Method Article

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

DOI:

10.3791/59214

⸱

March 21st, 2019

 ,  , 
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie hodowli 3D in vitro jest znacznie podkreślone w hodowli komórek/tkanek. Jednym z jego ograniczeń jest jednak brak powtarzalności eksperymentalnej. Wytwarzanie niewielu powtarzalnych wyników tworzenia wzorców pogarsza analizę mechanizmów leżących u podstaw samoorganizacji. Zmniejszenie zmienności w początkowych warunkach hodowli, takich jak gęstość i rozmieszczenie komórek w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia powtarzalności hodowli 3D. W tym artykule przedstawiamy prostą, ale solidną procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w macierzy zewnątrzkomórkowej 3D w celu uzyskania wysoce powtarzalnych formacji wzorcowych. Mikroforma o pożądanym kształcie została wytworzona za pomocą fotolitografii lub procesu obróbki skrawaniem i utworzyła kieszeń 3D w ECM zawartą w hybrydowym kostce żelowej (HGC). Wysoce skoncentrowane komórki zostały następnie wstrzyknięte do kieszeni, tak aby kształt klastra komórek pasował do wyprodukowanego kształtu formy. Zastosowany HGC pozwolił na wielokierunkowe skanowanie poprzez jego rotację, co umożliwiło obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i uchwycenie całej struktury tkanki, mimo że zastosowano soczewkę o małym powiększeniu. Do zademonstrowania metodologii wykorzystano normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie kultury 3D, która lepiej naśladuje środowiska biologiczne niż kultura 2D, jest znacznie podkreślone w hodowli komórek/tkanek1,2,3. Interakcja między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) dostarcza ważnych wskazówek dotyczących morfogenezy4,5. Wiele formacji tkankowych może powstać tylko w środowiskach 3D, takich jak proces składania6,7, invagination8 i formacja rurkowa9,10. Jednak liczne trudności powstrzymują badaczy przed przejściem do eksperymentów 3D z eksperymentów 2D na talerzu. Jedną z głównych trudności w eksperymentach 3D jest kwestia obrazowania próbek 3D. W porównaniu z eksperymentami planarnymi, uzyskanie odpowiednich obrazów 3D jest nadal w wielu przypadkach wyzwaniem. W szczególności uzyskanie odpowiedniego obrazu 3D jest trudnym zadaniem, gdy wielkość próbki osiąga zakres milimetrowy ze względu na dużą głębię ogniskowej soczewek o małym powiększeniu. Na przykład głębia ogniskowej osiąga ponad 50 μm, gdy używany jest obiektyw o powiększeniu 10x, podczas gdy rozmiar pojedynczej komórki jest zwykle mniejszy niż 10 μm. Aby poprawić jakość obrazowania, opracowywane są zaawansowane technologicznie systemy mikroskopowe (np. mikroskopia dwufotonowa11 i light-sheet microscopy system12), ale ich dostępność jest ograniczona ze względu na ich wysoką cenę. Jako alternatywę opracowaliśmy wcześniej urządzenie do hybrydowej kostki żelowej (HGC)13. Urządzenie składa się z dwóch rodzajów hydrożeli: agarozy jako żelu podporowego oraz ECM takiego jak kolagen lub Matrigel jako żel hodowlany. HGC pozwala nam pobrać próbkę podczas hodowli i obrócić kostkę w celu uzyskania obrazowania wielokierunkowego, co rozwiązuje problem głębokości ogniskowej14.

Kolejną trudnością w eksperymentach 3D jest ich niska powtarzalność wynikająca ze słabej sterowalności środowisk 3D. W przeciwieństwie do hodowli płaskiej na plastikowym naczyniu, zmiany w początkowych warunkach hodowli łatwo występują w przestrzeni 3D otoczonej miękkim materiałem. Znaczna różnica w wynikach eksperymentu pogarsza poniższą analizę i maskuje mechanizmy leżące u jej podstaw. Opracowano wiele technologii inżynieryjnych w celu przestrzennego wyrównania pojedynczych komórek, takich jak bioprinting15,16, tkanie włókien17 i rusztowanie18, ale wymagają one skomplikowanego przetwarzania wstępnego lub specjalnie zaprojektowanego sprzętu. W przeciwieństwie do tego, opracowaliśmy metodologię osiągania wyrównania komórek 3D w klasie HGC19.

W tym protokole zilustrowaliśmy prostą procedurę z powszechnie używanym sprzętem do kontrolowania początkowego kształtu klastra komórek 3D w HGC. Po pierwsze, zademonstrowano proces produkcji HGC. Następnie mikroformy wytworzone za pomocą fotolitografii lub procesu obróbki skrawaniem umieszczono w HGC w celu wytworzenia kieszeni o dowolnym kształcie w ECM. Następnie, bardzo gęste komórki po odwirowaniu zostały wstrzyknięte do kieszeni w celu kontrolowania początkowego kształtu klastra komórek w HGC. Precyzyjnie kontrolowane skupisko komórek może być obrazowane z wielu kierunków dzięki HGC. Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE) wykorzystano do zademonstrowania kontroli początkowego kształtu klastra komórkowego i obrazowania gałęzi z wielu kierunków w celu poprawy jakości obrazowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja hybrydowego urządzenia do kostki żelowej

  1. Przygotuj sześcienną ramę z poliwęglanu (PC) za pomocą procesu obróbki skrawaniem lub drukarki 3D. Wielkość ramki PC zależy od wielkości próby. W tym badaniu użyliśmy ramy o grubości 5 mm z każdej strony, aby gałęzie miały wystarczająco dużo miejsca na wydłużenie podczas hodowli.
  2. Umieść ramę komputera na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym lub innej gładkiej powierzchni w pojemniku na lód (<0 °C) (Rysunek 1A).
  3. Dodać pipetą 12 μl wstępnie podgrzanej 1,5% agarozy (w/v) z górnej powierzchni ramy sześciennej na dolną powierzchnię. Pogłaszcz pipetę tak, aby agaroza rozprowadziła się, tworząc płaską powierzchnię (Rysunek 1B).
  4. W ciągu kilku minut agaroza zostanie wyleczona. Podnieś ramkę komputera, przesuwając ją do krawędzi szklanego szkiełka za pomocą pęsety. Należy pamiętać, że pionowe podnoszenie ramy ze szkiełka może spowodować oderwanie się agarozy od ramy sześciennej ze względu na siłę adhezji między agarozą a szkiełkiem podstawowym (Rysunek 1C).
  5. Obróć sześcienną ramę tak, aby była otwarta stroną zadrukowaną do dołu, a następnie ponownie umieść ją na szkiełku podstawowym (Rysunek 1D).
  6. Powtarzaj kroki 1.3–1.5, aż trzy powierzchnie zostaną wypełnione agarozą (Rysunek 1E).
  7. Aby utworzyć ścianę agarozy na czwartej i piątej ścianie, wrzuć agarozę z otwartej powierzchni (Rysunek 1F). Gdy na piątej ścianie uformuje się ściana agarozowa, przygotowanie HGC jest zakończone.

2. Wytwarzanie mikroform za pomocą fotolitografii lub obróbki skrawaniem

  1. Wytwarzanie metodą fotolitografii
    1. Oczyść płytkę krzemową (Si) za pomocą czyszczenia ultradźwiękowego acetonem, alkoholem izopropylowym (IPA), a następnie wodą destylowaną (DI) przez 5 minut każda. Po przedmuchiwaniu azotem wafla Si azotem, odwadniać w piecu w temperaturze 140 °C przez 20 minut (Rysunek 2A(i)).
    2. Warstwa protektorowa, taka jak LOR i Az, jest odporna na płytkę Si (2,000 obr./min, 30 s) za pomocą wirownika w żółtym świetle. Natychmiast po wirowaniu podgrzej wafel na gorącej płycie w temperaturze 90 °C przez 3 minuty (Rysunek 2A(ii)). Pożądana grubość warstwy protektorowej wynosi ponad 1 μm, dzięki czemu proces podnoszenia można łatwo przeprowadzić, ale dokładna grubość nie jest konieczna.
    3. Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C, a następnie zalaminuj gruby ujemny arkusz fotorezystu o żądanej grubości na warstwie protektorowej za pomocą wałka ręcznego (Rysunek 2A(iii))
    4. Pięć minut po laminowaniu umieść wafel na nakładce maski w celu ekspozycji na promieniowanie UV. Ustaw fotomaskę z żądanym wzorem na arkuszu, odpornij i naświetlaj światłem UV przez odpowiedni czas. Czas naświetlania zależy od grubości fotorezystu i intensywności światła UV. Następnie umieść wafel na płycie grzejnej do pieczenia po ekspozycji w temperaturze 60 °C przez 5 minut, a następnie piecz w temperaturze 90 °C przez 10 minut. (Rysunek 2A(iv))
    5. Rozwinąć ujemny fotorezyst, zanurzając płytkę w octanie eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA), aż nienaświetlony obszar zostanie całkowicie rozpuszczony (około 20 minut) (Rysunek 2A (v)).
    6. Rozpuść warstwę protektorową za pomocą IPA do czyszczenia ultradźwiękowego, aby usunąć mikrostrukturę. Po oderwaniu mikrostruktury od płytki, spłucz wodą DI za pomocą czyszczenia ultradźwiękowego przez 10 minut (Rysunek 2A(vi)).
    7. Zanurz formę w 30 μl polimeru MPC na 30 minut w temperaturze pokojowej (około 20 °C), aby całkowicie ją wysuszyć. Rysunek 2B pokazuje sfabrykowaną formę pryzmatu.
  2. Wykonanie formy cylindrycznej
    1. Wytwarzaj stalową formę cylindryczną o pożądanym rozmiarze w procesie obróbki. Alternatywnie użyj dostępnej w handlu stali nierdzewnej. (W tym badaniu użyto butli o φ 600 μm.)
    2. Zanurzyć stalową cylinder w 30 μl polimeru MPC na 30 minut w temperaturze pokojowej (około 20 °C) w celu całkowitego wysuszenia.
    3. Przygotować ciekły polidimetylosiloksan (PDMS) mieszając żywicę bazową i jej katalizator (patrz tabela materiałów) w stosunku 10:1, a następnie odgazowując za pomocą systemu odgazowywania próżniowego przez 20 minut. Następnie wlej PDMS do płytki 12-dołkowej.
    4. Ustaw stalowy cylinder prostopadle do powierzchni bazy pomiarowej i przymocuj do liniowego stolika z tak, aby można go było prostopadle wstawić w nieutwardzoną powierzchnię PDMS w 12-dołkowej płytce umieszczonej na tej samej powierzchni odniesienia, przesuwając stolik z. Inkubować PDMS ze stalowym cylindrem w piecu przez 20 minut w temperaturze 90 °C w celu utwardzenia. Przyciąć PDMS tak, aby utworzył powierzchnię boczną, tak aby pipeta mogła zostać włożona w następujący proces (Rysunek 2C).

3. Kontrolowanie początkowego kształtu klastra komórek w hydrożelu

  1. Wstrzyknąć odpowiedni ECM dla pożądanej hodowli komórkowej, takiej jak kolagen i sztuczna błona podstawna, do HGC, aby wypełnić przestrzeń hodowlaną (Rysunek 3A).
  2. Ustaw wyprodukowaną mikroformę na HGC bezpośrednio lub pośrednio za pomocą odpowiedniego uchwytu, jak pokazano na Rysunek 3B. Następnie umieścić HGC w inkubatorze CO2 na 25 minut w temperaturze 37 °C w celu utwardzenia.
  3. Ostrożnie wyjmij mikroformę, aby ECM nie uległ pogorszeniu (Rysunek 3C). Kieszeń, jako pożądany kształt formy, zostanie wyprodukowana w ECM.
  4. Zbierz komórki z hodowanej szalki za pomocą trypsyny-EDTA lub jej odpowiednika, w zależności od typu komórek. Następnie odwirować komórki, aby uzyskać wysoce skoncentrowane komórki (w przypadku hodowli NHBE należy zastosować 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez 3 minuty, a następnie zneutralizować pożywką zawierającą FBS i odwirować przy 300 x g przez 4 minuty).
  5. Po odwirowaniu usuń pożywkę sklarowaną nad osadem, aby skondensować komórki i wstrzyknąć wysoce skoncentrowane komórki (3,0 ×10 4 komórki/μl dla komórek NHBE) do kieszeni w ECM (Rysunek 3D).
  6. Inkubować HGC z komórkami w inkubatorze CO2 przez 20 minut w temperaturze 37 °C, tak aby komórki wpadły do kieszeni ECM w celu wypełnienia przestrzeni utworzonej przez mikroformy. Jeśli na górnej powierzchni znajduje się nadmiar podłoża lub komórek, ostrożnie usuń je za pomocą pipety.
  7. Umieść HGC na 24-dołkowej płytce i dodaj 100 μl odpowiedniego podłoża (Rysunek 3E). W przypadku komórek NHBE należy użyć mieszaniny 1:1 dostępnej na rynku specjalistycznej pożywki dla NHBE i komórek śródbłonka (patrz tabela materiałów).
  8. Wstrzyknąć dodatkowy ECM w celu zamknięcia kieszeni w ECM, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut.
  9. Schłodzić podgrzaną 1,5% agarozę do temperatury pokojowej (około 20 °C). Upuść około 10 μl agarozy na górną powierzchnię HGC, aby zamknąć powierzchnię i zapobiec wypadnięciu ECM z HGC podczas hodowli i obrazowania (Rysunek 3F). Następnie inkubować HGC przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C, aby utwardzić agarozę.
  10. Dodaj pożywkę, aby pokryć cały HGC, aby ciśnienie osmotyczne mogło pomóc w zapewnieniu odżywiania komórkom wewnątrz HGC.

4. Obrazowanie wielokierunkowe

  1. Nieinwazyjne rozpoznawanie kształtów 3D poprzez wielokierunkową obserwację
    1. Umieść naczynie hodowlane lub płytkę studzienkową zawierającą HGC pod mikroskopem i ustaw HGC w ramie kamery. Następnie uzyskaj przykładowy obraz za pomocą jasnego pola lub kontrastu fazowego.
    2. Podnieś i obróć HGC, aby położyć inną powierzchnię w dół.
    3. Powtarzaj kroki 4.1.1 i 4.1.2, aż uzyskasz obrazy ze wszystkich sześciu stron.
  2. Obrazowanie immunofluorescencyjne metodą obserwacji wielokierunkowej
    1. W celu utrwalenia należy nałożyć 4% paraformaldehydu na próbkę nad HGC w temperaturze pokojowej (około 20 °C) przez 20 minut, a następnie dwa płukania PBS przez 10 minut każde
      2. .
    2. Przepuszczać HGC z PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 min w temperaturze 4 °C, a następnie przemywać 3x przez 10 minut PBS.
    3. Inkubować HGC z 10% surowicą kozią w buforze IF-buffer (0,2% Triton X-100, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,05% Tween-20 w PBS) przez 60 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania pierwotnego etapu blokowania.
    4. Do barwienia określonej cząsteczki użyj odpowiedniego przeciwciała. Aby zaobserwować kolektywną geometrię komórek, Alexa Fluor 488 Phalloidin może być używana do barwienia aktyny.
    5. Umieść HGC na naczyniu ze szklanym dnem pod mikroskopem laserowym lub fluorescencyjnym i wykonaj skanowanie z sześciu stron, aby uzyskać cały obraz próbki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE) zostały użyte do zademonstrowania ilustrowanej metodologii i kontrolowania początkowej geometrii komórek zbiorowych w celu uzyskania kształtu cylindra i kształtu graniastosłupa, odpowiednio w środowisku ECM. Przedstawiono wyniki obrazowania wielokierunkowego uzyskane za pomocą kontrastu fazowego oraz barwienia falloidyną w kształcie walca (Rysunek 4A,B) i kształt pryzmatu (Rysunek 4C...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda przedstawiona w tym artykule jest prosta i może być wykonywana bez użycia zaawansowanego technologicznie sprzętu. Jednocześnie można uzyskać precyzyjny wynik kontroli kształtu klastra komórkowego w przestrzeni 3D hydrożelu. Po wstępnej kontroli komórki mogą rosnąć w HGC w takim samym stopniu, w jakim są hodowane na szalce. Obrazowanie wielokierunkowe odbywa się poprzez obracanie próbki za pomocą HGC przy użyciu dowolnego systemu mikroskopowego, co znacznie poprawia jakość obrazowania. Wybór materiałów na ramę HGC ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wraz z Uniwersytetem Prefektury Osaka i Instytutem Technologii Kyushu złożyli wniosek patentowy na hybrydowe urządzenie do kostki żelowej, a firma Nippon Medical and Chemical Instruments Co. Ltd z Japonii niedawno skomercjalizowała kostkę. Firma nie miała wpływu na żaden z opisanych projektów, procesów i metod.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez JSPS KAKENHI (18H04765) oraz Program do Rozpowszechniania Tenure Track System, MEXT, Japonia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12-dołkowa płytkaCorning  Inc.3513
Octan 2-metoksy-1-metyloetyluFUJIFILM Wako Pure Chemical Co.130-10505PGMEA, CAS: 108-65-6 
4% paraformaldehyduFUJIFILM Wako Pure Chemical Co.161-20141CAS: 30525-89-4
Agaroza, niska temperatura żelowania  BioodczynnikSigma-AldrichA9414
Alexa fluor 488 falloidynaThermo Fisher ScientificA12379
AZ1512Merck
BEGMLonzaCC-3170Specjalistyczne podłoże do komórek NHBE
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (10 %)Sigma-AldrichA1595
Zestaw pocisków EGM-2LonzaCC-3162Specjalistyczne podłoże do komórek śródbłonka
LipidureNOF co.Polimer MPC
Czynnik wzrostu Matrigel zredukowany matryca błony podstawnejCorning  Inc.354230
Normalna surowica kozia (10%)Thermo Fisher Scientific50197Z
Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeliLonzaCC-2541
SILPOT 184 W/CDow Corning Co.3255981Żywica bazowa i katalizator do PDMS
SUEX D300DJ MicroLaminates, IncGruby ujemny fotorezystor (grubość: 300 mm)
Triton X-100 (1%)Thermo Fisher ScientificHFH10
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
Zestaw pocisków

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  5. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  6. Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
  7. Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
  8. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
  9. Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
  10. Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  11. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
  13. Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
  14. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
  15. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  16. Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  17. Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
  18. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  19. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
  20. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  21. Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hybrid Gel Cube3D Cell CultureInitial Cell ClusterExtracellular MatrixMicromold FabricationMultidirectional ImagingPhase Contrast MicroscopyImmunofluorescent ImagingNormal Human Bronchial Epithelial CellsRepeatable Pattern Formation

Related Articles