyli wniosek patentowy na hybrydowe urządzenie do kostki żelowej, a firma Nippon Medical and Chemical Instruments Co. Ltd z Japonii niedawno skomercjalizowała kostkę. Firma nie miała wpływu na żaden z opisanych projektów, procesów i metod.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez JSPS KAKENHI (18H04765) oraz Program do Rozpowszechniania Tenure Track System, MEXT, Japonia.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12-dołkowa płytkaCorning  Inc.3513
Octan 2-metoksy-1-metyloetyluFUJIFILM Wako Pure Chemical Co.130-10505PGMEA, CAS: 108-65-6 
4% paraformaldehyduFUJIFILM Wako Pure Chemical Co.161-20141CAS: 30525-89-4
Agaroza, niska temperatura żelowania  BioodczynnikSigma-AldrichA9414
Alexa fluor 488 falloidynaThermo Fisher ScientificA12379
AZ1512Merck
BEGMLonzaCC-3170Specjalistyczne podłoże do komórek NHBE
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (10 %)Sigma-AldrichA1595
Zestaw pocisków EGM-2LonzaCC-3162Specjalistyczne podłoże do komórek śródbłonka
LipidureNOF co.Polimer MPC
Czynnik wzrostu Matrigel zredukowany matryca błony podstawnejCorning  Inc.354230
Normalna surowica kozia (10%)Thermo Fisher Scientific50197Z
Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeliLonzaCC-2541
SILPOT 184 W/CDow Corning Co.3255981Żywica bazowa i katalizator do PDMS
SUEX D300DJ MicroLaminates, IncGruby ujemny fotorezystor (grubość: 300 mm)
Triton X-100 (1%)Thermo Fisher ScientificHFH10
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
Zestaw pocisków

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Natur....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hybrid Gel Cube3D Cell CultureInitial Cell ClusterExtracellular MatrixMicromold FabricationMultidirectional ImagingPhase Contrast MicroscopyImmunofluorescent ImagingNormal Human Bronchial Epithelial CellsRepeatable Pattern Formation

Related Articles