Artykuł metodologiczny

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59246

⸱

22 marca 2019

 ,  ,  , 
1Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 2Laboratory for Developmental Neurobiology, RIKEN Center for Brain Science, 3École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Streszczenie

Jon wapnia (Ca2+) jest uniwersalną wewnątrzkomórkową cząsteczką przekaźnikową, która napędza wiele szlaków sygnałowych, prowadząc do różnorodnych wyników biologicznych. Uważa się, że koordynacja dwóch źródeł sygnału Ca2 + - "napływ Ca2 + " z zewnątrz komórki i "uwolnienie Ca2 +" z wewnątrzkomórkowej retikulum endoplazmatycznego Ca2 + magazynowania (ER) - leży u podstaw różnorodnych czasoprzestrzennych wzorców sygnałów Ca2 +, które powodują wiele funkcji biologicznych w komórkach. Celem tego protokołu jest opisanie nowej metody obrazowaniaCa2+, która umożliwia monitorowanie samego momentu "napływu Ca2+" i "uwolnienia Ca2+". OER-GCaMP6f jest genetycznie kodowanym wskaźnikiem Ca2 + (GECI) zawierającym GCaMP6f, który jest ukierunkowany na zewnętrzną błonę ER. OER-GCaMP6f może monitorować uwalnianie Ca2+ w wyższej rozdzielczości czasowej niż konwencjonalny GCaMP6f. W połączeniu z GECI ukierunkowanymi na błonę plazmatyczną, przestrzenno-czasowy wzorzec sygnału Ca2+ można opisać w rozdzielczości subkomórkowej. Opisane tutaj wskaźniki Ca2+ ukierunkowane na subkomórkę są w zasadzie dostępne dla wszystkich typów komórek, nawet do obrazowania in vivo neuronów Caenorhabditis elegans. W tym protokole wprowadzamy obrazowanie Ca2 + w komórkach z linii komórkowych, neuronów i komórek glejowych w zdysocjowanych kulturach pierwotnych oraz opisujemy przygotowanie zamrożonego materiału neuronów korowych szczura.

Wprowadzenie

Ca2+ sygnały reprezentują podwyższenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+. Ca2+ jest uniwersalnym drugim przekaźnikiem dla komórek eukariotycznych. Wykorzystując Ca2+, komórki działają poprzez różne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe i indukują różne wyjścia biologiczne. Na przykład w neuronach uwalnianie pęcherzyków synaptycznych na końcu presynaptycznym, ekspresja genów w jądrze i indukcja plastyczności synaptycznej w postsynapsie są regulowane przez wyraźne sygnały Ca2 +, które precyzyjnie aktywują odpowiednie enzymy w odpowiednich miejscach i z precyzyjnym wyczuciem czasu1.

Specyficzne czasoprzestrzenne wzorce sygnałów Ca2+ aktywują specyficzne enzymy znajdujące się poniżej. Sygnały Ca2 + są generowane przez koordynację między dwoma różnymi źródłami Ca2 +: napływem Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej i uwalnianiem Ca2 + z retikulum endoplazmatycznego (ER), które służy jako wewnątrzkomórkowy magazyn Ca2 +. Znaczący czasoprzestrzenny wzorzec sygnalizacji Ca2 + w celu wywołania określonej funkcji komórki jest również wspierany przez nanodomeny 10–100 μM Ca2+ generowane w pobliżu kanałów Ca2+ na błonie plazmatycznej lub błonie ER2. Co ważne, źródło sygnałów Ca2+ jest jednym z najbardziej krytycznych czynników decydujących o dalszym wybiegu biologicznym. W neuronach napływ Ca2 + i uwalnianie Ca2 + mają przeciwny wpływ na grupowanie receptorów kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) A (GABAAR) w synapsach GABAergicznych, co jest odpowiedzialne za hamowanie pobudliwości neuronów3. Napływ Ca2 +, któremu towarzyszy masywne pobudzenie neuronów, indukuje dyspersję synaptycznych klastrów GABAAR, podczas gdy trwałe uwalnianie Ca2 + z ER sprzyja grupowaniu synaptycznych GABAARs. Inne grupy zgłosiły również, że kierunek dostrajania stożków wzrostu jest krytycznie zależny od źródła sygnału Ca2 +: napływ Ca2 + indukuje odpychanie, podczas gdy uwalnianie Ca2 + kieruje przyciąganiem stożka wzrostu neuronów 4. Dlatego, aby w pełni zrozumieć szlaki sygnałowe Ca2 + leżące u podstaw określonych wyjść komórkowych, ważne jest zidentyfikowanie źródła sygnałów Ca2 + poprzez opisanie sygnałów Ca2 + w rozdzielczości subkomórkowej.

W tym protokole opisujemy metodę obrazowania Ca2+ do raportowania sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej, co pozwala na oszacowanie źródeł sygnału Ca2+ (Rysunek 1). Mikrodomeny Ca2 + znajdujące się tuż pod błoną plazmatyczną są z powodzeniem monitorowane przez genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI) ukierunkowane na błonę plazmatyczną poprzez przyłączenie sygnału lokalizacji błony plazmatycznej Lck w kinazie Src do N-końców GECIs5. Aby wykryć wzorzec sygnału Ca2+ w pobliżu ER w lepszej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, niedawno opracowaliśmy OER-GCaMP6f, w którym GCaMP6f6 celuje w zewnętrzną błonę ER, używając białka transbłonowego ER. OER-GCaMP6f może z wyczuciem zgłaszać uwolnienie Ca2+ z ER w lepszej rozdzielczości czasoprzestrzennej niż konwencjonalny nieukierunkowany GCaMP6f w komórkach COS-77 i HEK293 cells8, unikając dyfuzji Ca2+ i GECIs. Potwierdziliśmy również, że spontaniczne podwyższenie poziomu Ca2 + w hodowanych astrocytach hipokampa zgłoszone przez OER-GCaMP6f wykazało inny wzorzec czasoprzestrzenny w porównaniu do tego monitorowanego przez GCaMP6f ukierunkowanego na błonę plazmatyczną (Lck-GCaMP6f)7,9, co wskazuje, że obrazowanie Ca2+ za pomocą OER-GCaMP6f w połączeniu z Lck-GCaMP6f przyczynia się do rozwarstwienia Ca2+ sygnały w rozdzielczości subkomórkowej w celu identyfikacji ich źródeł.

Obecnie szczegółowo opisujemy protokół sekcji sygnału Ca2+ w komórkach HeLa i mieszanych kulturach neuronów i astrocytów na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Wskazana tutaj technika obrazowania Ca2+ z GECI, Lck-GCaMP6f, RCaMP210 (Lck-RCaMP2) i OER-GCaMP6f (Rysunek 1) mają zastosowanie do wszystkich komórek, w których te GECI mogą być wyrażane.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez komitet bezpieczeństwa RIKEN i komitet eksperymentów na zwierzętach, zgodnie z wytycznymi wydanymi przez japońskie Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii.

1. Przygotowanie komórek

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli(etyleniminą)
    nuta: Powłoka z poli(etyleniminy) (PEI) jest zalecana do aparatu szklanego, ponieważ umożliwia neuronom i astrocytom ścisłe przyleganie do szkiełek nakrywkowych, nie zapobiegając ich rozwojowi. Jednak inne metody powlekania (np. poliornityna, poli-L-lizyna, powlekanie lamininą) są również dostępne, w razie potrzeby, dla naczyń ze szklanym dnem.
    1. Umieścić szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm w każdym dołku płytki 12-dołkowej. Przygotuj 0,04% roztwór PEI (12,5 ml/płytka 12-dołkowa) używając wysterylizowanej wody.
    2. Dodaj 1 ml 0,04% roztworu PEI do każdej studzienki. Upewnij się, że pod szkiełkami nakrywkowymi nie ma pęcherzyków powietrza.
    3. Inkubować płytki w inkubatorze CO2 przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Następnego dnia przemyj powlekane szkiełka nakrywkowe 3x 1 ml wysterylizowanej wody. Usunąć roztwór PEI za pomocą aspiratora, dodać 1 ml wysterylizowanej wody do każdego dołka i wstrząsnąć 12-dołkową płytką, aby roztwór PEI między szkiełkiem nakrywkowym a płytką można było dokładnie wypłukać. Ponieważ pozostały PEI jest toksyczny dla komórek, należy upewnić się, że woda po ostatnim myciu jest całkowicie zassana.
    5. Wysuszyć i wysterylizować szkiełka nakrywkowe wewnątrz kaptura światłem ultrafioletowym (UV) przez co najmniej 15 minut. Naczynie pokryte PEI można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy. Oświetl naczynia światłem UV przez 15 minut tuż przed użyciem.
    6. Dodaj 5 ml sterylnej wody destylowanej w przestrzeni między studzienkami, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej.
  2. Posiewanie linii komórkowych
    nuta: Protokół ten stanowi tylko jeden przykład transfekcji do komórek z linii komórkowych ssaków, takich jak komórki HeLa i komórki COS-7. Użytkownicy mogą stosować inne protokoły transfekcji, które są zoptymalizowane pod kątem ich eksperymentów. W tej sekcji opiszemy protokół hodowli komórek HeLa, który ma również zastosowanie do komórek COS-7.
    1. W dniu poprzedzającym transfekcję hodować komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym, aż osiągną zbieżność 70%–90%.
    2. Podgrzej pożywkę hodowlaną (patrz tabela materiałów) do temperatury 37 °C.
    3. Przemyć komórki 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (PBS [-]).
    4. Odessać PBS(-), dodać 1 ml 0,5% roztworu kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 90 s, aż osiągną okrągły kształt.
    5. Dodaj 9 ml podgrzanej pożywki hodowlanej, aby zatrzymać trypsynizację. Rozcieńczyć komórki pożywką hodowlaną w stosunku 1:6.
    6. Nasiona 1 ml rozcieńczonych komórek na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PEI na płytkach 12-dołkowych.
  3. Przygotowanie mieszanej kultury neuronów hipokampa i astrocytów od szczurów lub myszy
    nuta: Sekcje 1.3 i 1.4 muszą najpierw zostać poddane przeglądowi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania oraz muszą być zgodne z oficjalnie zatwierdzonymi procedurami dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Schemat blokowy protokołu hodowli neuronalnej jest pokazany w Rysunek 2.
    1. Przygotuj wszystkie odczynniki pod okapem z przepływem laminarnym. Umieść zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco w dwóch 100-milimetrowych szalkach hodowlanych (około 20 ml / naczynie), które znajdują się w zamrażalniku.
    2. Przygotować 50 ml pożywki rozwarstwiającej składającej się z DMEM i 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (patrz tabela materiałów) i dozować pożywkę do trzech 60-milimetrowych szalek hodowlanych (około 7 ml/szalkę) i ośmiu szalek hodowlanych o średnicy 35 mm (około 2 ml/szalkę). Umieść naczynia w innym pojemniku na lód.
    3. Przygotować 50 ml soli fizjologicznej do inkubacji, złożonej ze zbilansowanego roztworu soli Hanksa uzupełnionego 20 mM HEPES (patrz Tabela Materiałów) i umieścić 8 ml soli fizjologicznej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
    4. Przygotować pożywkę galwaniczną z minimalną ilością niezbędnej pożywki (MEM) uzupełnionej witaminą B-27, glutaminą i penicyliną-streptomycyną (patrz tabela materiałów). Utrzymuj to podłoże w temperaturze pokojowej (20–28 °C).
    5. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.
    6. Umieść ręcznik papierowy w szklanym słoiku z pokrywką i 1 ml izofluranu. Pozwól izofluranowi odparować przez 1 minutę.
    7. Umieść ciężarną szczura lub mysz w słoiku przygotowanym zgodnie z krokiem 1.3.6 i trzymaj zwierzę w słoiku do czasu głębokiego znieczulenia (około 30 s do 1 minuty).
    8. Wyjmij znieczulone zwierzę ze słoika i zdezynfekuj zwierzę oraz sprzęt do sekcji, spryskując je 70% etanolem. Przetnij brzuszną linię środkową za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych i pęsety i usuń macicę od ciężarnej szczura lub myszy.
    9. Za pomocą delikatnych nożyczek preparacyjnych wyekstrahuj zarodki E18-19 z macicy znieczulonej samicy szczura lub myszy i umieść wyekstrahowane zarodki za pomocą kleszczyków pierścieniowych w lodowatym DMEM w 10-centymetrowym naczyniu do zimnego znieczulenia.
    10. Odetnij głowę zarodkowi cienkimi nożyczkami preparacyjnymi i umieść głowę w lodowatym DMEM w naczyniu o średnicy 10 cm.
    11. Wydobyj mózg z każdego zarodka za pomocą zakrzywionych kleszczy Semken o długości 13 cm i kleszczyków z cienkimi końcówkami. Trzymaj mózg w lodowatym podłożu preparacyjnym w naczyniu o średnicy 60 mm.
    12. Usunąć hipokampy, za pomocą dwóch kleszczy z cienkimi końcówkami, w lodowatym podłożu preparacyjnym w szalkach o średnicy 35 mm i utrzymać izolowaną tkankę w inkubacyjnym roztworze soli fizjologicznej umieszczonej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
    13. Przemyć hipokampy solą fizjologiczną do inkubacji i inkubować z trypsyną (1,25 mg/ml) i DNazą I (0,25 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej do inkubacji przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zalecana objętość inkubacji to 2,7 ml soli fizjologicznej do inkubacji, 150 μl 20x trypsyny podstawowej i 150 μl 20x podstawowej DNazy (patrz tabela materiałów).
    14. Umyj hipokampy 3x lodowatą solą fizjologiczną.
    15. Odessać sól fizjologiczną do inkubacji i dodać 1 ml pożywki galwanicznej zawierającej DNazę I (10 μl roztworu podstawowego; patrz tabela materiałów). Zawiesić tkankę, pipetując nie więcej niż 20 razy i zmierzyć gęstość żywych komórek, używając licznika komórek i testu błękitu trypanowego.
    16. Rozcieńczyć komórki hipokampa do gęstości 1,4 x 105 żywotnych komórek/ml dla szczurów i 2,5 x 105 żywotnych komórek/ml dla myszy. Pobrać 1 ml rozcieńczonych zawiesin komórkowych na szkiełka nakrywkowe pokryte PEI na 12-dołkowych płytkach hodowlanych.
    17. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2-3 dni.
    18. Usunąć podłoże galwaniczne. Nie pozwól, aby komórki wyschły. Delikatnie i szybko dodaj podgrzaną pożywkę konserwacyjną (patrz Tabela materiałów).
  4. Przygotowanie mieszanej hodowli neuronów korowych szczura i astrocytów oraz zamrożonych komórek oraz ożywienie zamrożonych kultur
    nuta: Metoda kriokonserwacji komórek korowych została opisana wcześniej11. W tym przypadku przedstawiono zmodyfikowany protokół, w którym komórki korowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez co najmniej 3 miesiące. Schemat blokowy dla tego protokołu pokazano na rysunku 2.
    1. Przygotować DMEM, pożywkę do rozwarstwiania, sól fizjologiczną do inkubacji i pożywkę galwaniczną, jak wskazano w krokach 1.3.1–1.3.4 i tabeli materiałów.
    2. W razie potrzeby przygotować pożywkę płuczącą składającą się z DMEM, inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i penicyliny-streptomycyny (patrz tabela materiałów).
    3. Ekstrahuj zarodki E18-19 z macicy znieczulonej samicy szczura lub myszy, używając delikatnych nożyczek do preparowania i użyj kleszczy pierścieniowych, aby umieścić każdy wyekstrahowany zarodek w lodowatym DMEM w celu znieczulenia na zimno.
    4. Usuń mózgi z zarodków i trzymaj je w lodowatym podłożu preparacyjnym. Usuń korę i trzymaj ją w soli fizjologicznej do inkubacji umieszczonej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
    5. Przemyć kory solą fizjologiczną do inkubacji i inkubować kory z trypsyną (1,25 mg/ml) i DNazą I (0,25 mg/ml) w inkubacji soli fizjologicznej przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zalecana objętość inkubacji dla 12 kor to 5,4 ml soli fizjologicznej do inkubacji, 300 μl 20x trypsyny i 300 μl 20x podstawowej DNazy I.
    6. Umyj korę 3x lodowatym roztworem soli fizjologicznej do inkubacji.
    7. Usunąć supernatant i dodać 2 ml podłoża galwanicznego uzupełnionego 150 μl bulionu DNazy I. Oddzielić komórki, pipetując mniej niż 20 pociągnięć, a następnie przefiltrować komórki za pomocą sitka o wielkości porów 70 μm.
    8. Umyć sitko do komórek 20 ml podłoża galwanicznego do powlekania. W celu przygotowania zamrożonego wywaru komórkowego należy przemyć komórki 20 ml pożywki płuczącej (patrz tabela materiałów)
    9. Zmierz gęstość żywotnych komórek za pomocą licznika komórek i metody błękitu trypanowego.
    10. Rozcieńczyć komórki korowe do gęstości 1,4 x 105 żywotnych komórek/ml za pomocą pożywki galwanicznej i dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek do szkiełek nakrywkowych pokrytych PEI na 12-dołkowych płytkach hodowlanych.
    11. Utrzymać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2–3 dni i zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę konserwacyjną.
    12. Po wykonaniu czynności 1.4.9 przygotować zamrożony wywar z komórek korowych, odwirowując komórki w sile 187 x g przez 3 minuty, używając rotora obrotowego.
    13. Odessać supernatant i dodać pożywkę do kriokonserwacji (patrz tabela materiałów) utrzymywaną w temperaturze 4 °C, aby uzyskać gęstość komórek 1 x 107 komórek/ml. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek kriogenicznych.
    14. Umieścić probówki w pojemniku do zamrażania komórek o szybkości zamrażania -1 °C/min, aż do osiągnięcia temperatury -80 °C, a następnie przenieść pojemnik do zamrażania w temperaturze -80 °C. Komórki mogą być przechowywane przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze -80 °C.
    15. Aby ożywić zamrożone komórki, należy podgrzać pożywkę myjącą (około 13 ml na każdą probówkę kriogeniczną) i pożywkę konserwacyjną dla zamrożonych komórek korowych (patrz Tabela materiałów).
    16. Zamrożone komórki szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    17. Rozcieńczyć rozmrożone komórki delikatnie podgrzanym roztworem myjącym. Odwirować komórki przy sile 187 x g przez 3 minuty za pomocą rotora wahadłowego.
    18. Zawiesić osad w 1 ml pożywki płuczącej i zmierzyć gęstość żywotnych komórek.
    19. Rozcieńczyć komórki pożywką podtrzymującą dla zamrożonych komórek korowych, aby uzyskać gęstość komórek 3,0 x 105 żywotnych komórek/ml i zasiać 1 ml zawiesiny komórkowej na 12-dołkowych płytkach pokrytych PEI.

2. Ekspresja GECI ukierunkowanych na błonę

  1. Transfekcja komórek
    1. Dodać 250 ng plazmidu GECI (tj. Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 lub OER-GCaMP6f z promotorem CMV) 7,8,9 do 100 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów) na studzienkę. Do kotransfekcji Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f należy użyć 250 ng każdego plazmidu w 100 μl zredukowanej pożywki surowicy w każdym dołku.
    2. Dodać 0,5 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) na studzienkę do mieszaniny pożywki surowicy o zredukowanej zawartości plazmidu. Do kotransfekcji Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f dodać 0,5 μl odczynnika do transfekcji na studzienkę.
    3. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20–28 °C).
    4. Dodać 100 μl mieszaniny do każdego szkiełka nakrywkowego kroplami.
    5. Inkubować komórki przez 48–72 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję GECI.
  2. Transfekcja i zakażenie wirusem adenowirusowym neuronów hipokampa lub kory mózgowej
    nuta: Transfekcja przez 3-5 dni in vitro (DIV) powoduje wyższy wskaźnik transfekcji neuronów. Transfekcja w 6-8 DIV jest preferowana dla optymalnej ekspresji GECI w astrocytach. W przypadku ekspresji GECI w zdysocjowanych neuronach hodowlanych po 9 DIV, zakażenie wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) zapewnia lepszą skuteczność ekspresji. Wektory AAV do ekspresji Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w ramach promotorów EF1a przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem, przy użyciu HEK293 cells12 (patrz Tabela materiałów).
    1. W przypadku transfekcji 3–8 dni po posiewie oznacz dwie probówki, jedną na plazmidowe DNA, a drugą na odczynnik do transfekcji.
    2. Dodać 50 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów) na studzienkę do każdej probówki.
    3. Dodać 0,5 μg plazmidowego DNA na szkiełko nakrywkowe i 1 μl suplementu wraz z odczynnikiem do transfekcji neuronów (patrz tabela materiałów) na basenik do probówki plazmidowego DNA. W celu kotransfekcji Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f, 0,5 μg każdego plazmidu i 1 μl suplementu miesza się w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy na studzienkę.
    4. Dodać 1 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) na studzienkę w probówce z odczynnikiem do transfekcji. Ta sama ilość odczynnika do transfekcji jest używana do kotransfekcji.
    5. Wiruj obie rurki przez 1–2 s.
    6. Dodać mieszaninę odczynników do transfekcji (z etapu 2.2.4) do mieszaniny DNA (z etapu 2.2.3). Wymieszać delikatnie pipetując i inkubować mieszaninę (100 μl na szkiełko nakrywkowe) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Załaduj tę mieszaninę na komórki w sposób kroplowy.
    8. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 przez 2-3 dni, aż białka markerowe ulegną ekspresji.
    9. W przypadku zakażenia AAV dodaj 3 μl AAV na studzienkę do mieszanej hodowli neuronów i astrocytów. Delikatnie wymieszaj, kołysząc naczyniem. W przypadku podwójnej infekcji Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f, wprowadza się 3 μl każdego AAV na studzienkę. W przypadku, gdy liczba komórek wykazujących ekspresję GECI jest niewystarczająca, należy określić optymalną ilość AAV dla zakażenia.
    10. Utrzymuj kulturę przez 1-2 tygodnie, aż GECI ulegną ekspresji.

3. Obrazowanie Ca2+

  1. Jednoczesne obrazowanie komórek wykazujących ekspresję Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f
    nuta: Do jednoczesnego nagrywania sygnałów Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wymagana jest optyka z podziałem obrazu. Układ optyczny umożliwia rozdzielenie RCaMP2 i GCaMP6f oraz ich projekcję na ten sam kadr fotograficzny aparatu (Rysunek 3A). Obrazowanie symultaniczne wymaga również (1) źródeł światła, które mogą jednocześnie emitować światło wzbudzające w widmie niebieskim (450–490 nm) i zielonym (500–560 nm), (2) dwupasmowych filtrów i zestawów zwierciadeł dichroicznych w mikroskopie oraz (3) filtrów emisyjnych dla RCaMP2 i GCaMP6f. Szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów.
    1. Włącz urządzenia do przetwarzania obrazu i komputery co najmniej 30 minut przed nagrywaniem. Rozgrzej komorę grzewczą mikroskopu do 37 °C. Ustaw urządzenie do dzielenia obrazu, filtry i źródło światła. Ustaw optykę dzielącą obraz tak, aby w aparacie pojawiło się to samo pole widzenia. Wybierz odpowiednią soczewkę obiektywu (patrz tabela materiałów).
    2. Zamontować szkiełko nakrywkowe zawierające komórki transfekowane Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komorze zapisu, dodać odpowiednie podłoże lub bufor (400 μl dla szkiełek nakrywkowych 18 mm) do komory i umieścić je na stoliku mikroskopu. Umieść pokrywę na komorze nagrywającej, aby uniknąć parowania medium.
    3. Zlokalizuj komórki wykazujące ekspresję zarówno Lck-RCaMP2, jak i OER-GCaMP6f za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Zminimalizuj natężenie światła wzbudzającego, aby zapobiec fotowybielaniu i fototoksyczności.
    4. Zdejmij pokrywę i rozpocznij nagrywanie poklatkowe z częstotliwością 10 Hz. Podczas tego zapisu dodaj agonistę do komory, aby wywołać odpowiedzi Ca2+ (np. histamina dla komórek HeLa, ATP dla komórek COS-7).
    5. Zapisz dane poklatkowe na dysku twardym (HDD).
    6. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
  2. Rejestrowanie spontanicznej aktywności astrocytów wyrażających Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f
    nuta: Bez optyki rozdzielającej obraz, sygnały Ca2+ na błonie plazmatycznej i wokół ER mogą być monitorowane w tej samej komórce. W tym miejscu opisano sekwencyjny zapis Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w tych samych astrocytach. Obiektyw olejowy z aperturą numeryczną większą niż 1,3 jest wysoce zalecany do spontanicznej aktywności Ca2+.
    1. Włącz mikroskop, kamerę, źródło światła i komorę grzewczą mikroskopu co najmniej 30 minut przed nagrywaniem.
    2. Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające komórki transfekowane Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komorze zapisu i dodać 400 μl podłoża do obrazowania. Umieść pokrywę na górze komory.
    3. Wybierz zestaw filtrów dla GCaMP6f i źródła światła (niebieskie światło wzbudzenia, np. 470 – 490 nm; patrz Tabela materiałów). Zlokalizuj astrocyty wykazujące ekspresję OER-GCaMP6f.
    4. Wybierz zestaw filtrów i źródło światła dla RCaMP2 (zielone światło wzbudzenia, np. 510–560 nm; patrz Tabela materiałów) i sprawdź, czy Lck-RCaMP2 ulega ekspresji w tych samych astrocytach. Unikaj długiej ekspozycji na źródło światła, aby zapobiec fotowybielaniu.
    5. Nagrywaj obrazy poklatkowe Lck-RCaMP2 przy 2 Hz przez 2 minuty. Zapisz dane obrazowania na dysku twardym.
    6. Zmień filtr ustawiony na filtr dla GCaMP6f. Nagrywaj zdjęcia poklatkowe OER-GCaMP6f w tym samym polu widzenia, przy 2 Hz przez 2 minuty. Zapisz dane na dysku twardym.
    7. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
  3. Rejestrowanie spontanicznej aktywności neuronalnej i indukowanego wzrostu Ca2+ w neuronach
    nuta: Konfiguracja mikroskopu do obrazowania neuronów jest taka sama, jak opisana w punkcie 3.2. W tym miejscu opisano obrazowanie spontanicznego podwyższenia Ca2+ na skutek Lck-GCaMP6f i podniesienia Ca2+ wywołanego aktywacją mGluR przez OER-GCaMP6f.
    1. Aby zarejestrować spontaniczną aktywność neuronalną, zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki wyrażające Lck-GCaMP6f w komorze zapisu i dodaj 400 μl pożywki do obrazowania. Umieść pokrywę na górze komory.
    2. Ustaw filtr i źródło światła (wzbudzenie niebieskie, np. 470–790 nm; patrz Tabela materiałów) na te dla GCaMP6f. Znajdź neurony wyrażające Lck-GCaMP6f i wykazujące spontaniczną aktywność.
    3. Rejestruj obrazy z częstotliwością 2 Hz lub szybszą. Zapisz dane na dysku twardym.
    4. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    5. Aby zarejestrować indukowane podwyższenie Ca2+, zamontuj szkiełka nakrywkowe zawierające komórki wyrażające OER-GCaMP6f za pomocą pożywki obrazowej o pojemności 400 μl. Umieść pokrywę na górze komory.
    6. Korzystając z zestawu filtrów dla GCaMP6f, znajdź neurony wyrażające OER-GCaMP6f.
    7. Zdejmij pokrywę. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe z częstotliwością 2 Hz lub szybszą. Podczas rejestracji dodaj agonistów receptora sprzężonego z białkiem Gq (np. agonistę mGluR5 [RS]-3,5-dihydroksyfenyloglicyny [DHPG]), aby wywołać uwolnienie Ca2+ z ER.
    8. Zapisz zdjęcia poklatkowe na dysku twardym i przeanalizuj dane.

Wyniki

Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wyeksprymowano w komórkach HeLa, a oba sygnały rejestrowano jednocześnie przy użyciu optyki rozdzielającej obraz, 24 h po transfekcji (Rysunek 3A oraz Wideo 1). Obrazy pozyskiwano z częstotliwością 10 Hz. Podczas rejestracji dodano histaminę (His, 1 µM), która indukuje uwalnianie Ca2+ z ER. Po zastosowaniu His intensywność sygnału Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wzrosła, co obrazuje pseudokolorowy wyświetlacz ΔF/F0, reprezentujący zmianę względem początkowej intensywności fluorescencji (Rysunek 3B). Porównano przebiegi czasowe wzrostu stężenia Ca2+ (ΔF/F0) rejestrowane przez Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w tym samym obszarze zainteresowania (ROI) (Rysunek 3C). Wartości ΔF/F0 znormalizowano do ich wartości szczytowych, aby umożliwić porównanie przebiegów czasowych dwóch różnych GECI, które charakteryzują się różnymi poziomami ekspresji i rozkładem. Oba sensory wykazały oscylacyjny wzrost poziomu Ca2+. Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wykazały taki sam przebieg czasowy wzrostu Ca2+ w dwóch komórkach spośród pięciu badanych typów komórek (Rysunek 3C, ROI 1 i 3). Jednakże wzrosty Ca2+ wykazane przez Lck-RCaMP2 utrzymywały się na wyższym poziomie w porównaniu do wzrostów wykazanych przez OER-GCaMP6f (Rysunek 3C, ROI 2, 4 i 5). Wyniki wskazują, że wzrost poziomu Ca2+ jest przedłużony w sąsiedztwie błony komórkowej, podczas gdy kończy się on wcześniej wokół ER, która stanowi źródło tego sygnału Ca2+ indukowanego stymulacją His.

Spontaniczne sygnały Ca2+ z astrocytów w mieszanych kulturach neuronowo-astrocytarnych z hipokampów szczura (Rycina 4A) i kory mózgu (Rycina 4B) zostały wykazane przy użyciu Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f (Rycina 4, Wideo 2, Wideo 3, Wideo 4 oraz Wideo 5). Kultury korowe odzyskano z zapasów mrożonych, przygotowanych zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Sygnały Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f rejestrowano sekwencyjnie z częstotliwością 2 Hz z tych samych komórek. Wybrano trzy obszary ROI w miejscu, w którym każdy z wskaźników GECI wykazywał wzrost stężenia Ca2+, a przebieg czasowy ΔF/Fbase (tj. intensywność fluorescencji) określono jako zmianę względem średniej intensywności fluorescencji z całego okresu rejestracji (Fbase). Gdy fluorescencja bazowa jest stabilna, a wzrosty Ca2+ występują rzadziej, Fbase staje się użyteczną linią bazową do wykrywania zdarzeń wzrostu Ca2+. Spontaniczne wzrosty Ca2+ były widoczne wyłącznie w wypustkach astrocytarnych, a nie w ciele komórki. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami na temat spontanicznych sygnałów Ca2+ w astrocytach przy użyciu innych wskaźników GECI wizualizowanych in vitro13 oraz in vivo14. Zarówno w astrocytach hipokampalnych, jak i korowych, wzrosty Ca2+ wykazane przez Lck-RCaMP2 (góra) występowały częściej niż te wykazane przez OER-GCaMP6f. Wynik ten jest zgodny z naszym wcześniejszym wykazaniem, że wzrosty Ca2+ w astrocytach wywołane przez Lck-GCaMP6f były wykrywane częściej niż te wywołane przez OER-GCaMP6f7, co sugeruje, że teza ta jest możliwa do zastosowania również na poziomie pojedynczych komórek.

Spontaniczne wzrosty stężenia Ca2+ za pomocą Lck-GCaMP6f w niedojrzałych neuronach hipokampa szczura (10 DIV) zaobserwowano przy częstotliwości 2 Hz (Rysunek 5A i Wideo 6). Przebiegi czasowe ΔF/F0 w pięciu różnych obszarach zainteresowania (ROI) sugerują, że wzrosty Ca2+ są ograniczone lokalnie do domen subkomórkowych. Rysunek 5B (Wideo 7>) przedstawia odpowiedzi Ca2+ w dojrzałych neuronach hipokampa myszy (30 DIV) zainfekowanych wektorami AAV wykazującymi ekspresję OER-GCaMP6f. Neurony stymulowano 10 µM DHPG, który jest agonistą metabotropowych receptorów glutaminianu, indukującym uwalnianie Ca2+. Wykryto uwalnianie Ca2+ indukowane przez DHPG dzięki zastosowaniu OER-GCaMP6f.

Schemat komórkowy przedstawiający sygnalizację Ca2+ z zastosowaniem wskaźników Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający GECI skierowane do błony. Schematyczny rysunek GECI celowanych w błonę plazmatyczną (Lck-GCaMP6f i Lck-RCaMP2) oraz GCaMP6f celowanego w zewnętrzną błonę retikulum endoplazmatycznego (OER-GCaMP6f). 

Schemat przygotowania komórek kory mózgu: etapy hodowli, mrożenia, rozmrażania i transfekcji.
Rysunek 2: Schemat przygotowania komórek hipokampa i kory, transfekcji plazmidowej oraz infekcji AAV. Zdjęcia mikroskopowe są reprezentatywne; po lewej stronie znajdują się świeżo wysiane komórki korowe DIV-6, a po prawej komórki odnowione z zamrożonego banku. Pasek skali = 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat mikroskopii fluorescencyjnej i dane dotyczące dynamiki Ca2+ przy użyciu Lck-RCaMP2 oraz OER-GCaMP6f po podaniu histaminy.
Rysunek 3: Przykład jednoczesnego obrazowania Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komórkach HeLa. (ASchematyczne przedstawienie separacji sygnału za pomocą optyki rozdzielającej obraz. Ten sam obszar widzenia dla Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f jest jednocześnie rzutowany na kamerę. Reprezentatywne nagranie pozyskane przy częstotliwości 10 Hz za pomocą kamery CMOS przedstawiono w Wideo 1, a jedna klatka tego nagrania została przedstawiona na panelu A (prawo). (B) Obrazy w pseudokolorach ΔF/F0 dla Lck-GCaMP2 (góra) oraz OER-GCaMP6f (dół). Histamina (His, 1 µM) dodano w 0 s. (C) Reprezentatywny znormalizowany przebieg czasowy ΔF/F0 dla Lck-GCaMP2 (magenta) oraz OER-GCaMP6f (zielony). Dane znormalizowano do maksymalnej wartości ΔF/F0 dla każdego wykresu. Szare paski wskazują czas aplikacji histaminy (His). Dane przeanalizowano przy użyciu autorskiego oprogramowania TI Workbench.15Pasek skali = 50 µm (obraz mikroskopowy)  Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat obrazowania wapniowego w neuronach; ślady fluorescencji; analiza ΔF/F.
Rysunek 4: Spontaniczne Ca2+2+ wzrost w astrocytach monitorowany pod kątem ekspresji Lck-RCaMP2 oraz OER-GCaMP6f. (A) reprezentatywne obrazy hipokampa i (B) astrocyty korowe przetransfekowane Lck-RCaMP2 (góra) i OER-GCaMP6f (dół). Komórki korowe odzyskano z zamrożonych kultur stokowych. Obrazy Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f pozyskiwano sekwencyjnie w tej samej komórce, z częstotliwością 2 Hz, przy użyciu kamery EM-CCD. Wykresy po lewej stronie przedstawiają przebieg czasowy ΔF/Fbase mierzony w obszarach ROI zaznaczonych na obrazie mikroskopowym. Dane analizowano za pomocą oprogramowania TI Workbench. Rzeczywiste filmy znajdują się w Wideo 2, Wideo 3, Wideo 4i Wideo 5Pasek skali = 20 µm (obraz mikroskopowy). Dryft linii bazowej sugeruje zmiany w globalnym stężeniu Ca2+2+ poziom w komórce.  Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie wapnia w neuronach z wykresem ΔF/F₀; mikroskop fluorescencyjny; analiza aktywności synaptycznej.
Rycina 5: Przykłady Ca2+ obrazowanie w neuronach z użyciem Lck-GCaMP6f i OER-GCaMP6f. (A) Reprezentatywne neurony hipokampa szczura wykazujące ekspresję Lck-GCaMP6f w 10. dniu in vitro (DIV 10) (lewo) oraz wykresy przedstawiające przebiegi czasowe ΔF/F0 zmierzone w obszarach zainteresowania (ROI; żółte okręgi) wskazane na obrazie (prawo). Numery na wykresach przebiegów czasowych odpowiadają numerom ROI na obrazie. Należy zauważyć, że wzorzec czasowy Ca2+ poziom różni się pomiędzy poszczególnymi obszarami zainteresowania. Dryft linii bazowej sugeruje wzrost globalnego stężenia Ca2+ poziom w tym neuronie. (B) Przykład dojrzałych neuronów hipokampa mysiego (DIV 30) zainfekowanych wektorami AAV wykazującymi ekspresję OER-GCaMP6f (po lewej). Wykres przebiegu czasowego zmierzonego ΔF/F0 pokazuje Ca2+ odpowiedź na 100 µM (RS)-3,5-dihydroksyfenyloglicyna (DHPG) podana w czasie wskazanym przez szary pasek. Żółte okręgi wskazują położenie ROI, w których uzyskano przebieg czasowy. Obrazy pozyskano z częstotliwością 2 Hz przy użyciu kamery CCD z chłodzeniem (panel A) lub kamerę EM-CCD (panel B) i przeanalizowano za pomocą programu TI Workbench. Pasek skali = 20 µm (obraz mikroskopowy). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna Lck-RCaMP2, OER-GCaMP6f; obrazowanie komórkowe, dynamika wapnia.
Wideo 1: Przykład jednoczesnego obrazowania Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komórkach HeLa. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 10 Hz i przedstawiony w Rysunek 3Skala = 50 µm.  Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Obraz mikroskopowy, wizualizacja aktywności neuronów, hipokamp, fluorescencja, mapowanie sieci neuronalnych.
Wideo 2: Spontaniczne Ca2+2+ przejściowy wzrost sygnału zaobserwowany w Lck-RCaMP2 w astrocycie hipokampa. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rycina 4A), zarejestrowane w tym samym polu widzenia co Wideo 3Skala = 20 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Obrazowanie wapnia w neuronach, hipokamp, mikroskopia fluorescencyjna, śledzenie aktywności dynamicznej.
Wideo 3: Spontaniczne oscylacje Ca2+2+ przejściowy wzrost poziomu wapnia zaobserwowany w OER-GCaMP6f w astrocycie hipokampa. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rysunek 4A), w tym samym polu widzenia co Wideo 2Pasek skali = 20 µm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten film.

Mikroskopia fluorescencyjna, Lck-RCaMP2, obrazowanie aktywności neuronów kory mózgu, analiza komórek mózgowych.
Wideo 4: Spontaniczne zdarzenia wapniowe (Ca)2+ przejściowy sygnał zaobserwowany w Lck-RCaMP2 w astrocycie korowym Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rycina 4B), zarejestrowane w tym samym polu widzenia co Film 5Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Aktywność neuronalna w korze mózgu, obrazowanie wapniowe, obraz mikroskopowy, wizualizacja fluorescencyjna.
Wideo 5: Spontaniczne Ca2+2+ przejściowy wzrost sygnału zaobserwowany w OER-GCaMP6f w astrocycie korowym. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rycina 4B), w tym samym polu widzenia co Wideo 4Pasek skali = 20 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Obrazowanie komórek neuronalnych, mikroskopia fluorescencyjna, struktura neuronalna, wizualizacja dendrytów, skala 20 μm.
Wideo 6: Przykład Ca2+ obrazowanie w neuronie hipokampa szczura (DIV 10) za pomocą Lck-GCaMP6f. Przykład neuronalnego Ca2+2+ sygnały rejestrowane z częstotliwością 2 Hz (Rysunek 5A). Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej neuronów sieci neuronowej, uwydatniający strukturę i połączenia między komórkami.
Film 7: Ca2+ uwalnianie w neuronie hipokampalnym myszy (DIV 30) wykazującym ekspresję OER-GCaMP6f. Przykład neuronalnego Ca2+2+ sygnały zarejestrowane w neuronie hipokampa myszy zainfekowanym wektorami AAV wykazującymi ekspresję OER-GCaMP6f (Rysunek 5B). Neuron stymulowano za pomocą 100 µM podano dihydroksyfenyloglicynę (DHPG) w 30 s w celu wywołania Ca2+ uwalnianie z ER. Pasek skali = 20 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Różne wyjścia biologiczne są inicjowane przez sygnały Ca2+ . Ca2+ jest wszechstronnym wewnątrzkomórkowym przekaźnikiem sygnałowym. Dekodowanie sygnałów Ca2 + w celu wywołania określonych wyjść było fundamentalnym pytaniem biologicznym i potrzebne są techniki obrazowania Ca2 + w celu opisania różnorodności sygnałów Ca2 + . Obecnie szczegółowy protokół umożliwia wykrywanie wyraźnych sygnałów Ca2 + na błonie plazmatycznej i ER (Figura 3 i Figura 4) oraz lokalnych mikrodomen Ca2+ wewnątrz komórki (Figura 4 i Figura 5). Przyczynia się to do opisania różnorodności wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2 + . Rozdzielczość czasowa sygnałów Ca2 + została również poprawiona poprzez ukierunkowanie GECI w błonie plazmatycznej i ER, ponieważ może uniknąć efektu trójwymiarowej dyfuzji Ca2 + i samych GECI i ma potencjał do wykrycia samego momentu napływu Ca2 + lub uwolnienia Ca2 + , które następuje na błonie.

Protokół ma pewne ograniczenia. Użytkownicy powinni pamiętać, że wykrywane sygnały są sumą "momentu napływu lub uwolnienia Ca2+ " oraz "Ca2+ dyfundowanego z oryginalnego źródła Ca2+ ", szczególnie w przypadku dużych sygnałów Ca2+ . Na przykład, chociaż jego stymulacja w komórkach HeLa wywołuje uwalnianie Ca2 + z ER, jego wynikowe sygnały Ca2 + są wykrywane nie tylko przez OER-GCaMP6f ukierunkowany na ER, ale także przez Lck-RCaMP2 ukierunkowany na błonę plazmatyczną (Figura 3). Innym ograniczeniem jest to, że czasoprzestrzenny wzorzec sygnałów Ca2+ może nie być jedynym wyznacznikiem wyjścia sygnałów Ca2+ . Dystrybucja dalszych białek efektorowych (takich jak kinazy i fosfatazy zależne odCa2+) może być również czynnikiem decydującym2. Aby całkowicie zdekodować wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2 + , absolutnie konieczna jest analiza zachowania enzymów w dalszej części procesu, która nie jest objęta tym protokołem.

Jednym z najbardziej krytycznych aspektów udanego obrazowania Ca2+ jest konfiguracja obrazowania i warunki akwizycji obrazu, a także w innych badaniach obrazowania na żywo. Wcześniej wykazaliśmy, że odpowiedzi Ca2 + w komórce są silnie zależne od czasu trwania i intensywności wzbudzenia oraz od warunków akwizycji obrazu, w tym czasu ekspozycji i częstotliwości akwizycji16. Moc oświetlenia wzbudzenia jest najbardziej krytycznym czynnikiem, ponieważ może powodować toksyczność światła i fotowybielanie GECI. Warunki zapisu czasu ekspozycji, częstotliwości zapisu, natężenia światła wzbudzenia i czasu trwania zapisu powinny być zoptymalizowane zgodnie z celem eksperymentu. Zalecamy maksymalne skrócenie czasu ekspozycji i intensywności światła wzbudzającego, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności dla komórki. Częstotliwość rejestrowania i czas trwania zapisu powinny być wystarczające, aby objąć zdarzenia związane z wysokościąCa2+ będące przedmiotem zainteresowania, ale powinny być utrzymywane na jak najniższym poziomie, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności. Zalecamy najpierw określenie częstotliwości i czasu nagrywania oraz optymalizację natężenia światła i czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie GECI. Kolejnym ważnym czynnikiem jest poziom ekspresji GECI. GECI mają efekt buforowania Ca2 +, ponieważ są białkami wiążącymi Ca2 +. Dlatego nadekspresja GECI powoduje buforowanie Ca2 +, który jest fizjologicznie niezbędny dla komórek. Ilość ekspresji GECI powinna być zminimalizowana, aby uniknąć obrazowania komórek wyrażających duże ilości GECI.
 
Podsumowując, rozbiór sygnałów Ca2 + w rozdzielczości subkomórkowej jest jednym z najważniejszych etapów dekodowania wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2 + , które określają wyjściowe zjawisko biologiczne. Protokół ten zapewnia nową metodę analizy sygnałów Ca2+ w celu opisania różnorodności między tymi sygnałami. Obecnie technika ta jest ograniczona do eksperymentów in vitro. Jednak Lck-GCaMP6f jest już stosowany do obrazowania in vivo Ca2 + u myszy17, a potwierdzono OER-GCaMP6f do monitorowania sygnałów Ca2 + in vivo w neuronach ruchowych VD u C. elegans7. W związku z tym celowanie w GECI w przedziale subkomórkowym może zostać w przyszłości rozszerzone na obrazowanie in vivo, umożliwiając w ten sposób rozwarstwienie Ca2+ in vivo.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez następujące granty: Japońska Agencja Nauki i Technologii (JST)/ Prekursorskie Badania nad Embrionalną Nauką i Technologią (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japonia); Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS)/Granty na Pomoc dla Badań Naukowych (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Fundacja Takeda. Autorzy dziękują Haruhiko Bito (Uniwersytet Tokijski) za dostarczenie RCaMP2 oraz Arthurowi J.Y. Huangowi i Thomasowi McHugh (RIKEN CBS) za dostarczenie wektorów AAV i instrukcje dotyczące przygotowania AAV. Autorzy chcieliby również podziękować redaktorom Journal of Visualized Experiments za ich pomoc w kręceniu i montażu filmów.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(RS)-3,5-Dihydroksyfenyloglicyna (DHPG)Tocris#0342
0,5% roztwór podstawowy DNazy ISigma-Aldrich#11284932001Przygotować 0,5% DNazy I (w/v) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa  uzupełnionym 120 mM MgSO4. Przygotuj 160 &mikro; L porcji i przechowywać w temperaturze -30 °C.
0,5% roztwór trypsyny-EDTAThermo Fisher Scientific#25300054
100 mM L-glutamina (&razy; 100 zapasów)Thermo Fisher Scientific#25030081Przygotowanie małych porcji 250-750 &mikro; L i przechowywać w temperaturze -30 stopni Celsjusza.
100 mM pirogronian sodu (&razy; 100 zapasów)Thermo Fisher Scientific#11360070Podwielokrotności (10 ml) można przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Po rozmrożeniu roztwór można utrzymywać w temperaturze 4 & stopni; C przez 2 miesiące.
12-dołkowe płytki do hodowli wielodołkowej z pokrywką o niskiej parowaniuFalcon#353043Pokrywka o niskiej parowaniu ma kluczowe znaczenie dla hodowli mieszanej kultury neuronów i gleju. W przypadku komórek linii komórkowej można zastosować alternatywne szalki hodowlane.
Szkiełka nakrywkowe okrągłe o średnicy 18 mmKarl Hecht "Assistent"#41001118Grubość 1, szkiełka nakrywkowe okrągłe o średnicy 18 mm; można stosować alternatywne szkiełka nakrywkowe.
1 M HEPESThermo Fisher Scientific#15630080pH 7,2-7,6
2,5% roztwór podstawowy trypsyny (&razy; 20 zapasów)Sigma-Aldrich#T4674Przygotuj 150 &mikro; L i przechowywać w temperaturze -30 °C.
50% roztwór poli(etyleniminy) (PEI) Sigma-Aldrich#P3143Przygotować 2% (V/V) roztwór podstawowy PEI (&razy; 50) z wodą destylowaną sterylizowaną przez filtrację. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -30 stopni Celsjusza. C po przygotowaniu małych porcji 250-750 &mikro;L. Przygotować 0,04% roztwór PEI z wodą destylowaną w dniu powlekania szkiełka nakrywkowego.
70% etanoluPrzechowywany w butelce z rozpylaczem do dezynfekcji powierzchni.
Wirus związany z adenowirusem (AAV) dla ekspresji Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-RCaMP2 pod kierunkiem promotoraEF1a AAV można przygotować przy użyciu AAV Helper Free System (Agilent Technologies) i komórek HEK293 lub metod alternatywnych. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 i  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f są dostępne na życzenie.
B-27 suplement (&razy; 50 stock)Thermo Fisher Scientific#17504044Można go zastąpić suplementem B-27 plus (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) lub MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy; #130-093-566).
B57BL/6Japonia SLC, Inc.
Kamera do rejestracjiDostępne były następujące kamery: chłodzona kamera CCD (np. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), kamera EM-CCD (np. Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) lub  Kamera CMOS (np. Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Pojemnik do zamrażania komórekSarstedt K.K.#95.64.253Można użyć alternatywnego pojemnika do zamrażania komórek.
Sitko komórkoweFalcon#352350
InkubatorUtrzymuj na poziomie 37 ° C, 5% CO2.
Rurka kriogenicznaCorning#430661Można zastosować alternatywne rurki kriogeniczne.
Pożywka do kriokonserwacjiZenoaq"CELLBANKER1"
Pożywka hodowlana (dla komórek HeLa)Zmodyfikowana pożywka Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i roztworem penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie: penicylina 100 U/ml i Streptomycyna 100 &mikro; g/mL)
Podłoże preparacyjne Jeden mililitr 1 M HEPES (stężenie końcowe 20 mM) do 49 ml DMEM 
DMEMNacalai#08456-65Można użyć alternatywnego DMEM.
DMEMNacalai#08456-65Odczynnik
do transfekcji DNASigma-Aldrich# 6366244001"Odczynnik do transfekcji DNA X-tremegene HP"
Można stosować alternatywne odczynniki do transfekcji.
Szklany słoik z pokrywkąSłoik 500 ml (dla myszy) lub słoik 1 500 ml (dla szczura) do znieczulenia zwierzęcia 
HBSSThermo Fisher Scientific#14170161HBSS bez wapnia i magnezu
Inaktywowana termicznie surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific#10100147
Komórki HeLaRIKEN BioResource Center#RCB0007
HistaminaSigma-Aldrich#H7125
Oprogramowanie doanalizy obrazuTakich jak Metamorph (urządzenia molekularne), ImageJ (NIH) i TI Workbench14 (wykonane na zamówienie) 
Optyka dzieląca obrazHamamatsu Photonics#A12801-01W-view GEMINI
Optyka rozdzielająca obraz zwierciadło dichroiczneSemrock#FF560-FDi01-25&razy; 36Do oddzielania białka fluorescencyjnego zielonego/białka fluorescencyjnego czerwonego  Sygnał (GFP/RFP)
Filtry emisyjne optyki rozszczepiającej obrazSemrock#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25Do emisji sygnału GFP/RFP, odpowiednio
Medium obrazowania i buforUżyj optymalnego podłoża lub bufora do eksperymentu. W przypadku stosowania pożywki pożądane jest podłoże bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia fluorescencji tła. Dodać 20 mM HEPES, aby utrzymać pH poza inkubatorem CO2.
Inkubacja soli fizjologicznej Dodaj 1 ml 1 M HEPES (20 mM) do 49 ml HBSS
Odwrócony mikroskoptaki jak IX73 (Olympus) lub  Eclipse TI (Nikon Instech)
IsofluranePfizerUżywany do znieczulenia
Pożywka podtrzymująca (na 4 i 12 dołków)48,5 ml Pożywka Neurobaseal-A uzupełniona 1 ml B-27, 500 &mikro; L zapasu L-glutaminy i 25 &mikro; L Roztwór penicyliny-streptomycyny.
Pożywka konserwacyjna dla zamrożonych komórek korowych (na 1 i 12 dołków) 12,2 ml Neurobasal plus pożywka uzupełniona o 250 &mikro; L B-27, 125 &mikro; L zapasu L-glutaminy i 6,2 &mikro; L Roztwór penicyliny-streptomycyny.
MEM (Minimum Essential Medium)Thermo Fisher Scientific#11090-081
Zestaw filtrów mikroskopowych do obrazowaniaOdpowiedni filtr do GFP (wzbudzenie, 480 ± 10 nm; emisja, 530 ± 20 nm)
Zestaw filtrów mikroskopowych do obrazowaniaOdpowiedni filtr do RFP (wzbudzenie, 535 ± 50 nm; emisja, 590 nm długi przepust)
Zestawy filtrów mikroskopowych do podwójnego obrazowania RCaMP2 i GCaMP6fSemrock#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&razy; 36, #FF01-512 / 630-25Podwójny filtr wzbudzenia, podwójne zwierciadło dichroiczne i filtr emisyjny do obrazowania GFP / RFP.
Systemmikroskopu System grzewczy do utrzymywania komórek w temperaturze 37 & stopni; C podczas obrazowania. Aby uniknąć dryftu spowodowanego rozszerzalnością cieplną, zaleca się stosowanie systemów grzewczych obejmujących cały mikroskop (np. Tokai Hit, Thermobox).
Mikroskopowe źródło światła do wzbudzeniaLampa rtęciowa (100 W), lampa ksenonowa (75 W), system oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) (np. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., źródło LED o 4 długościach fali; Lumencor, lekki silnik SPECTRA X). W przypadku bryły rtęci i lampy ksenonowej należy użyć filtra ND, aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia.
obiektywu mikroskopuPlan-apochromatyczny obiektyw immersyjny z olejkiem o aperturze numerycznej większej niż 1,3 jest wysoce zalecany do rejestrowania spontanicznej aktywności Ca2+ w neuronach i astrocytach.
Neurobasal plus mediumThermo Fisher Scientific#A3582901
Neurobasal-A mediumThermo Fisher Scientific#10888022Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) może być stosowane zamiast podłoża Neurobasal-A.
PBS(-): Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, wolna od Ca2+ i Mg2+ Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation#164-23551Brak Ca2+ i Mg2+ ma kluczowe znaczenie, aby nie hamować aktywności trypsyny. Można zastosować alternatywę dla PBS(-).
Komputer i oprogramowanie do, takie jak Metamorph (urządzenia molekularne); Mikromenedżer; TI Workbench14.
Roztwór penicyliny-streptomycynyThermo Fisher Scientific#15140122Penicylina 10 000 U/ml i Streptomycyna 10 000 &mikro; g/mL 
Plazmid do ekspresji Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-RCaMP2 pod promotorem wirusa cytomegalii 7-9Dostępne na żądanie
Pożywka galwaniczna (na 4 i 12 dołków)48 ml MEM uzupełniony 1 ml suplementu B-27, 500 &mikro; L L-glutamina (stężenie końcowe: 2 mM), 500 &mikro; L pirogronianu sodu (1 mM) i 25 &mikro; L roztwór penicyliny-streptomycyny (penicylina 5 j./ml, streptomycyna 5 i mikro; g/ml). To stężenie penicyliny-streptomycyny, które wynosi 1/20 z  Stężenie zalecane przez producenta, ma kluczowe znaczenie dla przeżycia neuronów.
Komora nagraniowaElveflowLudin ChamberTa komora nagraniowa jest przeznaczona do okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm.
Zredukowane podłoże w surowicyTermo Fisher#11058021Stereomikroskop
Służy do preparowania hipokampów. Dostępne są mikroskopy stereoskopowe Olympus SZ60 lub ich odpowiedniki.
NarzędziaStandardowe nożyczki preparacyjne do cięcia brzucha myszy lub szczura, pęseta do szczypania macicy, delikatne nożyczki preparacyjne do cięcia macicy i głowy zarodka, kleszcze pierścieniowe do szczypania zarodków, 13 cm zakrzywione kleszcze Semken (Fine Science Tools #11009-13) do ekstrakcji mózgu,  3 kleszcze z cienkimi końcówkami  (Dumont Inox #5)
Odczynnik do transfekcji do neuronuThermo Fisher Scientific#L3000008odczynnik "Lipofectamine 3000".
Składa się z "suplementu (P3000)", który należy wymieszać z plazmidowym DNA w kroku 2.2.3, oraz "odczynnika do transfekcji (lipofektamina 3000)" użytego w kroku 2.2.4.
Błękit trypanowy (0,4%)Thermo Fisher Scientific#15250061
Środek myjący do zamrożonych komórek korowych 25 ml DMEM, uzupełniony 250 &mikro; L inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca + 12,5 &mikro; L Penicylina Streptomycyna.
Szczury WistarJaponia SLC, IncCiężarne szczury (E18)
obrazu mikroskopowego CO o niskim poziomie glukozy fluorescencyjny, GCaMP6f RCaMP2 grzewczy Soczewka akwizycji obrazu Opti-MEM chirurgiczne

Bibliografia

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
  3. Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
  4. Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
  5. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
  6. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  7. Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
  8. Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
  9. Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
  10. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
  11. Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
  12. Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
  13. Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).
  14. Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
  15. Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
  16. Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
  17. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie wapniagenetycznie kodowane wska nikiOER GCaMP6fLck RCaMP2monitorowanie nap ywu wapniadetekcja uwalniania wapniaobrazowanie w rozdzielczo ci subkom rkowejtransfekcja kultur kom rkowychmikroskopia poklatkowa

Powiązane artykuły