Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59215

⸱

5 marca 2019

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy eksperymentalne podejścia do badania interakcji RNA dwuniciowych białek wiążących RNA, aktywowanych przez RNA (PKR) podczas cyklu komórkowego ssaków przy użyciu komórek HeLa. Metoda ta wykorzystuje formaldehyd do sieciowania kompleksów RNA-PKR i immunoprecypitacji w celu wzbogacenia RNA związanych z PKR. Te RNA mogą być dalej analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub qRT-PCR.

Streszczenie

Kinaza białkowa aktywowana RNA (PKR) jest członkiem białek wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i rozpoznaje dwuniciową strukturę drugorzędową wirusowych RNA. Po związaniu z wirusowymi dwuniciowymi RNA (dsRNA), PKR ulega dimeryzacji, a następnie autofosforylacji. Fosforylowany PKR (pPKR) staje się aktywny i indukuje fosforylację podjednostki alfa eukariotycznego czynnika inicjacji 2 (eIF2α) w celu zahamowania globalnej translacji. Coraz więcej dowodów sugeruje, że PKR może być aktywowany w warunkach fizjologicznych, takich jak cykl komórkowy lub w różnych warunkach stresu bez infekcji. Jednak nasza wiedza na temat aktywatorów RNA PKR jest ograniczona ze względu na brak ustandaryzowanej metody eksperymentalnej do wychwytywania i analizowania dsRNA oddziałujących z PKR. Tutaj przedstawiamy protokół eksperymentalny mający na celu specyficzne wzbogacenie i analizę RNA związanych z PKR podczas cyklu komórkowego przy użyciu komórek HeLa. Wykorzystujemy wydajną aktywność sieciującą formaldehydu do wiązania kompleksów PKR-RNA i izolowania ich poprzez immunoprecypitację. Współimmunoprecypitowane RNA PKR mogą być następnie dalej przetwarzane w celu wygenerowania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jedną z głównych klas komórkowych dsRNA oddziałujących z PKR są mitochondrialne RNA (mtRNA), które mogą istnieć jako międzycząsteczkowe dsRNA poprzez komplementarną interakcję między ciężką i lekką nicią RNA. Aby zbadać nici tych dupleksowych mtRNA, przedstawiamy również protokół qRT-PCR specyficznego dla nici. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem analizy RNA związanych z PKR, ale można go łatwo zmodyfikować w celu badania komórkowych dsRNA lub interaktorów RNA innych białek wiążących dsRNA.

Wprowadzenie

Kinaza białkowa aktywowana RNA (PKR), znana również jako eukariotyczny czynnik inicjacji 2-alfa kinaza 2 (EIF2AK2), jest dobrze scharakteryzowaną kinazą białkową, która przekazuje informacje dostarczane przez RNA. Należy do rodziny kinaz kinazy alfa (eIF2α) podjednostki inicjacji translacji eukariotycznej 2 (eIF2α) i fosforyluje eIF2α w serynie 51 w odpowiedzi na infekcję, aby stłumić globalną translację1. W tym kontekście, PKR jest aktywowany przez wirusowe dwuniciowe RNA (dsRNA), które stanowią platformę do dimeryzacji PKR i autofosforylacji2. Oprócz eIF2α, PKR może również fosforylować p53, substrat receptora insuliny 1, inhibitor κB i kinazę N-końcową c-Jun (JNK) w celu regulacji aktywności wielu szlaków transdukcji sygnału3,4,5,6.

PKR został pierwotnie zidentyfikowany jako kinaza, która fosforylowała eIF2α podczas infekcji wirusem polio, rozpoznając dsRNA wirusa polio7,8. Coraz częściej stwierdza się, że PKR odgrywa wieloaspektową rolę poza odpowiedzią immunologiczną, a jego nieprawidłowa aktywacja lub nieprawidłowe działanie jest implikowane w wielu chorobach człowieka. Aktywowany/ufosforylowany PKR (pPKR) jest często obserwowany podczas apoptozy i jest powszechną cechą pacjentów z chorobami zwyrodnieniowymi, szczególnie chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Huntingtona, Parkinsona i choroba Alzheimera9,10,11,12,13. Ponadto PKR jest aktywowany w różnych warunkach stresowych, takich jak stres metaboliczny i szok cieplny14,15,16,17. Z drugiej strony, hamowanie PKR powoduje zwiększoną proliferację komórek, a nawet transformację złośliwą18,19. Funkcja PKR jest również ważna w prawidłowym funkcjonowaniu mózgu i podczas cyklu komórkowego, ponieważ poziom pPKR jest podwyższony podczas fazy M20,21,22. W tym kontekście, pPKR tłumi globalną translację i dostarcza wskazówek do kluczowych systemów sygnalizacji mitotycznej, które są wymagane do prawidłowego podziału komórki20. Co więcej, przedłużona aktywacja PKR powodowała zatrzymanie cyklu komórkowego fazy G2/M w komórkach jajnika chomika chińskiego23. W związku z tym fosforylacja PKR jest regulowana przez pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego, aby zapewnić szybką dezaktywację podczas przejścia M/G121.

Pomimo szerokiego zakresu funkcji PKR, nasze zrozumienie aktywacji PKR jest ograniczone z powodu braku ustandaryzowanego, wysokoprzepustowego eksperymentalnego podejścia do wychwytywania i identyfikacji dsRNA, które mogą aktywować PKR. Wcześniejsze badania wykazały, że PKR może wchodzić w interakcje z dsRNA utworzonymi przez dwa odwrócone powtórzenia Alu (IRAlus)20,24, ale możliwość istnienia dodatkowych komórkowych dsRNA, które mogą aktywować PKR podczas cyklu komórkowego lub w warunkach stresu w komórkach ludzkich, nie została zbadana. Konwencjonalne podejście do identyfikacji interaktorów RNA białka wiążącego RNA (RBP) wykorzystuje światło UV do sieciowania kompleksów RNA-RBP25,26,27. W niedawnym badaniu zastosowano to podejście do sieciowania UV w systemie mysim i stwierdzono, że małe jąderkowe RNA mogą regulować aktywację PKR podczas stresu metabolicznego16. Wykorzystując wysoką skuteczność sieciowania formaldehydu, przedstawiliśmy alternatywną metodę identyfikacji RNA oddziałujących z PKR podczas cyklu komórkowego w komórkach HeLa28. Podobne podejście zastosowano do badania innych dsRBP, takich jak Staufen i Drosha29,30,31. Odkryliśmy, że PKR może wchodzić w interakcje z różnymi typami niekodujących RNA, takimi jak krótki przeplatany element jądrowy (SINE), długi przeplatany element jądrowy (LINE), endogenny element retrowirusowy (ERV), a nawet alfa-satelitarne RNA. Ponadto wykazaliśmy, że PKR może wchodzić w interakcje z mitochondrialnymi RNA (mtRNA), które tworzą międzycząsteczkowe dsRNA poprzez komplementarną interakcję między ciężką i lekką nicią RNAs28. Niedawna publikacja dodatkowo potwierdziła nasze dane, że niektóre mtRNA istnieją w formie dupleksu i mogą aktywować czujniki dsRNA, takie jak białko 5 związane z różnicowaniem czerniaka, w celu indukcji interferonów32. Co ważniejsze, ekspresja i subkomórkowa lokalizacja mtRNA są modulowane podczas cyklu komórkowego i przez różne stresory, co może być ważne dla ich zdolności do regulowania aktywacji PKR28.

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół dla niedawno opracowanej metody sieciowania i immunoprecypitacji formaldehydu (fCLIP) do wychwytywania i analizowania RNA oddziałujących z PKR podczas cyklu komórkowego. Przedstawiono metodę przygotowania próbek zatrzymania cyklu komórkowego przy użyciu tymidyny i nokodazolu. Następnie przedstawiamy proces fCLIP do izolacji RNA związanych z PKR oraz metodę przygotowania wysokoprzepustowej biblioteki sekwencjonowania w celu identyfikacji tych RNA. Ponadto określamy szczegółowe procedury analizy RNA związanych z PKR za pomocą qRT-PCR. W szczególności przedstawiamy specyficzną dla nici procedurę odwrotnej transkrypcji w celu analizy nici mtRNA. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek HeLa i PKR, ale kluczowe etapy, takie jak przygotowanie próbki cyklu komórkowego, fCLIP i analiza qRT-PCR specyficzna dla nici, można łatwo zmodyfikować w celu zbadania komórkowych dsRNA lub identyfikacji interaktorów RNA innych dsRBP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu i komórek

  1. Przygotowanie roztworu
    1. W przypadku pożywki do hodowli komórkowych należy przygotować pożywkę do hodowli komórek HeLa, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
      UWAGA: Do pożywki do hodowli komórkowych można dodawać antybiotyki, ale nie używamy antybiotyków.
    2. W przypadku 0,1% paraformaldehydu rozpuść 4% (w/v) paraformaldehydu w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z ogrzewaniem na płycie grzejnej i rozcieńczyć do uzyskania 30 ml 0,1% (v/v) paraformaldehydu, dodając 1x PBS.
      UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w dygestoriach i uważaj, aby nie zagotować roztworu paraformaldehydu. Chronić 0,1% roztwór przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór zużyć w ciągu jednego miesiąca.
      UWAGA: pH końcowego 0,1% (v/v) roztworu paraformaldehydu powinno wynosić około 7.
    3. Przygotuj bufor do lizy fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) dodecylosiarczan sodu (SDS) i 0,1% (w/v) deoksycholan sodu. Dodaj potrójnie destylowaną wodę (TDW) do 40 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotuj bufor płuczący fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS i 0,1% (w/v) deoksycholan sodu. Dodaj TDW do 40 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotuj 4x bufor PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA i 4% (v/v) SDS. Dodaj TDW do 40 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    6. Przygotować bufor elucyjny fCLIP: 20 ml 4x buforu PK, 21 g mocznika i 8,5 ml TDW. Przygotuj świeże.
    7. Przygotować bufor elucyjny RNA: 0,3 M NaOAc i 2% (w/v) SDS. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    8. Przygotuj 2x barwnik ładujący RNA: 0,025% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,025% (w/v) cyjanol ksylenowy, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) SDS i 95% (v/v) formamid. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    9. Przygotować 1x bufor TBE: 0,089 M tris-boranu i 0,002 M EDTA. Przygotować 500 ml buforu do KZM
      10. .
  2. Przygotowanie komórek z zatrzymaniem fazy S lub M
    1. Zasiewaj ~ 750 000 lub ~ 1 000 000 komórek HeLa odpowiednio dla próbek zatrzymanych w fazie S lub M. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
    2. Potraktować komórki 2 mM tymidyny i inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Umyj komórki dwa razy PBS. Dodać świeżą pożywkę i inkubować przez 9 godzin w temperaturze 37 °C.
    4. W przypadku komórek z zatrzymaną fazą S potraktuj komórki 2 mM tymidyną. W przypadku komórek z zatrzymaną fazą M należy potraktować komórki nokodazolem w stężeniu 100 ng/ml. Inkubować przez 15 godzin w temperaturze 37 °C i zbierać komórki.
      UWAGA: Jednorodność próbek cyklu komórkowego można sprawdzić za pomocą FACS.

2. Sieciowanie formaldehydu i immunoprecypitacja

  1. Pobieranie komórek
    1. W przypadku próbki w fazie S zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. W przypadku próbki w fazie M postukaj w bok naczynia do hodowli komórkowej, aby odłączyć komórki zatrzymane w fazie M i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Aby zwiększyć jednorodność ogniw z zatrzymaniem fazy M, nie należy używać skrobaka do komórek.
    2. Odwirować komórki w temperaturze 380 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 1 ml zimnego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Całkowicie usunąć supernatant.
  2. Sieciowanie formaldehydu
    1. Dodaj 750 μl 0,1% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.
    2. Dodać 250 μl 1 M glicyny i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia reakcji. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Całkowicie usunąć supernatant.
    3. Ponownie zawiesić za pomocą 1 ml PBS. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s i usunąć supernatant.
    4. Zawiesić za pomocą 400 μl buforu do lizy fCLIP uzupełnionego 0,2% (v/v) inhibitorem proteazy i 2% (v/v) inhibitorem RNazy. Inkubować na lodzie przez 10 minut i poddać sonizacji za pomocą ultradźwięków.
    5. Dodaj 11 μl 5 M NaCl, aby dostosować stężenie NaCl do ~150 mM. Krótko przemieszać i odwirować przy 21,130 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Zachować 40 μl supernatantu w nowej probówce wirówkowej jako próbkę wejściową. Próbkę wejściową należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Immunoprecypitacja
    1. Dodaj 20 μl kulek białka A do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Umyj kulki 400 μl buforu do lizy fCLIP. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do lizy fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.
    3. Powtórz krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant.
    4. Ponownie zawiesić kulki w 300 μl buforu do lizy fCLIP. Dodaj 8,3 μl 5 M NaCl, aby dostosować stężenie NaCl do ~150 mM. Dodać 10 μl przeciwciała PKR i inkubować przez 3 godziny na rotatorze w temperaturze 4 °C.
    5. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 400 μl buforu płuczącego fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.
    6. Powtórz krok prania dwa razy. Po ostatnim przemyciu całkowicie usunąć supernatant.
      UWAGA: Nigdy nie używaj miksera wirowego. Delikatnie odwróć rurkę rękami.
    7. Dodać 300 μl lizatu i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może skutkować zwiększonym wiązaniem tła.
    8. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 400 μl buforu płuczącego fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.
    9. Powtórz krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant.
    10. Dodać 300 μl buforu elucyjnego fCLIP. Inkubować w termomieszalniku przez 3 godziny w temperaturze 25 °C w celu wypłukania PKR z kulek.
      UWAGA: Przygotować bufor elucyjny fCLIP na świeżo.
    11. Odwirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do czystej silikonowanej probówki.
      UWAGA: Probówka do mikrowirówki jest również w porządku, ale preferowana jest rurka silikonowana, aby zapobiec parowaniu podczas etapu sieciowania (krok 2.3.12).
    12. Dodać 300 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.
      UWAGA: Użyj termomiksera z podgrzewaną pokrywą, aby uniknąć parowania.
  4. Ekstrakcja RNA
    1. Dodać 580 μl chloroformu kwasowo-fenolowego i wirować przez 30 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Wirować przez 30 s i wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitentu (np. Glycoblue) i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
    4. Wytrącić granulki przez odwirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 1 h.
      UWAGA: Jeśli nie zaobserwowano osadów RNA/DNA, dodaj dodatkowe 0,5 μl współrecipitantu i odwiruj przez dodatkowe 1 godzinę. Kontynuuj ten krok, aż zaobserwujesz osady RNA/DNA.
    5. Usunąć sklarowany osad i dodać 1 ml 75% alkoholu etylowego. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Powtórz krok prania jeszcze raz. Całkowicie usunąć supernatant i wysuszyć osad w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać 42 μl TDW, 5 μl buforu DNazy I, 1 μl inhibitora RNazy i 2 μl DNazy I. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    7. Dodać 150 μl TDW i 200 μl chloroformu kwasowo-fenolowego. Wir przez 30 s. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    8. Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μl współrecipitantu i 1 ml 100% alkoholu etylowego. Inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.
    9. Wytrącić granulki i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.
    10. Ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości TDW.

3. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

  1. Usuwanie rRNA
    1. Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 28 μl TDW.
      UWAGA: Maksymalna ilość całkowitego RNA powinna być mniejsza niż 5 μg.
    2. Postępuj zgodnie z procedurami zawartymi w przewodniku referencyjnym zestawu do usuwania rRNA, aby usunąć rRNA.
    3. Oczyść RNA zubożone w rRNA, dodając 160 μl kulek magnetycznych.
      1. Wymieszać pipetując ~15 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      2. Przymocuj rurkę do pręta magnetycznego i usuń supernatant.
      3. Dodaj 300 μl 80% alkoholu etylowego, gdy kulki są nadal przymocowane do pręta magnetycznego i inkubuj przez 30 sekund.
      4. Zastąp alkohol etylowy świeżym roztworem o pojemności 300 μl. Suszyć koraliki na pasku magnetycznym na powietrzu przez 12 minut w temperaturze pokojowej.
      5. Ponownie zawiesić kulki w 12 μl TDW i wymieszać pipetując 15 razy.
      6. Przymocuj koraliki do pręta magnetycznego i przenieś supernatant do czystej probówki do PCR.
    4. Zuboż pofragmentowane rybosomalne RNA (rRNA) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez zestaw do zubożania rRNA.
    5. Oczyść RNA, dodając 110 μl kulek magnetycznych i powtarzając kroki od 3.1.3.1 do 3.1.3.6.
  2. Znakowanie RNA i ligacja adaptora
    1. Na RNA zubożone w rRNA dodaj 2 μl 10x buforu, 1 μl inhibitora RNazy i 2 μl antarktycznej fosfatazy alkalicznej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu inaktywacji fosfatazy.
    2. Dodać 3 μl 10x buforu PNK, 1,5 μl inhibitora RNazy, 1,5 μl enzymu T4 PNK, 0,8 μl r-ATP i 1,7 μl TDW. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut.
    3. Dodać 1,5 μl 10 mM ATP i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 40 minut.
    4. Zatrzymać reakcję, dodając 170 μl buforu elucyjnego RNA.
    5. Dodać 200 μl chloroformu kwasowo-fenolowego i wirować przez 30 s. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    6. Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μl współrecipitantu i 1 ml 100% alkoholu etylowego. Inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.
    7. Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5. Ponownie zawiesić w 4,5 μl TDW i dodać 9 μl 2x barwnika ładującego RNA.
    8. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i nabrać 10% żelu Urea-PAGE.
    9. Uruchom żel pod napięciem 370 V przez 40 minut
      UWAGA: Przed załadowaniem próbki należy wstępnie uruchomić żel pod napięciem 370 V przez 90 minut.
    10. Przetnij żel w obszarze nukleotydów ~100 – 500 i rozbij żel.
    11. Dodać 700 μl 0,3 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
    12. Przenieść roztwór do kolumny i odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    13. Przenieść eluat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitu i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
  3. Podwiązanie adaptera 3'
    1. Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.
    2. Ponownie zawiesić granulki RNA w 6,5 μl TDW i dodać 1 μl adaptera 10 μM 3'.
    3. Przenieść roztwór do probówki do PCR i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty.
    4. Dodaj 1 μl 10x buforu ligacyjnego, 0,5 μl inhibitora RNazy i 1 μl ligazy T4 RNA 2. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, w temperaturze 25 °C przez 6 godzin i w temperaturze 22 °C przez 6 godzin.
    5. Dodać 12 μl barwnika ładującego 2x RNA i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    6. Żel oczyścić RNA zligowane przez adaptor 3', jak opisano w 3.2.9 do 3.2.13.
  4. Podwiązanie adaptera 5'
    1. Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.
    2. Ponownie zawieś granulki RNA w 4,2 μl TDW i dodaj 1 μl adaptera 5 μM 5'.
    3. Przenieść roztwór do probówki do PCR i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty.
    4. Dodać 0,8 μl 10x buforu ligazy, 0,4 μl inhibitora RNazy, 0,8 μl 10 mM ATP, 0,8 μl ligazy T4 RNA 1. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, w temperaturze 25 °C przez 6 godzin i w temperaturze 22 °C przez 6 godzin.
  5. Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR
    1. Na 5' ligafikowanych adaptorowo RNA dodaj 1 μl 4 μM startera do odwrotnej transkrypcji. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić do temperatury 4 °C.
    2. Dodaj 4 μl buforu 5x FS, 4 μl 2,5 mM dNTP, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę i w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
    3. Przygotuj amplifikację PCR
      1. Wymieszaj 1 μl produktu RT, 1 μl 25 μM startera RPI, 1 μL 25 μM startera RP1, 10 μL 5x buforu HF, 4 μL 2,5 mM dNTP, 32,5 μl TDW i 0,5 μl polimerazy o wysokiej wierności.
      2. Uruchom program PCR dla 11 ~ 13 cykli.
        UWAGA: Program dla PCR to: 98 °C przez 30 s dla gorącego startu, 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s dla amplifikacji i 72 °C przez 5 min. Krok amplifikacji powtarza się przez 11-13 cykli.
    4. Oczyść produkty PCR za pomocą 40 μl kulek magnetycznych i wykonując kroki 3.1.3.1 do 3.1.3.6, ale używając 10 μl TDW do elucji DNA.
    5. Dodaj 2 μl 10x barwnika ładującego DNA. Załadować próbkę na 6% żel akrylowy i pracować pod napięciem 200 V przez 30 minut.
    6. Bejcować złotem Sybr (0,01% (v/v) w 1x buforze TBE) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    7. Odbarwić w 1x bufor TBE przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Przeciąć żel w obszarze nukleotydów ~200 – 700 i rozbić żel.
    9. Dodać 700 μl 0,3 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w celu wymycia DNA.
    10. Załaduj wszystko do kolumny i wiruj z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    11. Przenieść eluat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitu i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
    12. Wytnij granulki DNA i przemyj 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5. Zawiesić ponownie w 20 μl TDW.
    13. Przeanalizuj próbkę za pomocą sekwencera.

4. Analiza RNA oddziałujących z PKR za pomocą qRT-PCR

  1. Metoda 1: Losowa odwrotna transkrypcja heksameru
    1. Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 8,5 μl TDW i przenieść roztwór do probówki PCR.
    2. Dodaj 0,5 μl 100 μM losowych heksamerów i 4 μl 2,5 mM mieszanki dNTP.
    3. Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast inkubować na lodzie przez co najmniej 1 minutę.
    4. Przygotuj mieszaninę reakcyjną: 4 μl 5x buforu SSIV, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Dodać mieszaninę reakcyjną do roztworu RNA.
    5. Inkubować mieszaninę w temperaturze 23 °C przez 10 min, w temperaturze 50 °C przez 10 min i w temperaturze 80 °C przez 10 min.
    6. Analizuj cDNA za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Program dla PCR w czasie rzeczywistym to: 95 °C przez 3 minuty dla gorącego startu, 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 10 s dla amplifikacji oraz 95 °C przez 30 s, 65 °C przez 30 s i 95 °C przez 30 s dla stopienia. Krok amplifikacji powtarza się przez 40 cykli.
  2. Metoda 2: Odwrotna transkrypcja specyficzna dla nici
    1. Przygotuj główną mieszankę starterów odwrotnych: Wymieszaj równe ilości specyficznych dla genu starterów odwrotnej transkrypcji zawierających sekwencję promotora CMV, a następnie ~20 nukleotydów sekwencji specyficznych dla genu.
      UWAGA: Łączne stężenie wszystkich starterów RT specyficznych dla genu wynosi 4 μM.
    2. Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 8,5 μl TDW i przenieść roztwór do probówki PCR.
    3. Dodać 0,5 μl 4 μM głównej mieszanki starterów do odwrotnej transkrypcji i 4 μl 2,5 mM mieszanki dNTP.
    4. Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast inkubować na lodzie przez co najmniej 1 minutę.
    5. Przygotować roztwór reakcyjny, mieszając 4 μl 5x buforu SSIV, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Dodać roztwór reakcyjny do mieszaniny RNA i startera.
    6. Inkubować roztwór w temperaturze 50 °C przez 10 minut i w temperaturze 80 °C przez 10 minut.
    7. Analizuj cDNA za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Program do PCR w czasie rzeczywistym jest taki sam jak ten opisany w Metodzie 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat procesu zatrzymywania komórek HeLa w fazie S lub M cyklu komórkowego przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku próbki zatrzymanej w fazie M pod mikroskopem można wyraźnie zobaczyć komórki o okrągłym kształcie (Rysunek 2A). Aby ocenić efektywność zatrzymania cyklu komórkowego, można przeanalizować zawartość jądrową komórek za pomocą FACS (Rysunek 2B). Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne dane z testu wydajności immu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Proces przygotowania próbek z zatrzymaną fazą S lub M przedstawiono na rysunku 1. Aby zatrzymać komórki w fazie S, zastosowaliśmy metodę podwójnego bloku tymidyny, w której dwukrotnie potraktowaliśmy komórki tymidyną z 9-godzinnym uwalnianiem pomiędzy nimi, aby zapewnić wysoką skuteczność zatrzymania (Figura 1A). W celu zatrzymania fazy M potraktowaliśmy komórki raz tymidyną, a następnie uwalnialiśmy 9 godzin, a następnie zastosowaliśmy nokodazol w celu zablokow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych rządu koreańskiego (NRF-2016R1C1B2009886).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7,0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9855G
Probówka do mikrowirówki 1,7 mlAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X bufor ładujący DNATaKaRa9157
15 mL rurka stożkowaSPL50015
adapter 3'5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3
M Octan sodu pH 5,5Thermo Fisher ScientificAM9740
5'adapter 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 ml rurka stożkowaSPL50050
Chloroform kwasowo-fenolowy, pH 4,5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Koraliki magnetyczne oczyszczanie
Antarktyda fosfataza alkalicznaNew England BiolabsM0289S
Anty-DGCR8Wykonane w domu
Anti-PKR (D7F7)Technologia sygnalizacji komórkowej12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Sól sodowa błękitu bromofenolowegoSigma-aldrichB5525
Fosfatazaalkaliczna jelitowa cielęciaTaKaRa2250A
Skrobak do komórek 25 cm 2-pozycyjnySarstedt83.183
CMV sekwencja5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Zmodyfikowane
podłoże orła DulbeccoWelgeneLM001-05
mieszanina dNTP (2,5 mM)TaKaRa4030
Etanol, absolutny, klasa ACSAlfa-AesarA9951
Płodowa surowica bydlęcaMerckM-TMS-013-BKR
FormamidMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg / ml)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext zestaw do deplecji rRNANew England BiolabsE6318Zestaw do usuwania rRNA
NokodazolSigma-AldrichM1404
Normalna technologia sygnalizacji komórekIgG królika2729S
ParaformaldehydSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
Starter odwrócony indeks PCR (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR
probówki z płaską nakrętką, 0,2 mlAxygenPCR-02-C
Tabletka z solą fizjologiczną (PBS)TaKaRaT9181
Phusion polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530Polimeraza
o wysokiej wiernościMikrowirówka PlateFuge z odchylanym wirnikiemBenchmarkc2000
Kinaza polinukleotydowa (PNK)TaKaRa2021A
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR SekwencjaSigma-Aldricha3115879001
qPCR: CO1 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja starterów qPCR: CO1 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-TTGAGGTTGCGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja starterów qPCR: CO2 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja starterów qPCR: CO2 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja starterów qPCR: CO3 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: CO3 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: CYTB Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: CYTB Światłodo przodu/do tyłu: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: GAPDHDo przodu/do tyłu: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND1 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND1 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND4 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND4 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND5 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND5 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND6 Ciężkido przodu/do tyłu: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sekwencja startera qPCR: ND6 Światłodo przodu/do tyłu: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Losowy heksamerThermo Fisher ScientificSO142
Rekombinowana Dnaza I (bez rnazy) (5 U/μ L)TaKaRa2270A
Rekombinowany inhibitor rnazy (40 U/μ L)TaKaRa2313A
Zestaw do usuwania rRNA Ribo-ZeroIlluminaMRZH116Zestaw do usuwania rRNA
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT sekwencja starterów: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGTCTGTTAG-3′
Sekwencja starterów RT: CO1 Light5&-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
Sekwencja starterów RT: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
Sekwencja starterów RT: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
Sekwencja starterów RT: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
Sekwencja starterów RT: CO3 Światło5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
Sekwencja starterów RT: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
Sekwencja starterów RT: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
Sekwencja starterów RT: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
Sekwencja starterów RT: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGATGATAAGGGGGGAGAGG-3′
Sekwencja starterów RT: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTCAACTACGCCCTG-3′
Sekwencja starterów RT: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTCAGATGG-3′
Sekwencja starterów RT: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
Sekwencja starterów RT: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGTGAGGTGATGATG-3′
Sekwencja starterów RT: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCCATCCACCTTTA-3′
Sekwencja starterów RT: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTGAGGTCTTGGTG-3′
Sekwencja starterów RT: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Silikonowany polipropylen 1,5 ml G-tubeBio Plas4167SLS50
Dedecylosiarczan soduBiosesangS1010
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
SUPERaza w inhibitorze RnazyThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III odwrotna transkryptazaThermo Fisher Scientific18080093Odwrotna transkryptaza do przygotowania biblioteki
Odwrotna transkryptaza SuperScript IVThermo Fisher Scientific18090010Odwrotna transkryptaza dla qRT-PCR
SYBR złoty kwas nukleinowy gl barwienieThermo Fisher ScientificS11494
Kinaza polinukleotydowa T4New England BiolabsM0201S
Ligaza 1 RNA T4 (Ligaza ssRNA)New England BiolabsM0204
T4 Ligaza RNA 2, obcięta KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C z ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Bufor tris-boran-EDTA (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Białko A kulki sefarozyThermo Fisher Scientific22810Kulki białka A
UltradźwiękiBioruptor
MocznikBio-basicUB0148
Mieszalnik wirowyDAIHAN ScientificVM-10
Ksylenowy cyjanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3,3 i mu; M)PerkinElmerBLU502A100UC
promotora startera

Bibliografia

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sieciowanie formaldehydemimmunoprecypitacjakom rki HeLazatrzymanie cyklu kom rkowegomitochondrialne RNAspecyficzna dla nici qRT PCRsekwencjonowanie wysokoprzepustowebia ka wi ce RNA
Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.