Artykuł metodologiczny

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

DOI:

10.3791/59220

⸱

9 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne badanie przesiewowe leków dla układu nerwowego na odpowiednim i wiarygodnym modelu BBB w celulonie pod kątem ich penetracji i interakcji z barierą i miąższem mózgu jest nadal niezaspokojoną potrzebą. Aby wypełnić tę lukę, zaprojektowaliśmy model 2D z celulo, BBB-Minibrain, łącząc kulturę z poliestrowej porowatej membrany z ludzkim modelem BBB z Minimózgiem utworzonym przez trójkulturę ludzkich komórek mózgowych (neuronów, astrocytów i komórek mikrogleju). BBB-Minibrain pozwolił nam przetestować transport kandydata na lek neuroprotekcyjny (np. Neurovita) przez barierę krew-mózg, aby określić specyficzne ukierunkowanie tej cząsteczki na neurony i pokazać, że właściwości neuroprotekcyjne leku zostały zachowane po przekroczeniu bariery krew-mózg. Wykazaliśmy również, że BBB-Minibrain stanowi interesujący model do wykrywania przechodzenia cząsteczek wirusa przez barierę komórek śródbłonka i monitorowania infekcji Minibrain przez neuroinwazyjne cząsteczki wirusa. BBB-Minibrain to niezawodny system, łatwy w obsłudze dla badaczy przeszkolonych w technologii hodowli komórkowych i przewidujący fenotypy komórek mózgowych po leczeniu lub zniewadze. Zainteresowanie takimi badaniami na bazie celulo byłoby dwojakie: z jednej strony wprowadzenie etapów zmniejszania ryzyka na wczesnym etapie opracowywania leku, a z drugiej strony ograniczenie stosowania testów na zwierzętach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg jest oddzielony od krążenia ogólnoustrojowego przez nieprzepuszczalną strukturę, która ogranicza wymianę między miąższem mózgu a krwią, zwaną barierą krew-mózg (BBB). Zbudowany głównie z komórek śródbłonka mózgu, BBB dynamicznie oddziałuje z astrocytami, mikroglejem okołonaczyniowym i neuronami sąsiedniego miąższu mózgu. Trzy główne funkcje bariery krew-mózg to tworzenie i utrzymywanie homeostazy jonowej dla funkcji neuronalnych, zaopatrzenie mózgu w składniki odżywcze oraz ochrona przed toksycznymi urazami lub wnikaniem patogenów1,2, które przyczyniają się do utrzymania homeostazy mózgu i jego funkcji3. Bariera ta jest tak skuteczna, że tylko nieliczne leki mogą przekroczyć BBB4,5. Obecnie dostępne metody przewidywania, czy cząsteczka przejdzie przez barierę krew-mózg i dyfundują do mózgu, obejmują badania ex vivo materiału autopsyjnego, śledzenie obrazu w mózgu ochotników za pomocą MRI (rezonans magnetyczny) lub PET (pozycjonowa tomografia emisyjna) lub farmakodynamika i farmakokinetyczne badania przedkliniczne na zwierzętach6,7,8. Te techniki i modele mają pewne ograniczenia, takie jak ograniczona rozdzielczość PET i niska czułość MRI6,8, trudność w ilościowym określeniu cząsteczek (np. cząsteczek opartych na przeciwciałach), które słabo przenikają do mózgu7, a w przypadku badań przedklinicznych ich wysoki koszt i konieczność przeprowadzenia testów na zwierzętach.

Ostatni punkt jest ważny, ponieważ, zgodnie z zasadami 3R (zastąpienie, ograniczenie i udoskonalenie testów na zwierzętach), administracje regulacyjne poprosiły badaczy o pilne opracowanie naukowo dokładnej alternatywy dla eksperymentów na zwierzętach9,10,11,12,13,14,15.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci zaproponowano kilka modeli BBB in vitro16,17,18 poprzez hodowlę na wkładkach membranowych komórek śródbłonka różnych gatunków, takich jak myszy, szczury, bydło i świnie. Jeśli chodzi o gatunek ludzki, rzadka i trudna dostępność komórek pierwotnych skłoniła naukowców do opracowania modeli ludzkich opartych na unieśmiertelnionych komórkach śródbłonka mózgu lub komórkach macierzystych pochodzenia ludzkiego19,20,21. Bariery te są właściwymi substytutami BBB in vitro, pod warunkiem, że wyrażają markery komórek śródbłonka, markery połączeń ścisłych, transportery wypływu, nośniki substancji rozpuszczonej, receptory i reagują na bodźce śródbłonka 20. Przebadano kilka modeli BBB wykorzystujących wkładki membrany filtracyjnej pokryte komórkami śródbłonka i innymi typami komórek (tj. astrocytami, neuronami lub perycytami22,23,24). Celem tych kokultur było zwiększenie cech fizycznych bariery krew-mózg poprzez wykorzystanie wydzielania rozpuszczalnych czynników przez astrocyty/neurony lub perycyty.

Niemniej jednak, żaden z tych modeli nie zawiera miąższu mózgu do badania i przewidywania losu kandydata na lek, gdy już przekroczy barierę. Dlatego naszym celem było zbudowanie komórkowego interfejsu krew/mózg, BBB-Minibrain, poprzez połączenie modelu BBB i kultury mieszanych komórek mózgowych w jednym zestawie. BBB-Minibrain wykorzystuje system hodowli składający się z porowatego filtra umieszczonego w studzience wielodołkowej płytki do hodowli komórkowej. Filtr jest pokryty komórkami hCMEC/D3, linią komórkową śródbłonka ludzkiego mózgu, która okazała się wysoce wiarygodna w testach na obecność narkotyków w BBB25,26,27, w celu utworzenia BBB. Minimózg, który jest współzróżnicowaną kulturą ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z linii komórkowej NTera/Cl2.D128,29 zmieszany razem z ludzką linią komórek mikrogleju CHME/Cl530 w stosunku odpowiadającym stosunkom mikrogleju do neuronów-astrocytów mózgu31, jest dobrze uprawiany na dnie płytki.

Oprócz badania przepływu leków przez barierę krew-mózg i ich losu w miąższu, interfejs krew-mózg w modelu celulo może być potężnym narzędziem do rozwiązania problemu wnikania patogenów do mózgu (neuroinwazyjność), dyspersji do mózgu (neurotropizm) i toksyczności (neurowirulencji), jaką mogą wywierać na komórki miąższowe mózgu. Badania nad neurowirulencją i inwazyjnością neuroinwazyjną przyniosłyby korzyści dzięki opracowaniu wydajnego modelu w celulo i byłyby korzystne w zastąpieniu modeli zwierzęcych. Korzystając z zestawu BBB-Minibrain32, zademonstrowaliśmy neuroinwazyjny fenotyp rzadkich mutantów wirusowych, które nagromadziły się we francuskim szczepie wirusa neurotropowego wirusa żółtej gorączki (tj. FNV-YFV33,34) użytym do przygotowania wycofanej żywej szczepionki YFV oraz przejścia neuroregeneracyjnej i neuroprotekcyjnej biomolekuły o nazwie Neurovita (zwanej dalej NV w manuskrypcie)35. Ponieważ NV nie przenika naturalnie przez błonę komórkową ani przez barierę krew-mózg, NV został połączony ze zmienną częścią (VHH) jednołańcuchowego przeciwciała lamy, które przenika przez błony biologiczne, w tym BBB, i działa jako cząsteczka penetrująca komórkę (CPM)36. Właściwość CPM VHH wydaje się zależeć od punktu izoelektrycznego i długości VHH37.

Ten test w celulo powinien umożliwić sortowanie cząsteczek, które potencjalnie mogłyby przekroczyć barierę krew-mózg przed przeprowadzeniem analizy farmakokinetycznej i farmakodynamicznej u zwierząt, a najlepiej w tym samym czasie, aby móc przewidzieć ich zachowanie w miąższu nerwowym. Ten system jest biologicznie istotny i łatwy do skonfigurowania i obsługi przez profesjonalistów dobrze wyszkolonych w hodowlach komórkowych26,29,30,38. Zainteresowanie takimi badaniami na celulo byłoby dwojakie: z jednej strony zmniejszenie kosztów badań przedklinicznych, a z drugiej ograniczenie stosowania testów na zwierzętach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Praca nad hodowlą komórkową Ntera/CL2. D1 w celu przygotowania kohodowli post-mitotycznych hNeuronów i hAstrocytów (NT2-N/A)

UWAGA: To jest komponent Minibrain (Rysunek 1).

  1. Hodowla Ntera/Cl2.D1
    1. Wyjąć fiolkę z zamrożonymi komórkami ze zbiornika z ciekłym azotem. Trzymaj na lodzie.
    2. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Przenieś komórki do 15 ml probówki zawierającej 10 ml kompletnej pożywki DMEM F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 medium) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy, 100 j.m. penicyliny i 100 μg streptomycyny (tj. kompletnej pożywki DMEM F12).
    4. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Dysocjować osad w 2 ml kompletnego podłoża DMEM F12.
    5. Przenieść do kolby do hodowli tkankowej T75 w polistyrenie ze specjalną obróbką dla wrażliwych komórek adherentnych (T75Cell+) zawierającej 13 ml kompletnej pożywki DMEM F12.
    6. Hodowle komórek w inkubatorze utrzymywane w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% aż do 90% konfluencji (tj. około 5 dni). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
  2. Hodowla Ntera/Cl2.D1 i amplifikacja
    1. Usunąć podłoże z kolby.
    2. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) uzupełnionej Ca2+ i Mg2+.
    3. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml roztworu EDTA (utrzymywanego w temperaturze pokojowej).
    4. Dodać 3 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny, 0,02% EDTA) i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Potrząsnąć kolbą i upewnić się, że komórki są oderwane od plastikowej powierzchni.
    6. Dodać 10 ml kompletnej pożywki DMEM F12 w celu dezaktywacji trypsyny, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej.
    7. Oddzielić osad od 10 ml kompletnej pożywki i użyć 1 ml do zaszczepienia każdej nowej kolby zawierającej 14 ml kompletnej pożywki DMEM F12.
      UWAGA: Do każdego różnicowania wymagane jest trzydzieści kolb T75 Cell+.
    8. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% aż do 90% konfluencji.
  3. Różnicowanie NTera/Cl2.D1 w ludzkiej kokulturze neuron-astrocyty
    UWAGA: Jest to główny komponent Minibrain.
    1. W dniu 0 należy dysocjować komórki za pomocą trypsyny-EDTA, jak opisano w kroku 1.2 i dysocjować osad komórkowy z każdej kolby za pomocą 2 ml kompletnej pożywki DMEM F12.
    2. Dodać 1 ml zawiesiny komórek (co odpowiada 5 x 106 komórek) do 60 plastikowych szalek Petriego o średnicy 85 mm zawierających 11 ml kompletnej pożywki DMEM F12.
      UWAGA: Komórki nie przyczepią się do plastiku i będą się agregować, tworząc pseudo neurosfery (patrz zdjęcie w dolnym panelu Rysunek 1). Inkubować 60 szalek Petriego w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez jeden dzień.
    3. W dniu 1 dodać 1 ml kompletnej pożywki DMEM F12 uzupełnionej 130 μM kwasu all-trans retinowego (ATRA) na szalkę Petriego (końcowe stężenie ATRA 10 μM) i przywrócić szalki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 24 godziny.
    4. W dniu 2 bardzo ostrożnie przenieść pożywkę zawierającą kulki komórkowe każdej płytki Petriego do probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 10 minut przy 50 x g i RT. Ostrożnie odciąć luźny osad za pomocą 13 ml kompletnej pożywki DMEM F12 uzupełnionej 10 μM ATRA i dodać 13 ml do nowej szalki Petriego o średnicy 85 mm.
      UWAGA: Na różnych przejściach niezwykle ważne jest utrzymanie gęstości sfer na tak wysokim poziomie, jak gęstość uzyskana w Dniu 2 (tj. gęstość około 70%). Dlatego, jeśli gęstość kuli maleje, zmniejsz całkowitą liczbę szalek Petriego zgodnie z liczbą komórek.
    5. Powtórz powyższą procedurę (krok 1.3.4) w dniach 4, 6 i 8.
    6. W dniu 10 powtórz powyższą procedurę, ale dodaj kulki do kolb T75 Cell+ zamiast szalek Petriego. Dodać komórki z jednej płytki Petriego do jednej kolby T75 Cell+.
    7. W dniach 11, 13, 15 i 17 zmień użytą pożywkę na 14 ml kompletnego DMEM F12 uzupełnionego 10 μM ATRA.
    8. W dniu 19 należy zmienić pożywkę na 14 ml kompletnej pożywki DMEM F12 bez ATRA na kolbę.
    9. W dniu 20 delikatnie dysocjuj komórki za pomocą trypsyny/EDTA w następujący sposób.
      1. Dla każdej kolby T75 Cell+ przepłukać komórki 10 ml PBS uzupełnionego Ca2+ i Mg2+; inkubować komórki z 4 ml EDTA przez 5 minut w temperaturze suchej stężenia.
      2. Ostrożnie usunąć EDTA i dodać 2 ml trypsyny-EDTA i inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Bardzo delikatnie wstrząsnąć kolbą i ostrożnie dodać 8 ml kompletnej pożywki DMEM F12.
      3. Odwirować 10 przez min przy 160 x g i RT. Oddzielić osad komórkowy w 13 ml kompletnej pożywki DMEM F12 i przenieść do kolby T75 Cell+.
        UWAGA: Bardzo delikatna dysocjacja z trypsyną-EDTA pozwoli na odzyskanie komórek zróżnicowanych ATRA z oryginalnych komórek teratocarcinoma, które są silnie przyczepione do plastikowych wyrobów.
    10. W dniu 21 usuń pożywkę i martwe komórki. Dodać 14 ml kompletnej pożywki DMEM F12 uzupełnionej 5% FBS, 2 mM glutaminy, 100 IU penicyliny, 100 μg streptomycyny i 0,5 μM AraC (cytozyna β-D-arabinofuranozyd) (kompletne 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. W dniach 23, 25 i 28 zastąp zużytą pożywkę 14 ml 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. W dniach od 29 do 49 (co dwa dni) zastąp zużytą pożywkę 14 ml kompletnej pożywki DMEM F12 uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminy, 100 j.m. penicyliny, 100 μg streptomycyny, 5 μM FudR (5-fluoro-2'deoksyurydyna) i 10 μM Urd (urydyna) (pełna 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. W 50 dniu zastąp zużytą pożywkę 14 ml kompletnej pożywki DMEM F12 uzupełnionej 5% FBS, 2 mM glutaminy, 100 j.m. penicyliny, 100 μg streptomycyny i 10 μM Urd (kompletne 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. W dniach od 51 do 95 (dwa razy w tygodniu) zastąp zużytą pożywkę 14 ml kompletnego 5% FBS DMEM F12-Urd.
      UWAGA: Komórki mogą być używane do eksperymentów od 51 dnia, ale nie później niż do 95 dnia. Stosowanie seryjnych terapii inhibitorami mitozy pozwala na odtworzenie czystej populacji kokultury postmitotycznych hNeuronów i hAstrocytów (NT2-N/A).
    15. Aby wysiać komórki, przystąp do delikatnej trypsynizacji, jak opisano dla dnia 20.

2. Praca nad hodowlą komórkową ludzkich komórek mikrogleju CHME/Cl5

UWAGA: To jest mikroglejowy komponent Minibrain (Rysunek 1).

  1. Hodowla ludzkich komórek mikrogleju CHME/Cl5
    1. Wyjąć fiolkę z zamrożonymi komórkami ze zbiornika ciekłego azotu. Trzymaj na lodzie.
    2. Szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml kompletnej pożywki DMEM F12 uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminy, 100 j.m. penicyliny i 100 μg streptomycyny (tj. kompletnej pożywki 5% FBS DMEM F12).
    4. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Oddzielić osad od 2 ml kompletnego 5% podłoża FBS DMEM F12.
    5. Przenieść do kolby T75 Cell+ zawierającej 13 ml kompletnej 5% pożywki FBS DMEM F12.
    6. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% aż do 90% konfluencji. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
  2. Hodowla ludzkich komórek mikrogleju CHME/Cl5
    1. Usunąć podłoże z kolby.
    2. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml PBS uzupełnionego Ca2+ i Mg2+.
    3. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml roztworu EDTA (utrzymywanego w temperaturze pokojowej).
    4. Dodać 3 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Potrząsnąć kolbą i upewnić się, że komórki są oderwane od plastikowej powierzchni.
    6. Dodać 10 ml kompletnej 5% pożywki FBS DMEM F12 w celu dezaktywacji trypsyny, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT.
    7. Oddzielić osad od 10 ml kompletnej pożywki i użyć 1 ml do zaszczepienia każdej nowej kolby zawierającej 14 ml kompletnej 5% pożywki FBS DMEM F12.
    8. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% aż do 90% konfluencji.

3. Praca z kulturą z hCMEC/D3 w celu pokrycia porowatych wkładek i przygotowania BBB

  1. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka hCMEC/D3 (Rysunek 2)
    1. Rozcieńczyć kolagen szczura typu I w stosunku 1:30 czystą sterylną wodą (klasa hodowli komórkowej).
    2. Przenieść 10 ml do kolby T75 Cell+ i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    3. Usuń roztwór kolagenu i zastąp go 15 ml pożywki z komórkami śródbłonka uzupełnionej 10 mM HEPES (określanej jako kompletna pożywka komórkowa śródbłonka).
    4. Wyjąć kriofiolkę z komórkami ze zbiornika ciekłego azotu. Przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Komórki zostały wyhodowane, a partia nasion została wykonana zgodnie z opisem producenta. Linia komórkowa objęta jest umową o transfer materiału biologicznego. Komórki uzyskuje się w pasażu numer 25 i nie należy ich używać dalej niż w pasażu 35.
    5. Szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    6. Przenieść komórki do kolby T75 Cell+ i przywrócić kolbę do temperatury 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 2 do 4 godzin.
    7. Ostrożnie usuń pożywkę, nie tracąc ani nie usuwając komórek. Przepłucz komórki raz 10 ml kompletnego podłoża komórkowego śródbłonka.
    8. Dodać 15 ml kompletnej pożywki z komórek śródbłonka.
    9. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% aż do 100% konfluencji (nie mniej niż 4 dni) bez zmiany pożywki.
  2. Hodowla hCMEC/D3 w celu przygotowania wkładki BBB
    1. Pokryj nową kolbę T75 Cell+ lub wkładki kolagenem szczurzym typu I, jak opisano powyżej (krok 3.1).
    2. Usunąć podłoże z kolby. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml PBS uzupełnionego Ca2+ i Mg2+.
    3. Dodać 2 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Potrząsnąć kolbą i upewnić się, że komórki są całkowicie oderwane od plastikowej powierzchni.
    5. Dodaj 4 ml kompletnego podłoża z komórek śródbłonka, aby dezaktywować trypsynę.
    6. Za pomocą pipety z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml należy mechanicznie oddzielić komórki poprzez zasysanie i przepłukiwanie zawiesiny komórek, jednocześnie przytrzymując pipetę 5 ml na dnie kolby co najmniej 5 razy.
    7. Policz komórki i użyj 5 x 104 komórek/wkładkę do 12-dołkowej wkładki do hodowli z membraną poliestrową i 2 x 106 komórek do kolby T75 Cell+. Przygotuj również trzy filtry bez komórek do eksperymentów PELy (tj. przepuszczalność komórek śródbłonka do żółtego Lucyfera, patrz poniżej paragraf 4.2) z wkładkami do hodowli z membrany poliestrowej.
    8. Inkubować kolby lub wkładki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% aż do 100% konfluencji.
    9. Nie zmieniać podłoża dla kolby T75 Cell+ do czasu nowego przejścia. Wręcz przeciwnie w przypadku BBB na wkładkach do hodowli z membrany poliestrowej: zmień pożywkę w 2 i 4 dniu, użyj BBB do eksperymentów w 6 dniu.

4. Budowa i kontrola jakości BBB-Minibrain (Rysunek 2)

  1. Konfiguracja urządzenia do wkładania hodowli z membraną poliestrową BBB-Minibrain (Rysunek 2B)
    1. Hoduj komórki hCMEC / D3 na 12-dołkowych filtrach do hodowli z membraną poliestrową przez 6 dni na pożywce z komórek śródbłonka przed użyciem ich w eksperymencie.
    2. Pokryj 12-dołkową płytkę poli-D-lizyną (1 ml / dołek, 10 μg / ml, 4 godziny w temperaturze pokojowej), a następnie lamininą (1 ml / dołek, 1 μg / ml, przez noc w temperaturze pokojowej).
    3. Usuń lamininę i dodaj 1 ml pożywki z komórek śródbłonka uzupełnionej 5% FBS (5% pożywki z komórek śródbłonka).
    4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    5. Delikatnie trypsynizować NT2-N/A (jak opisano w kroku 1.3.9) i CHME/Cl5 (jak opisano w kroku 2.2) i dysocjować osady komórkowe za pomocą kompletnej pożywki komórek śródbłonka.
    6. Policz komórki, wymieszaj 3,6 x 105 komórek NT2-N / A i 0,4 x 105 komórek CHME / Cl5 / dołek i zasiej płytkę 12-dołkową.
    7. W T = 24 h (24 h po wysiewie): zmienić użytą pożywkę na świeżą kompletną pożywkę komórkową śródbłonka (komórki Minibrain i komórki śródbłonka) i przenieść filtr do hodowli z membraną poliestrową hCMEC/D3 na wierzch komórek Minibrain. Inkubować BBB-Minibrain w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
      UWAGA: BBB-Minibrain będzie następnie składał się z warstwy ludzkich komórek śródbłonka hCMEC/D3 na filtrze izolującym przedział luminalny (lub przedział "krwi") oraz z mieszanej kultury komórek ludzkich hNT2-N/A i hCHME/Cl5 (Minibrain) na dnie studni definiującej przedział abluminalny (lub przedział "mózg") (Rysunek 2B).
  2. Walidacja przepuszczalności śródbłonka BBB-Minibrain (kontrola jakości) (Rysunek 2C)
    1. Przygotować bufor transportowy (TB), który jest buforem HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) z Ca2+ i Mg2+ uzupełnionym 10 mM HEPES i 1 mM pirogronianem sodu.
    2. Przygotować 12-dołkowe płytki z 1,5 ml buforu transportowego na studzienkę.
    3. Przy T = 0 należy utworzyć świeży bufor transportowy uzupełniony o 50 μM Lucyfer Yellow (LY-TB).
    4. Odwróć każdy filtr do góry nogami, aby ostrożnie usunąć pożywkę bez wpływu na barierę komórkową śródbłonka.
    5. Umieść filtr na napełnionej 12-dołkowej płytce i dodaj 0,5 ml LY-TB.
    6. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    7. W T=10 min przenieś filtry na nowe 12-dołkowe płytki wypełnione TB i zachowaj komorę abluminalną pierwszej płytki do odczytu OD.
    8. Przy T= 25 min powtórzyć krok 4.2.7.
    9. Po T= 45 min należy przerwać transport, wyjmując filtry z płyt. Zachowaj przedziały abluminalne i oświetleniowe do pomiarów średnicy zewnętrznej.
    10. Przenieść próbki do ciemnych 96-dołkowych płytek: 10 μl z 190 μl TB dla LY-TB i komór luminalnych, 200 μl próbki dla komór abluminalnych.
    11. Zmierz fluorescencję LY-TB obecnego w różnych próbkach przy λ428 nm, λ535 nm (odpowiednio fale długości wzbudzenia i emisji).
    12. Oblicz przepuszczalność śródbłonka (Pe) w kierunku LY-TB (PeLY) według Siflinger-Birnboim, A i in. (1987)39 i Da Costa, A et al. (2018)34 za pomocą wzoru:
      1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) i PeLY= PSe/S.
      UWAGA: PSf to przepuszczalność filtra bez komórek, PSt to przepuszczalność filtra z komórkami, PSe to przepuszczalność śródbłonka monowarstwy w czasie powierzchni monowarstwy, S to powierzchnia monowarstwy (dla filtra 12-dołkowego = 1,12 cm2), PeLY jest wyrażone w cm/min. Dla hCMEC/D3 PeLY powinien wynosić od 0,7 do 1,2 x 10-3 cm/min, w zależności głównie od FBS użytego w doświadczeniach. Ważne: PeLY wyższy niż 1,2 oznacza, że bariera krew-mózg nie jest wystarczająco szczelna i można zaobserwować pewien wyciek. Odrzuć te bariery.

5. Użycie BBB-Minibrain do podkreślenia obecności neuroinwazyjnych cząsteczek wirusowych w próbce szczepionki przeciwko wirusowi żółtej gorączki, francuskiemu wirusowi neurotropowemu, YFV-FNV 34 (Rysunek 3)

  1. Krzyżowanie się BBB i namnażanie wirusów żółtej febry w Minibrain
    1. Na 24 godziny przed dodaniem wirusa należy użyć BBB-Minibrain przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 4.1.7; zastąpić pożywkę 2% pożywką FBS z komórek śródbłonka.
      UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby unikać zmiany pożywki tuż przed dodaniem wirusa. Zmiana pożywki może aktywować ludzkie komórki śródbłonka i przejściowo otworzyć barierę, która umożliwi przejście wirusa. Tutaj podłoże jest zmieniane na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. Przy T = 0 bardzo ostrożnie dodać 3500 jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) YFV-FNV rozcieńczonych w 50 μl 2% pożywki komórek śródbłonka FBS na górze komory luminalnej. Kontrolny BBB-Minibrain zaszczepia się 50 μl 2% pożywki z komórek śródbłonka FBS bez wirusa. Określ PeLY na dobrze towarzyszącym.
    3. Inkubować BBB-Minibrain w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    4. Po 24 godzinach wyjmij urządzenie filtrujące z wkładkami do hodowli z membraną poliestrową i oznacz PeLY, pobrać próbkę 1 ml z komory abluminalnej i miareczkować wirusa zgodnie z opisem A. da Costa i in. (2018)34. Zastąp pożywkę świeżą 2% pożywką z komórek śródbłonka FBS.
    5. Inkubować BBB-Minibrain w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    6. Po 72 godzinach pobrać próbkę pożywki z komory abluminalnej i miareczkować wirusa i/lub wyekstrahować RNA z komórek Minibrain w celu analizy ekspresji genów, jak opisano przez A. da Costa i in. (2018)34.
  2. Amplifikacja neurotropowych wariantów YFV-FNV na komórkach Minibrain przez przejścia szeregowe
    1. Użyj 12-dołkowych płytek pokrytych komórkami Minibrain (tj. kroki 4.1.6 i 4.1.7).
    2. W punkcie czasowym 0 h bardzo ostrożnie dodać 3,500 jednostek tworzących płytkę nazębną YFV-FNV rozcieńczonych w 50 μl 2% pożywki komórek śródbłonka FBS na wierzchu komórek (przedział świetlny).
    3. Po 1 godzinie usunąć pożywkę z inokulum wirusa i zastąpić świeżą pożywką z komórek śródbłonka FBS
      4. o stężeniu 2%.
    4. Po 48 godzinach pobrać próbkę 500 μl pożywki hodowlanej i zainfekować świeże komórki Minibrain
    5. Po 120 godzinach pobrać próbkę 500 μl pożywki hodowlanej i zainfekować świeże komórki Minibrain.
    6. Po 192 godzinach zachowaj pożywkę hodowlaną (= wzbogacony zapas wirusa) i wyekstrahuj RNA z komórek Minibrain do analizy ekspresji genów, jak opisano przez A. da Costa et al. (2018)34.

6. Wykorzystanie BBB-Minibrain do badania krzyżowania BBB i celowania biomolekuły w komórki mózgowe

  1. Transport przez barierę krew-mózg neuronu ukierunkowanego na biomolekułę
    1. Użyj Minibrain-BBB przygotowanego zgodnie z opisem kroku 4.1.7.
    2. W punkcie czasowym 0 h dodaj biomolekułę (w przykładzie podanym w sekcji wyników, 58,75 ng / BBB cząsteczek NeuroTag-NV przenikanych przez komórkę dodano na wkładkę BBB-Minibrain.
    3. Inkubować BBB-Minibrain w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    4. Po 24 godzinach wyjmij urządzenie filtrujące z wkładkami do hodowli z membraną poliestrową i oznacz PeLY, a następnie wybarwić komórki Minibrain pod kątem neurofilamentu hNeurons Nf200 i wykryć obecność biomolekuły w Minibrain (w przykładzie podanym w sekcji wyników, NeuroTag-NV został wykryty przy użyciu przeciwciała skierowanego przeciwko zawartemu w nim Strep-Tag35,40).
  2. Transport przez barierę krew-mózg biomolekuły neuroregeneracyjnej, a następnie test neuroprotekcyjny w Minibrain po przekroczeniu przez biomolekułę bariery krew-mózg
    1. Użyj Minibrain-BBB przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 4.1.7.
      UWAGA: Tylko w przypadku cząsteczek celujących w neurony, komórki Minibrain mogą być zastąpione komórkami Neurons (NT2-N)38.
    2. W punkcie czasowym 0 h dodaj 58,75 ng/BBB-Minibrain studzienki cząsteczek NV przenikających komórkę (aktywna forma CPM-NeuroTag-NV, nieaktywna forma CPM-NeuroTag-NVΔ) opisana przez C. Prehaud et al. (2014)35.
    3. Inkubować BBB-Minibrain w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    4. Po 4 godzinach wykonaj indywidualne rany za pomocą igły iniekcyjnej (26GX1/2", 12-4.5, Terumo, Belgia) na komórkach Minibrain. Zrób co najmniej 10 zadrapań na każdym dołku. Określ PeLY na studni towarzyszącej.
    5. Inkubować BBB-Minibrain w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    6. Po 8 godzinach wymienić pożywkę w komorze brzusznej na świeżą, kompletną pożywkę z komórek śródbłonka.
      UWAGA: Ważne jest, aby wymienić pożywkę na tym etapie, ponieważ zranienie komórek Minibrain może prowadzić do śmierci komórki, a następnie do uwolnienia związków cytotoksycznych.
    7. Inkubować BBB-Minibrain w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    8. Po 48 godzinach wybarwiono komórki w celu regeneracji aksonów hNeuronów, jak opisano przez C. Prehaud i in. (2013)40.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-Minibrain to eksperymentalny model interfejsu krew-mózg wykonany z celulonu.

BBB-Minibrain jest ustawiony na systemie wkładek do hodowli z membrany poliestrowej, aby naśladować przedział krwi na górnym poziomie i przedział mózgowy na dolnym poziomie interfejsu krew-mózg (Rysunek 2A,B). Składa się z przedziału świetlnego z komórkami śródbłonka hCMEC / D3 na filtrze tworząc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule pokazaliśmy, jak zbudować komórkowy interfejs krew/mózg, BBB-Minibrain, łącząc model BBB i hodowlę mieszanych komórek mózgowych mózgu (Minibrain) w jednym zestawie. System ten jest istotny z biologicznego punktu widzenia, łatwy w konfiguracji i obsłudze dla eksperymentatorów dobrze wyszkolonych w hodowli komórkowych.

Podobnie jak w przypadku każdego innego modelu BBB in vitro, wiarygodne wyniki można uzyskać, stosując drastyczną kontrolę szczelności bariery. Wkładki powinny być ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Własnością intelektualną systemu były patenty, o których mowa w art. 32, 35 i 38.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez wewnętrzne granty od Instytutu Pasteura, w tym grant Incitative (PTR 435) oraz przez grant "Contrat de Soutien à la Recherche" udzielony przez Sanofi Pasteur dla Institut Pasteur. A. da Costa był wspierany przez grant Sanofi-Pasteur, a Florian Bakoa jest laureatem grantu doktorskiego przyznanego przez ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Jesteśmy wdzięczni pr Pierre-Olivierowi Couraud i dr Florence Miller za pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweCorning3336
5-fluoro-2' deoksyurydynaMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Petri DishSarstedt83-3902-500
Anti-NF200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-etanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleNa życzenie do Dr Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytozyna β-D-arabinofuranozydMerck-Sigma AldrichC1768
Ciemne płytki 96-dołkoweCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004pożywka z komórek śródbłonka
EtanolCarlo Erba529121
FBS HyclonSV30015-04
FormaldehydMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSA DiagnostykaRAL320310
Koza-Anty MyszJackson Immuno Research115-545-003
Koza-Anty KrólikThermofisher ScientificR37117
HBSS z Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminaThermofisher Scientific25030-024
Lucyfer ŻółtyMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15714
PBS bez Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Długopis/paciorkowiecEurobioCXXPES00-07
Poly-d-LizynaMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Kolagen szczurzy ICultrex3443-100-01
Kwas retinowy All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Zestaw do oczyszczaniaRNA QIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Wodorowęglan sodu 5,6%EurobioCXXBIC00-07
Pirogronian soduThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ KolbaSarstedt83-1813-302Kolba polistyrenowa do hodowli tkankowych ze specjalną obróbką powierzchniową (Cell+) do wrażliwych komórek przylegających
TranswellCorning3460Poliestrowe porowate wkładki do hodowli
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Ultra czysta wodaThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarFiolka
membranowych szczepionki Dakar

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model bariery krew m zgludzki model BBBhodowla miniaturowego m zguprzepuszczalno kom rek r db onkatransport lucyferowego tegodetekcja przej cia wirus wtransport leku Neurovitabiomoleku a celuj ca w neuronykom rki r db onka mikroznaczyniowego m zguinsert do hodowli z membran poliestrow

Powiązane artykuły