Artykuł metodologiczny

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

DOI:

10.3791/59220

⸱

9 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne badanie przesiewowe leków dla układu nerwowego na odpowiednim i wiarygodnym modelu BBB w celulonie pod kątem ich penetracji i interakcji z barierą i miąższem mózgu jest nadal niezaspokojoną potrzebą. Aby wypełnić tę lukę, zaprojektowaliśmy model 2D z celulo, BBB-Minibrain, łącząc kulturę z poliestrowej porowatej membrany z ludzkim modelem BBB z Minimózgiem utworzonym przez trójkulturę ludzkich komórek mózgowych (neuronów, astrocytów i komórek mikrogleju). BBB-Minibrain pozwolił nam przetestować transport kandydata na lek neuroprotekcyjny (np. Neurovita) przez barierę krew-mózg, aby określić specyficzne ukierunkowanie tej cząsteczki na neurony i pokazać, że właściwości neuroprotekcyjne leku zostały zachowane po przekroczeniu bariery krew-mózg. Wykazaliśmy również, że BBB-Minibrain stanowi interesujący model do wykrywania przechodzenia cząsteczek wirusa przez barierę komórek śródbłonka i monitorowania infekcji Minibrain przez neuroinwazyjne cząsteczki wirusa. BBB-Minibrain to niezawodny system, łatwy w obsłudze dla badaczy przeszkolonych w technologii hodowli komórkowych i przewidujący fenotypy komórek mózgowych po leczeniu lub zniewadze. Zainteresowanie takimi badaniami na bazie celulo byłoby dwojakie: z jednej strony wprowadzenie etapów zmniejszania ryzyka na wczesnym etapie opracowywania leku, a z drugiej strony ograniczenie stosowania testów na zwierzętach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg jest oddzielony od krążenia ogólnoustrojowego przez nieprzepuszczalną strukturę, która ogranicza wymianę między miąższem mózgu a krwią, zwaną barierą krew-mózg (BBB). Zbudowany głównie z komórek śródbłonka mózgu, BBB dynamicznie oddziałuje z astrocytami, mikroglejem okołonaczyniowym i neuronami sąsiedniego miąższu mózgu. Trzy główne funkcje bariery krew-mózg to tworzenie i utrzymywanie homeostazy jonowej dla funkcji neuronalnych, zaopatrzenie mózgu w składniki odżywcze oraz ochrona przed toksycznymi urazami lub wnikaniem patogenów1,2, które przyczyniają się do utrzymania homeostazy mózgu i jego funkcji

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Praca nad hodowlą komórkową Ntera/CL2. D1 w celu przygotowania kohodowli post-mitotycznych hNeuronów i hAstrocytów (NT2-N/A)

UWAGA: To jest komponent Minibrain (Rysunek 1).

  1. Hodowla Ntera/Cl2.D1
    1. Wyjąć fiolkę z zamrożonymi komórkami ze zbiornika z ciekłym azotem. Trzymaj na lodzie.
    2. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Przenieś komórki do 15 ml probówki zawierającej 10 ml kompletnej pożywki DMEM F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 medium) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy, 100 j.m. penicy....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-Minibrain to eksperymentalny model interfejsu krew-mózg wykonany z celulonu.

BBB-Minibrain jest ustawiony na systemie wkładek do hodowli z membrany poliestrowej, aby naśladować przedział krwi na górnym poziomie i przedział mózgowy na dolnym poziomie interfejsu krew-mózg (Rysunek 2A,B). Składa się z przedziału świetlnego z komórkami śródbłonka hCMEC / D3 na filtrze tworząc.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule pokazaliśmy, jak zbudować komórkowy interfejs krew/mózg, BBB-Minibrain, łącząc model BBB i hodowlę mieszanych komórek mózgowych mózgu (Minibrain) w jednym zestawie. System ten jest istotny z biologicznego punktu widzenia, łatwy w konfiguracji i obsłudze dla eksperymentatorów dobrze wyszkolonych w hodowli komórkowych.

Podobnie jak w przypadku każdego innego modelu BBB in vitro, wiarygodne wyniki można uzyskać, stosując drastyczną kontrolę szczelności bariery. Wkładki powinny być .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Własnością intelektualną systemu były patenty, o których mowa w art. 32, 35 i 38.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez wewnętrzne granty od Instytutu Pasteura, w tym grant Incitative (PTR 435) oraz przez grant "Contrat de Soutien à la Recherche" udzielony przez Sanofi Pasteur dla Institut Pasteur. A. da Costa był wspierany przez grant Sanofi-Pasteur, a Florian Bakoa jest laureatem grantu doktorskiego przyznanego przez ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Jesteśmy wdzięczni pr Pierre-Olivierowi Couraud i dr Florence Miller za pomocne dyskusje.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweCorning3336
5-fluoro-2' deoksyurydynaMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Petri DishSarstedt83-3902-500
Anti-NF200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-etanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleNa życzenie do Dr Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytozyna β-D-arabinofuranozydMerck-Sigma AldrichC1768
Ciemne płytki 96-dołkoweCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004pożywka z komórek śródbłonka
EtanolCarlo Erba529121
FBS HyclonSV30015-04
FormaldehydMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSA DiagnostykaRAL320310
Koza-Anty MyszJackson Immuno Research115-545-003
Koza-Anty KrólikThermofisher ScientificR37117
HBSS z Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminaThermofisher Scientific25030-024
Lucyfer ŻółtyMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15714
PBS bez Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Długopis/paciorkowiecEurobioCXXPES00-07
Poly-d-LizynaMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Kolagen szczurzy ICultrex3443-100-01
Kwas retinowy All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Zestaw do oczyszczaniaRNA QIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Wodorowęglan sodu 5,6%EurobioCXXBIC00-07
Pirogronian soduThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ KolbaSarstedt83-1813-302Kolba polistyrenowa do hodowli tkankowych ze specjalną obróbką powierzchniową (Cell+) do wrażliwych komórek przylegających
TranswellCorning3460Poliestrowe porowate wkładki do hodowli
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Ultra czysta wodaThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarFiolka
membranowych szczepionki Dakar

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model bariery krew m zgludzki model BBBhodowla miniaturowego m zguprzepuszczalno kom rek r db onkatransport lucyferowego tegodetekcja przej cia wirus wtransport leku Neurovitabiomoleku a celuj ca w neuronykom rki r db onka mikroznaczyniowego m zguinsert do hodowli z membran poliestrow

Powiązane artykuły