Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

Kinaza białkowa aktywowana RNA (PKR), znana również jako eukariotyczny czynnik inicjacji 2-alfa kinaza 2 (EIF2AK2), jest dobrze scharakteryzowaną kinazą białkową, która przekazuje informacje dostarczane przez RNA. Należy do rodziny kinaz kinazy alfa (eIF2α) podjednostki inicjacji translacji eukariotycznej 2 (eIF2α) i fosforyluje eIF2α w serynie 51 w odpowiedzi na infekcję, aby stłumić globalną translację¹. W tym kontekście, PKR jest aktywowany przez wirusowe dwuniciowe RNA (dsRNA), które stanowią platformę do dimeryzacji PKR i autofosforylacji². Oprócz eIF2α, PKR może również fosforylować p53, substrat receptora insuliny 1, inhibitor κB i kinazę N-końcową c-Jun (JNK) w celu regulacji aktywności wielu szlaków transdukcji sygnału^3,4,5,6.

PKR został pierwotnie zidentyfikowany jako kinaza, która fosforylowała eIF2α podczas infekcji wirusem polio, rozpoznając dsRNA wirusa polio^7,8. Coraz częściej stwierdza się, że PKR odgrywa wieloaspektową rolę poza odpowiedzią immunologiczną, a jego nieprawidłowa aktywacja lub nieprawidłowe działanie jest implikowane w wielu chorobach człowieka. Aktywowany/ufosforylowany PKR (pPKR) jest często obserwowany podczas apoptozy i jest powszechną cechą pacjentów z chorobami zwyrodnieniowymi, szczególnie chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Huntingtona, Parkinsona i choroba Alzheimera9^,10,11,12,13. Ponadto PKR jest aktywowany w różnych warunkach stresowych, takich jak stres metaboliczny i szok cieplny^14,15,16,17. Z drugiej strony, hamowanie PKR powoduje zwiększoną proliferację komórek, a nawet transformację złośliwą^18,19. Funkcja PKR jest również ważna w prawidłowym funkcjonowaniu mózgu i podczas cyklu komórkowego, ponieważ poziom pPKR jest podwyższony podczas fazy M^20,21,22. W tym kontekście, pPKR tłumi globalną translację i dostarcza wskazówek do kluczowych systemów sygnalizacji mitotycznej, które są wymagane do prawidłowego podziału komórki²⁰. Co więcej, przedłużona aktywacja PKR powodowała zatrzymanie cyklu komórkowego fazy G2/M w komórkach jajnika chomika chińskiego²³. W związku z tym fosforylacja PKR jest regulowana przez pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego, aby zapewnić szybką dezaktywację podczas przejścia M/G1²¹.

Pomimo szerokiego zakresu funkcji PKR, nasze zrozumienie aktywacji PKR jest ograniczone z powodu braku ustandaryzowanego, wysokoprzepustowego eksperymentalnego podejścia do wychwytywania i identyfikacji dsRNA, które mogą aktywować PKR. Wcześniejsze badania wykazały, że PKR może wchodzić w interakcje z dsRNA utworzonymi przez dwa odwrócone powtórzenia Alu (IRAlus)^20,24, ale możliwość istnienia dodatkowych komórkowych dsRNA, które mogą aktywować PKR podczas cyklu komórkowego lub w warunkach stresu w komórkach ludzkich, nie została zbadana. Konwencjonalne podejście do identyfikacji interaktorów RNA białka wiążącego RNA (RBP) wykorzystuje światło UV do sieciowania kompleksów RNA-RBP^25,26,27. W niedawnym badaniu zastosowano to podejście do sieciowania UV w systemie mysim i stwierdzono, że małe jąderkowe RNA mogą regulować aktywację PKR podczas stresu metabolicznego¹⁶. Wykorzystując wysoką skuteczność sieciowania formaldehydu, przedstawiliśmy alternatywną metodę identyfikacji RNA oddziałujących z PKR podczas cyklu komórkowego w komórkach HeLa²⁸. Podobne podejście zastosowano do badania innych dsRBP, takich jak Staufen i Drosha^29,30,31. Odkryliśmy, że PKR może wchodzić w interakcje z różnymi typami niekodujących RNA, takimi jak krótki przeplatany element jądrowy (SINE), długi przeplatany element jądrowy (LINE), endogenny element retrowirusowy (ERV), a nawet alfa-satelitarne RNA. Ponadto wykazaliśmy, że PKR może wchodzić w interakcje z mitochondrialnymi RNA (mtRNA), które tworzą międzycząsteczkowe dsRNA poprzez komplementarną interakcję między ciężką i lekką nicią RNAs²⁸. Niedawna publikacja dodatkowo potwierdziła nasze dane, że niektóre mtRNA istnieją w formie dupleksu i mogą aktywować czujniki dsRNA, takie jak białko 5 związane z różnicowaniem czerniaka, w celu indukcji interferonów³². Co ważniejsze, ekspresja i subkomórkowa lokalizacja mtRNA są modulowane podczas cyklu komórkowego i przez różne stresory, co może być ważne dla ich zdolności do regulowania aktywacji PKR²⁸.

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół dla niedawno opracowanej metody sieciowania i immunoprecypitacji formaldehydu (fCLIP) do wychwytywania i analizowania RNA oddziałujących z PKR podczas cyklu komórkowego. Przedstawiono metodę przygotowania próbek zatrzymania cyklu komórkowego przy użyciu tymidyny i nokodazolu. Następnie przedstawiamy proces fCLIP do izolacji RNA związanych z PKR oraz metodę przygotowania wysokoprzepustowej biblioteki sekwencjonowania w celu identyfikacji tych RNA. Ponadto określamy szczegółowe procedury analizy RNA związanych z PKR za pomocą qRT-PCR. W szczególności przedstawiamy specyficzną dla nici procedurę odwrotnej transkrypcji w celu analizy nici mtRNA. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek HeLa i PKR, ale kluczowe etapy, takie jak przygotowanie próbki cyklu komórkowego, fCLIP i analiza qRT-PCR specyficzna dla nici, można łatwo zmodyfikować w celu zbadania komórkowych dsRNA lub identyfikacji interaktorów RNA innych dsRBP.

1. Przygotowanie roztworu i komórek

1. Przygotowanie roztworu
   1. W przypadku pożywki do hodowli komórkowych należy przygotować pożywkę do hodowli komórek HeLa, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
      UWAGA: Do pożywki do hodowli komórkowych można dodawać antybiotyki, ale nie używamy antybiotyków.
   2. W przypadku 0,1% paraformaldehydu rozpuść 4% (w/v) paraformaldehydu w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z ogrzewaniem na płycie grzejnej i rozcieńczyć do uzyskania 30 ml 0,1% (v/v) paraformaldehydu, dodając 1x PBS.
      UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w dygestoriach i uważaj, aby nie zagotować roztworu paraformaldehydu. Chronić 0,1% roztwór przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór zużyć w ciągu jednego miesiąca.
      UWAGA: pH końcowego 0,1% (v/v) roztworu paraformaldehydu powinno wynosić około 7.
   3. Przygotuj bufor do lizy fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) dodecylosiarczan sodu (SDS) i 0,1% (w/v) deoksycholan sodu. Dodaj potrójnie destylowaną wodę (TDW) do 40 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   4. Przygotuj bufor płuczący fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS i 0,1% (w/v) deoksycholan sodu. Dodaj TDW do 40 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotuj 4x bufor PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA i 4% (v/v) SDS. Dodaj TDW do 40 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   6. Przygotować bufor elucyjny fCLIP: 20 ml 4x buforu PK, 21 g mocznika i 8,5 ml TDW. Przygotuj świeże.
   7. Przygotować bufor elucyjny RNA: 0,3 M NaOAc i 2% (w/v) SDS. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   8. Przygotuj 2x barwnik ładujący RNA: 0,025% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,025% (w/v) cyjanol ksylenowy, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) SDS i 95% (v/v) formamid. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
   9. Przygotować 1x bufor TBE: 0,089 M tris-boranu i 0,002 M EDTA. Przygotować 500 ml buforu do KZM
   .
2. Przygotowanie komórek z zatrzymaniem fazy S lub M
   1. Zasiewaj ~ 750 000 lub ~ 1 000 000 komórek HeLa odpowiednio dla próbek zatrzymanych w fazie S lub M. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny.
   2. Potraktować komórki 2 mM tymidyny i inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.
   3. Umyj komórki dwa razy PBS. Dodać świeżą pożywkę i inkubować przez 9 godzin w temperaturze 37 °C.
   4. W przypadku komórek z zatrzymaną fazą S potraktuj komórki 2 mM tymidyną. W przypadku komórek z zatrzymaną fazą M należy potraktować komórki nokodazolem w stężeniu 100 ng/ml. Inkubować przez 15 godzin w temperaturze 37 °C i zbierać komórki.
      UWAGA: Jednorodność próbek cyklu komórkowego można sprawdzić za pomocą FACS.

2. Sieciowanie formaldehydu i immunoprecypitacja

1. Pobieranie komórek
   1. W przypadku próbki w fazie S zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. W przypadku próbki w fazie M postukaj w bok naczynia do hodowli komórkowej, aby odłączyć komórki zatrzymane w fazie M i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Aby zwiększyć jednorodność ogniw z zatrzymaniem fazy M, nie należy używać skrobaka do komórek.
   2. Odwirować komórki w temperaturze 380 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 1 ml zimnego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
   3. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Całkowicie usunąć supernatant.
2. Sieciowanie formaldehydu
   1. Dodaj 750 μl 0,1% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.
   2. Dodać 250 μl 1 M glicyny i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia reakcji. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Całkowicie usunąć supernatant.
   3. Ponownie zawiesić za pomocą 1 ml PBS. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s i usunąć supernatant.
   4. Zawiesić za pomocą 400 μl buforu do lizy fCLIP uzupełnionego 0,2% (v/v) inhibitorem proteazy i 2% (v/v) inhibitorem RNazy. Inkubować na lodzie przez 10 minut i poddać sonizacji za pomocą ultradźwięków.
   5. Dodaj 11 μl 5 M NaCl, aby dostosować stężenie NaCl do ~150 mM. Krótko przemieszać i odwirować przy 21,130 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Zachować 40 μl supernatantu w nowej probówce wirówkowej jako próbkę wejściową. Próbkę wejściową należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Immunoprecypitacja
   1. Dodaj 20 μl kulek białka A do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   2. Umyj kulki 400 μl buforu do lizy fCLIP. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do lizy fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.
   3. Powtórz krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant.
   4. Ponownie zawiesić kulki w 300 μl buforu do lizy fCLIP. Dodaj 8,3 μl 5 M NaCl, aby dostosować stężenie NaCl do ~150 mM. Dodać 10 μl przeciwciała PKR i inkubować przez 3 godziny na rotatorze w temperaturze 4 °C.
   5. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 400 μl buforu płuczącego fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.
   6. Powtórz krok prania dwa razy. Po ostatnim przemyciu całkowicie usunąć supernatant.
      UWAGA: Nigdy nie używaj miksera wirowego. Delikatnie odwróć rurkę rękami.
   7. Dodać 300 μl lizatu i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może skutkować zwiększonym wiązaniem tła.
   8. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 400 μl buforu płuczącego fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.
   9. Powtórz krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant.
   10. Dodać 300 μl buforu elucyjnego fCLIP. Inkubować w termomieszalniku przez 3 godziny w temperaturze 25 °C w celu wypłukania PKR z kulek.
       UWAGA: Przygotować bufor elucyjny fCLIP na świeżo.
   11. Odwirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do czystej silikonowanej probówki.
       UWAGA: Probówka do mikrowirówki jest również w porządku, ale preferowana jest rurka silikonowana, aby zapobiec parowaniu podczas etapu sieciowania (krok 2.3.12).
   12. Dodać 300 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.
       UWAGA: Użyj termomiksera z podgrzewaną pokrywą, aby uniknąć parowania.
4. Ekstrakcja RNA
   1. Dodać 580 μl chloroformu kwasowo-fenolowego i wirować przez 30 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   2. Wirować przez 30 s i wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   3. Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitentu (np. Glycoblue) i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
   4. Wytrącić granulki przez odwirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 1 h.
      UWAGA: Jeśli nie zaobserwowano osadów RNA/DNA, dodaj dodatkowe 0,5 μl współrecipitantu i odwiruj przez dodatkowe 1 godzinę. Kontynuuj ten krok, aż zaobserwujesz osady RNA/DNA.
   5. Usunąć sklarowany osad i dodać 1 ml 75% alkoholu etylowego. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Powtórz krok prania jeszcze raz. Całkowicie usunąć supernatant i wysuszyć osad w temperaturze pokojowej.
   6. Dodać 42 μl TDW, 5 μl buforu DNazy I, 1 μl inhibitora RNazy i 2 μl DNazy I. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   7. Dodać 150 μl TDW i 200 μl chloroformu kwasowo-fenolowego. Wir przez 30 s. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
   8. Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μl współrecipitantu i 1 ml 100% alkoholu etylowego. Inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.
   9. Wytrącić granulki i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.
   10. Ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości TDW.

3. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

1. Usuwanie rRNA
   1. Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 28 μl TDW.
      UWAGA: Maksymalna ilość całkowitego RNA powinna być mniejsza niż 5 μg.
   2. Postępuj zgodnie z procedurami zawartymi w przewodniku referencyjnym zestawu do usuwania rRNA, aby usunąć rRNA.
   3. Oczyść RNA zubożone w rRNA, dodając 160 μl kulek magnetycznych.
      1. Wymieszać pipetując ~15 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      2. Przymocuj rurkę do pręta magnetycznego i usuń supernatant.
      3. Dodaj 300 μl 80% alkoholu etylowego, gdy kulki są nadal przymocowane do pręta magnetycznego i inkubuj przez 30 sekund.
      4. Zastąp alkohol etylowy świeżym roztworem o pojemności 300 μl. Suszyć koraliki na pasku magnetycznym na powietrzu przez 12 minut w temperaturze pokojowej.
      5. Ponownie zawiesić kulki w 12 μl TDW i wymieszać pipetując 15 razy.
      6. Przymocuj koraliki do pręta magnetycznego i przenieś supernatant do czystej probówki do PCR.
   4. Zuboż pofragmentowane rybosomalne RNA (rRNA) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez zestaw do zubożania rRNA.
   5. Oczyść RNA, dodając 110 μl kulek magnetycznych i powtarzając kroki od 3.1.3.1 do 3.1.3.6.
2. Znakowanie RNA i ligacja adaptora
   1. Na RNA zubożone w rRNA dodaj 2 μl 10x buforu, 1 μl inhibitora RNazy i 2 μl antarktycznej fosfatazy alkalicznej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu inaktywacji fosfatazy.
   2. Dodać 3 μl 10x buforu PNK, 1,5 μl inhibitora RNazy, 1,5 μl enzymu T4 PNK, 0,8 μl r-ATP i 1,7 μl TDW. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut.
   3. Dodać 1,5 μl 10 mM ATP i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 40 minut.
   4. Zatrzymać reakcję, dodając 170 μl buforu elucyjnego RNA.
   5. Dodać 200 μl chloroformu kwasowo-fenolowego i wirować przez 30 s. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
   6. Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μl współrecipitantu i 1 ml 100% alkoholu etylowego. Inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.
   7. Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5. Ponownie zawiesić w 4,5 μl TDW i dodać 9 μl 2x barwnika ładującego RNA.
   8. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i nabrać 10% żelu Urea-PAGE.
   9. Uruchom żel pod napięciem 370 V przez 40 minut
      UWAGA: Przed załadowaniem próbki należy wstępnie uruchomić żel pod napięciem 370 V przez 90 minut.
   10. Przetnij żel w obszarze nukleotydów ~100 – 500 i rozbij żel.
   11. Dodać 700 μl 0,3 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
   12. Przenieść roztwór do kolumny i odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   13. Przenieść eluat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitu i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
3. Podwiązanie adaptera 3'
   1. Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.
   2. Ponownie zawiesić granulki RNA w 6,5 μl TDW i dodać 1 μl adaptera 10 μM 3'.
   3. Przenieść roztwór do probówki do PCR i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty.
   4. Dodaj 1 μl 10x buforu ligacyjnego, 0,5 μl inhibitora RNazy i 1 μl ligazy T4 RNA 2. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, w temperaturze 25 °C przez 6 godzin i w temperaturze 22 °C przez 6 godzin.
   5. Dodać 12 μl barwnika ładującego 2x RNA i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
   6. Żel oczyścić RNA zligowane przez adaptor 3', jak opisano w 3.2.9 do 3.2.13.
4. Podwiązanie adaptera 5'
   1. Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.
   2. Ponownie zawieś granulki RNA w 4,2 μl TDW i dodaj 1 μl adaptera 5 μM 5'.
   3. Przenieść roztwór do probówki do PCR i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty.
   4. Dodać 0,8 μl 10x buforu ligazy, 0,4 μl inhibitora RNazy, 0,8 μl 10 mM ATP, 0,8 μl ligazy T4 RNA 1. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, w temperaturze 25 °C przez 6 godzin i w temperaturze 22 °C przez 6 godzin.
5. Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR
   1. Na 5' ligafikowanych adaptorowo RNA dodaj 1 μl 4 μM startera do odwrotnej transkrypcji. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić do temperatury 4 °C.
   2. Dodaj 4 μl buforu 5x FS, 4 μl 2,5 mM dNTP, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę i w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
   3. Przygotuj amplifikację PCR
      1. Wymieszaj 1 μl produktu RT, 1 μl 25 μM startera RPI, 1 μL 25 μM startera RP1, 10 μL 5x buforu HF, 4 μL 2,5 mM dNTP, 32,5 μl TDW i 0,5 μl polimerazy o wysokiej wierności.
      2. Uruchom program PCR dla 11 ~ 13 cykli.
         UWAGA: Program dla PCR to: 98 °C przez 30 s dla gorącego startu, 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s dla amplifikacji i 72 °C przez 5 min. Krok amplifikacji powtarza się przez 11-13 cykli.
   4. Oczyść produkty PCR za pomocą 40 μl kulek magnetycznych i wykonując kroki 3.1.3.1 do 3.1.3.6, ale używając 10 μl TDW do elucji DNA.
   5. Dodaj 2 μl 10x barwnika ładującego DNA. Załadować próbkę na 6% żel akrylowy i pracować pod napięciem 200 V przez 30 minut.
   6. Bejcować złotem Sybr (0,01% (v/v) w 1x buforze TBE) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   7. Odbarwić w 1x bufor TBE przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przeciąć żel w obszarze nukleotydów ~200 – 700 i rozbić żel.
   9. Dodać 700 μl 0,3 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w celu wymycia DNA.
   10. Załaduj wszystko do kolumny i wiruj z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   11. Przenieść eluat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitu i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
   12. Wytnij granulki DNA i przemyj 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5. Zawiesić ponownie w 20 μl TDW.
   13. Przeanalizuj próbkę za pomocą sekwencera.

4. Analiza RNA oddziałujących z PKR za pomocą qRT-PCR

1. Metoda 1: Losowa odwrotna transkrypcja heksameru
   1. Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 8,5 μl TDW i przenieść roztwór do probówki PCR.
   2. Dodaj 0,5 μl 100 μM losowych heksamerów i 4 μl 2,5 mM mieszanki dNTP.
   3. Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast inkubować na lodzie przez co najmniej 1 minutę.
   4. Przygotuj mieszaninę reakcyjną: 4 μl 5x buforu SSIV, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Dodać mieszaninę reakcyjną do roztworu RNA.
   5. Inkubować mieszaninę w temperaturze 23 °C przez 10 min, w temperaturze 50 °C przez 10 min i w temperaturze 80 °C przez 10 min.
   6. Analizuj cDNA za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Program dla PCR w czasie rzeczywistym to: 95 °C przez 3 minuty dla gorącego startu, 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 10 s dla amplifikacji oraz 95 °C przez 30 s, 65 °C przez 30 s i 95 °C przez 30 s dla stopienia. Krok amplifikacji powtarza się przez 40 cykli.
2. Metoda 2: Odwrotna transkrypcja specyficzna dla nici
   1. Przygotuj główną mieszankę starterów odwrotnych: Wymieszaj równe ilości specyficznych dla genu starterów odwrotnej transkrypcji zawierających sekwencję promotora CMV, a następnie ~20 nukleotydów sekwencji specyficznych dla genu.
      UWAGA: Łączne stężenie wszystkich starterów RT specyficznych dla genu wynosi 4 μM.
   2. Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 8,5 μl TDW i przenieść roztwór do probówki PCR.
   3. Dodać 0,5 μl 4 μM głównej mieszanki starterów do odwrotnej transkrypcji i 4 μl 2,5 mM mieszanki dNTP.
   4. Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast inkubować na lodzie przez co najmniej 1 minutę.
   5. Przygotować roztwór reakcyjny, mieszając 4 μl 5x buforu SSIV, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Dodać roztwór reakcyjny do mieszaniny RNA i startera.
   6. Inkubować roztwór w temperaturze 50 °C przez 10 minut i w temperaturze 80 °C przez 10 minut.
   7. Analizuj cDNA za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Program do PCR w czasie rzeczywistym jest taki sam jak ten opisany w Metodzie 1.

Schemat procesu zatrzymywania komórek HeLa w fazie S lub M cyklu komórkowego jest pokazany na rysunku 1. W przypadku próbki z zatrzymaną fazą M możemy wyraźnie zwizualizować komórki o okrągłym kształcie pod mikroskopem (ryc. 2A). Aby zbadać skuteczność zatrzymania cyklu komórkowego, zawartość jądrową w komórce można przeanalizować za pomocą FACS (rysunek 2B). Rycina 3 przedstawia reprezentatywne dane dla testu skuteczności immunoprecypitacji, w którym przeciwciało D7F7 wykazuje lepszą zdolność do immunoprecypitacji PKR. Ta różnica w skuteczności immunoprecypitacji mogła być odzwierciedlona w rozbieżności w rozkładzie klas wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania przygotowanych przy użyciu dwóch różnych przeciwciał PKR (Figura 4). Swoistość przeciwciała D7F7 jest dodatkowo potwierdzana za pomocą zachodniej analizy całego blot immunoprecypitatu PKR (Figura 5A) i całkowitego lizatu komórkowego (Figura 5B). Rysunek 6 przedstawia sygnał radioizotopowy przed i po usunięciu rRNA podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Rycina 7 przedstawia wzbogacenie mtRNA w RNA równoimmunoprecypitowane z PKR, ale nie w RNA współimmunoprecypitowane z króliczą IgG lub regionem chromosomalnym 8 zespołu DiGeorge'a (DGCR8). Rysunek 8 przedstawia reprezentatywną analizę qRT-PCR specyficzną dla nici mtRNA związanych z PKR w próbkach zatrzymanych w fazie S lub M.

Rysunek 1: Schemat przygotowania próbek zatrzymujących cykl komórkowy. (A, B) Schematy przygotowania komórek HeLa S (A) lub M (B) z zatrzymaniem fazy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza próbek zatrzymanych w cyklu komórkowym. (A) Obrazy kontrastu fazowego próbek S lub M z zatrzymaniem fazy. Słupki wskazują 250 μm. (B) Analiza FACS pokazująca zawartość jądra w próbkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Test skuteczności immunoprecypitacji dla przeciwciał PKR. W celu pomyślnego wzbogacenia RNA związanych z PKR należy zastosować przeciwciało o ostatecznej skuteczności immunoprecypitacji, takie jak przeciwciało D7F7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rozkład klas RNA bibliotek sekwencjonowania przygotowanych przy użyciu różnych przeciwciał PKR. Użycie różnych przeciwciał PKR dla fCLIP skutkowało różnym rozkładem klas zmapowanych odczytów sekwencjonowania. Rozbieżność wynika prawdopodobnie z różnic w skuteczności immunoprecypitacji. Ten rysunek został zmodyfikowany z Kim et al.28. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Swoistość przeciwciała Pkr-D7F7. (A, B) Zachodnia analiza całego blot immunoprecypitowanego PKR (A) lub całkowitego lizatu HeLa (B) wykazała tylko jedno silne prążko odpowiadające wielkości PKR, co wskazuje, że przeciwciało D7F7 jest wysoce specyficzne w rozpoznawaniu PKR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 6: Sygnał radioizotopowy dla koimmunoprecypitowanych RNA PKR. (A) Koimmunoprecypitowane RNA PKR można wykryć, znakując ich końce 5' za pomocą r-ATP. (B) Po pomyślnym usunięciu rRNA zaobserwowano zmniejszenie sygnału radioistope. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Walidacja oddziaływań PKR-mtRNA. Logarytmiczne2-krotne wzbogacenie mtRNA w RNA współimmunoprecypitowane ze wskazanymi przeciwciałami. Tylko próbka RNA współimmunoprecypitowanego PKR wykazała silne wzbogacenie mtRNA. Jako kontrole ujemne zastosowano królicze przeciwciała IgG i DGCR8. Ten rysunek został zmodyfikowany z Kim et al.28. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Specyficzna dla nici analiza qRT-PCR mtRNA związanych z PKR. (A, B) Odwrotna transkrypcja specyficzna dla nici została wykorzystana do analizy nici mtRNA, które były równoimmunoprecypitowane z PKR dla komórek zatrzymanych w fazie S (A) lub M (B). Ten rysunek został zmodyfikowany z Kim et al.28. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.