Artykuł metodologiczny

Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416

DOI:

10.3791/59252

⸱

3 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadciśnienie płucne (PH) jest stanem patofizjologicznym, definiowanym przez średnie ciśnienie w tętnicy płucnej przekraczające 25 mm Hg w spoczynku, oceniane za pomocą cewnikowania prawego serca. Do PH może prowadzić szerokie spektrum chorób, różniących się etiologią, histopatologią, obrazem klinicznym, rokowaniem i odpowiedzią na leczenie. Pomimo znacznego postępu w ostatnich latach, PH pozostaje nieuleczoną chorobą. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska może utorować drogę do opracowania nowych terapii. Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami badawczymi do osiągnięcia tego celu. Obecnie dostępnych jest kilka modeli do rekapitulacji PH. Ten protokół opisuje model PH myszy z dwoma trafieniami. Bodźcami do rozwoju pH są niedotlenienie i wstrzyknięcie SU5416, antagonisty receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Trzy tygodnie po rozpoczęciu hipoksji/SU5416 u zwierząt rozwija się przebudowa naczyń płucnych imitująca zmiany histopatologiczne obserwowane w pH człowieka (głównie Grupa 1). Przebudowa naczyń krwionośnych w krążeniu płucnym powoduje przebudowę prawej komory (RV). Szczegółowo opisano procedury pomiaru ciśnienia RV (metodą otwartej klatki piersiowej), analizy morfometryczne RV (poprzez preparowanie i ważenie obu komór serca) oraz oceny histologiczne przebudowy (zarówno płucnej poprzez ocenę przebudowy naczyń krwionośnych, jak i sercowej poprzez ocenę przerostu i zwłóknienia kardiomiocytów RV). Zaletami tego protokołu są możliwość zastosowania zarówno u myszy dzikich, jak i modyfikowanych genetycznie, stosunkowo łatwe i tanie wdrożenie oraz szybki rozwój choroby będącej przedmiotem zainteresowania (3 tygodnie). Ograniczenia tej metody polegają na tym, że myszy nie rozwijają ciężkiego fenotypu, a PH jest odwracalne po powrocie do normoksji. Zarówno badania prewencyjne, jak i terapeutyczne mogą być łatwo realizowane w tym modelu, bez konieczności posiadania zaawansowanych umiejętności (w przeciwieństwie do chirurgicznych modeli gryzoni).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadciśnienie płucne (PH) jest stanem patofizjologicznym, definiowanym przez średnie ciśnienie w tętnicy płucnej (PA) przekraczające 25 mm Hg w spoczynku, oceniane za pomocą cewnikowania prawego serca1,2. Istnieje wiele chorób, które mogą prowadzić do PH. Próbując uporządkować warunki związane z PH, opracowano kilka systemów klasyfikacji. Obecna klasyfikacja kliniczna kategoryzuje wiele chorób związanych z PH w 5 różnych grupach1. To rozróżnienie jest ważne, ponieważ różne grupy pacjentów mają choroby, które różnią się obrazem klinicznym, patologią, rokowaniem i odpowiedzią na leczenie2. Tabela 1 podsumowuje aktualną klasyfikację, uzupełnioną o podstawowe charakterystyki histopatologiczne każdej choroby.

figure-introduction-1
Tabela 1: Przegląd klasyfikacji klinicznej PH wraz z głównymi cechami histopatologicznymi w grupach. Przydatność protokołu Hypoxia/SU5416 do modelowania PH. Ta tabela została zmodyfikowana z19. PH: Nadciśnienie płucne, PAH: Tętnicze nadciśnienie płucne

Pomimo znacznego postępu w leczeniu chorób związanych z PH, PH nadal pozostaje bez lekarstwa, z 3-letnią śmiertelnością wahającą się między 20% a 80%3. Wskazuje to na pilną potrzebę zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw PH, a następnie opracowania nowych terapii w celu zapobiegania, spowalniania postępu i leczenia choroby. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie w tym zakresie. Obecnie istnieją różne modele do badania PH. Zainteresowanego czytelnika odsyłamy do doskonałych recenzji na ten temat2,3,4. Biorąc pod uwagę różnorodność chorób prowadzących do PH, oczywiste jest, że różnorodność schorzeń ludzkiego PH nie może być idealnie podsumowana w jednym modelu zwierzęcym. Dostępne modele zwierzęce można podzielić na następujące kategorie: i) pojedyncze trafienie, ii) dwa trafienia, iii) nokaut i iv) modele nadekspresji3. W modelach z pojedynczym uderzeniem PH jest indukowane przez pojedynczy bodziec patologiczny, podczas gdy modele z dwoma uderzeniami łączą dwa bodźce patologiczne w celu wywołania poważniejszego PH, a tym samym ściślej imitują złożoną chorobę człowieka. Oprócz różnic etiologicznych, kilka bodźców powoduje różnice w modelowaniu pH, które zależą również od gatunku i tła genetycznego zwierząt4.

Jednym z najczęściej używanych klasycznych modeli gryzoni PH jest model przewlekłego niedotlenienia2. Wiadomo, że niedotlenienie wywołuje pH u ludzi, a także u kilku gatunków zwierząt. Niedotlenienie ma tę zaletę, że jest bodźcem fizjologicznym dla PH (Tabela 1). Jednakże, podczas gdy stopień niedotlenienia stosowany do indukowania pH u gryzoni jest znacznie poważniejszy niż u ludzi, pojedyncza zniewaga (niedotlenienie) prowadzi jedynie do łagodnej formy przebudowy naczyń krwionośnych. Nie imituje to nasilenia choroby u ludzi. Dodanie drugiego uderzenia, dodatkowego bodźca do indukowania PH, wykazało obiecujące wyniki: wstrzyknięcie związku SU5416 gryzoniom w połączeniu z bodźcem hipoksyjnym indukuje poważniejszy fenotyp PH2,5,6. SU5416 jest inhibitorem receptora 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Blokuje receptory VEGF i prowadzi do apoptozy komórek śródbłonka. W warunkach niedotlenienia stymuluje to proliferację podzbioru komórek śródbłonka opornych na apoptozę. Ponadto SU5416 prowadzi do proliferacji komórek mięśni gładkich. Połączenie tych efektów powoduje patologiczną przebudowę krążenia płucnego i prowadzi do podwyższonego ciśnienia PA i przebudowy prawej komory2,5,7. Model został po raz pierwszy opisany w rats6, a później zastosowany do myszy4,5,7. Model mysi wykazuje mniej poważną przebudowę naczyń krwionośnych w porównaniu ze szczurami. Co więcej, po powrocie do normoksji PH nadal postępuje u szczurów, podczas gdy u myszy jest częściowo odwracalne.

Poniższy protokół opisuje wszystkie kroki modelowania PH u myszy przy użyciu metody Hypoxia/SU5416 (planowanie, oś czasu, wykonanie). Dodatkowo w niniejszym protokole opisano charakterystykę modelu: funkcjonalnie (poprzez inwazyjny pomiar ciśnienia w prawej komorze (RV) techniką otwartej klatki piersiowej), morfometrycznie (poprzez wypreparowanie i zważenie zarówno prawej, jak i lewej komory), a także histologicznie (poprzez ocenę przebudowy naczyń płucnych, przerostu i zwłóknienia kardiomiocytów prawej komory).

Wszystkie kroki i metody opisane w tym protokole mogą być łatwo wdrożone przez badaczy na każdym poziomie doświadczenia. Chociaż pomiary funkcjonalne RV przy użyciu techniki otwartej klatki piersiowej (opisane tutaj) nie są złotym standardem w tej dziedzinie, mają tę zaletę, że mogą być szybko nauczone i dokładnie odtworzone nawet przez mniej doświadczonego eksperymentatora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach uzyskaj zgodę lokalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami. Obecne eksperymenty zostały przeprowadzone po zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

1. Indukcja pH

  1. preparat
    1. Przed rozpoczęciem badania należy dokładnie zaplanować projekt eksperymentu. Upewnij się, że myszy są poddawane hipoksji w tym samym momencie, w którym wykonano pierwsze wstrzyknięcie SU5416. Przykład eksperymentalnego projektu indukowania pH przy użyciu metody hipoksji/SU5416 pokazano w Rysunek 1A. Myszy kontrolne otrzymały tylko pojazd. W przypadku tego modelu SU5416 będzie wstrzykiwany myszom raz w tygodniu przez 3 kolejne tygodnie.
    2. Do tego badania użyj od ośmiu do dwunastu tygodni myszy C57BL/6. Trzymaj zwierzęta w temperaturze 18-20 °C w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym. Upewnij się, że jedzenie i woda są dostępne ad libitum.
    3. Zważ zwierzęta. Przypisz je losowo do każdej grupy: Normoxia i Hypoxia/SU5416.
    4. Przygotuj komorę hipoksyjną, jak pokazano na Rysunek 1B. Zabezpiecz zbiorniki z azotem (N2) w pobliżu komory. Ustawić regulator tlenu (O2) w punkcie 10%O2. Pozwól, aby system osiągnął stan ustalony.
    5. Przygotować SU5416 do wstrzykiwań (stosować dawkę 20 mg/kg masy ciała). SU5416 nie rozpuszcza się w roztworach wodnych; dlatego obliczoną ilość rozpuść w 100 μL DMSO8. Na przykład w przypadku myszy o masie 25 g ilość SU5416 do wstrzyknięcia wynosi 0,5 mg rozpuszczonej w 100 μl rozpuszczalnika (DMSO). Końcowe stężenie SU5416 dla tej myszy wynosi zatem 5 mg/mL.
      UWAGA: SU5416 jest materiałem niebezpiecznym. Należy uważnie przeczytać kartę charakterystyki dołączoną do produktu i upewnić się, że podjęto zalecane środki ostrożności podczas obchodzenia się z tą substancją. Nosić rękawice ochronne i (jak w przypadku każdego wstrzyknięcia) stosować okulary ochronne. Struktura chemiczna SU5416 jest pokazana w Rysunek 1C.
      UWAGA: Obliczyć odpowiedni nadmiar roztworu, aby skompensować objętość, która zostanie utracona podczas wstrzykiwania (np. w strzykawce, fiolce itp.). W zależności od użytej strzykawki, objętość martwa wynosi około 200 μl. Dla grupy 10 myszy oblicz nadmiar 2 dawek myszy.
    6. Przygotować strzykawki do wstrzyknięcia. Używaj strzykawek o pojemności 1 ml z igłami 25 G x 5/8".
  2. SU5416 wstrzyknięcie podskórne
    1. Unieruchomić zwierzę. Umieść mysz na pokrywie klatki, aby wspomóc unieruchomienie. Chwyć skórę i uformuj namiot równolegle do kręgosłupa. Upewnij się, że mocno chwytasz za tył głowy, aby uniknąć potencjalnego ugryzienia przez mysz.
      UWAGA: Obecność dwóch badaczy sprawia, że procedura jest szybsza i dokładniejsza, ponieważ jeden może trzymać zwierzę, podczas gdy drugi wykonuje wstrzyknięcie.
    2. Wprowadzić igłę podskórnie na bok w luźnym fałdzie skóry. Upewnij się, że igła jest wkładana równolegle do skóry. Unikaj penetracji ściany brzucha.
    3. Wstrzyknąć zawartość strzykawki (100 μl rozpuszczonego SU5416 lub nośnika).
      UWAGA: Aby uniknąć wycieku po całkowitym podaniu, należy przytrzymać strzykawkę przez około 10 s i lekko obrócić igłę pod skórą.
    4. Wyjmij igłę i umieść zwierzę z powrotem w klatce. Po wstrzyknięciu SU5416 umieścić klatki w wentylowanej komorze do hipoksji.
  3. Narażenie na niedotlenienie
    1. Monitoruj wentylację w czasie. Upewnij się, że utrzymujesz 10% dopływu tlenu. Utrzymuj zwierzęta z normoksją w półzamykanej komorze w temperaturze 21%O2.
    2. Upewnij się, że komory są wyposażone w czujnik tlenu do pomiaru poziomu tlenu. Unikaj szerokiego otwierania komór. W celu oczyszczenia i dodania pokarmu i wody należy otwierać komory na nie dłużej niż 20 minut co 3 dni.
    3. Codziennie sprawdzaj zwierzęta. Weź pod uwagę sygnały stresowe, takie jak piloerekcja lub znaczna utrata wagi.
      UWAGA: Oczekuje się, że zwierzęta w stanie niedotlenienia/SU5416 stracą na wadze5. Jest to wskaźnik rozwoju choroby.
    4. Powtarzaj wstrzyknięcie SU5416 co tydzień przez 3 kolejne tygodnie (patrz Rysunek 1A dla przeglądu projektu eksperymentalnego).
      UWAGA: Zmiana miejsca wstrzyknięcia może pomóc w zmniejszeniu podrażnień skóry.

2. Charakterystyka funkcjonalna za pomocą inwazyjnych pomiarów ciśnienia w kamperze

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Wybierz schemat znieczulania. Można stosować środki znieczulające do wstrzykiwań lub wziewności. Ponieważ niewielkie przedawkowanie środków znieczulających do wstrzykiwań (zwłaszcza ketaminy/ksylazyny lub pentobarbitalu) może znacząco wpłynąć na czynność serca, zaleca się stosowanie lotnych środków znieczulających. Bardzo ważne jest, aby stosować ten sam środek znieczulający dla wszystkich myszy w badaniu.
    1. Użyj waporyzatora, aby zapewnić dokładną dawkę środka znieczulającego na zwierzę. Dawka izofluranu jest następująca: indukcja 3-4%, leczenie podtrzymujące 1% zmieszane ze 100% tlenem.
      UWAGA: Nosić środki ochrony osobistej i unikać wdychania oparów.
    2. Przygotuj poduszkę grzewczą i/lub lampy grzewcze do utrzymywania temperatury ciała. Przygotuj sondę temperatury doodbytniczej do monitorowania temperatury ciała.
    3. Zapewnij odpowiednią wentylację. Przygotuj wcześniej respirator. Przygotuj łącznik rurki Y i sprawdź działanie wentylatora w trybie ręcznym. Upewnij się, że ciśnienie wdechowe wynosi <1 cm H2O, aby uniknąć barotraumy. Ustaw częstość oddechów na 110 oddechów/min.
    4. Przygotuj rurkę dotchawiczą, przecinając cewnik wewnątrznaczyniowy o masie 20 g.
    5. Przygotuj potrzebne narzędzia: małe kleszcze, nożyczki, elastyczne zwijacze haczykowe, kauteryzator do naczyń i waciki. Na bawełnianym waciku wyreguluj małą igłę 25 G x 5/8", która zostanie użyta do wykonania małego nakłucia w prawej komorze.
    6. Przygotuj cewnik ciśnieniowy, jednostkę kontroli ciśnienia i objętości i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Umieść cewnik PV w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej PBS w temperaturze 37 °C na 15 minut i skalibruj zgodnie z protokołem producenta.
    7. Do perfuzji i zespolenia narządów należy przygotować PBS i roztwór 50% PBS / 50% OCT. Przygotować 2 strzykawki po 10 ml (z igłą 25 G): jedna będzie używana do perfuzji serca i płuc za pomocą PBS in situ, a druga do wstrzykiwania roztworu OCT/PBS (50/50) do próbki płuc, która zostanie użyta do badania histologicznego.
  2. Intubacja
    1. Zważ mysz i zapisz stan zdrowia przed znieczuleniem.
    2. Wywołaj znieczulenie 3-4% izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch szczypania palca u nogi: mocno ściśnij palec jednej z kończyn. Jeśli zwierzę wycofa kończynę, jest to oznaką niewystarczającego znieczulenia.
    3. Po indukcji znieczulenia ogolić szyję i klatkę piersiową.
    4. Umieść mysz na poduszce grzewczej. Umieść sondę temperatury w odbycie do monitorowania temperatury ciała.
      UWAGA: Utrzymanie temperatury ciała ma znaczenie dla pomiarów funkcjonalnych. Temperatura ciała powinna wynosić około 36,5-37 °C.
    5. Za pomocą zakrzywionych kleszczy przymocuj nić do szwów do górnych siekaczy myszy, rozciągnij i przymocuj do poduszki grzewczej za pomocą taśmy chirurgicznej. Zabezpiecz kończyny myszy za pomocą taśm chirurgicznych.
    6. W celu zaintubowania zwierzęcia należy wykonać małe nacięcie o długości około 1 cm w przyśrodkowej skórze szyjki macicy za pomocą małych nożyczek.
      UWAGA: Intubacja doustna jest alternatywną metodą, która wymaga większego doświadczenia.
    7. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką oddziel tępo śliniankę przyuszną i podżuchwową na środkowym poziomie. Spowoduje to odsłonięcie mięśni leżących nad tchawicą.
    8. Ostrożnie przetnij te mięśnie, odsłaniając tchawicę.
    9. Małymi nożyczkami wykonaj małe nacięcie między chrząstkami tchawicy i wprowadź przygotowaną rurkę dotchawiczą. Wyjmij metalową prowadnicę cewnika wewnątrznaczyniowego.
    10. Podłączyć cewnik do respiratora. Sprawdź położenie rurki dotchawiczej, ręcznie delikatnie napompowując płuca. Zabezpiecz pozycję taśmą.
    11. Utrzymuj 1% znieczulenie izofluranem przez cały czas trwania zabiegu.
    12. Regularnie monitoruj głębokość znieczulenia, testując odruch szczypania palca u nogi. Odpowiednio dostosuj znieczulenie.
      UWAGA: Zalecane tętno podczas eksperymentów, przy znieczuleniu izofluranem o stężeniu 1%, wynosi około 400 uderzeń / min. Utrzymanie temperatury ciała i znieczulenie są niezbędne do kontrolowania tętna. Nadmiar izofluranu może zmniejszać częstość akcji serca. Jednak powrót do zdrowia można osiągnąć poprzez zmniejszenie dawki izofluranu.
  3. Pomiary ciśnienia w kamperze (podejście z otwartą klatką piersiową)
    1. Małymi nożyczkami wykonaj nacięcie skóry o długości około 1 cm nad wyrostkiem mieczykowatym i górną częścią brzucha. Oddziel skórę pokrywającą klatkę piersiową i ścianę brzucha w górnej części kwadrantów brzucha: zacznij od linii środkowej, dystalnie do mieczykowatej i ostrożnie przesuwaj się na boki po obu stronach. Użyj termokoagulacji, aby zatamować krwawienie.
      UWAGA: Celem jest dostęp do jamy klatki piersiowej przez ścianę brzucha.
    2. Otwórz jamę brzuszną i ostrożnie przetnij przeponę, uważając, aby nie uszkodzić bijącego serca lub płuc.
      UWAGA: Celem jest odsłonięcie wierzchołka i prawej komory serca. Dobra ekspozycja i widok serca mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego umieszczenia cewnika. Bardzo ważne jest, aby uniknąć krwawienia przez cały czas trwania zabiegu. Nawet niewielkie zmiany w objętości wewnątrznaczyniowej mogą zmienić obciążenie prawego serca i wpłynąć na rejestrowane parametry.
    3. Delikatnie usuń osierdzie za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
    4. Tuż przed umieszczeniem cewnika ciśnieniowego w sercu przyłóż cewnik do myszy.
    5. Za pomocą przygotowanego aplikatora z bawełnianą końcówką z igłą tworzy się ranę kłutą w wierzchołkowej dystalnej części prawej komory. Ostrożnie wyjmij igłę i włóż cewnik ciśnieniowy do tego otworu.
      UWAGA: Powinno to działać bez użycia siły. Jeśli nie jest to możliwe, spróbuj zrobić nowy otwór w pobliżu pierwszego, aby uniknąć przedłużającego się uszkodzenia serca. Igły nie należy wbijać głębiej niż około 3 mm.
    6. Wprowadzić cewnik ciśnieniowy równolegle do kierunku prawej komory, końcówką skierowaną w stronę tętnicy płucnej.
    7. Obserwuj śledzenie fali ciśnienia, aby upewnić się, że cewnik jest prawidłowo ustawiony. Reprezentatywne ślady są pokazane w Rysunek 2.
    8. Poczekaj, aż sygnał ciśnienia się ustabilizuje. Wstrzymaj oddychanie i wykonaj co najmniej 3 pomiary. Pomiędzy poszczególnymi pomiarami można wentylować zwierzę.
    9. Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów wyjmij cewnik i umieść go z powrotem w probówce wypełnionej PBS w łaźni wodnej.
      UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu wyczyść cewnik zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Eutanazja i perfuzja płuc
    1. Po zakończeniu eksperymentu poddaj mysz eutanazji przez wykrwawienie.
    2. Otwórz szeroko skrzynię. Za pomocą nożyczek przetnij cały mostek i uważaj, aby nie uszkodzić serca ani płuc.
    3. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonuje małe nacięcie w lewej komorze, aby krew mogła opuścić komorę.
    4. Umieścić igłę 25 G strzykawki zawierającej 10 ml PBS w prawej komorze i wstrzykiwać roztwór PBS do momentu oczyszczenia płuc z krwi.
    5. Po zakończeniu tego etapu potwierdź eutanazję poprzez pobranie niezbędnych tkanek (serca i płuc): przetnij przyczepy główne i aortalne oraz usuń serce i płuca en block.

3. Charakterystyka morfometryczna

  1. Natychmiast po usunięciu serca i płuc (Krok 2.4.5) należy odizolować serce i usunąć oba przedsionki. Za pomocą zakrzywionych nożyczek do tenotomii ostrożnie wypreparuj prawą komorę (RV) od lewej komory (LV), pozostawiając przegrodę (S) z lewą komorą. Zważ RV i LV+S i oblicz indeks Fultona= RV/LV+ S (Rysunek 3)5,9.
  2. Weź część prawej komory i umieść ją w wstępnie napełnionej formie do zatapiania OCT. Użyj drugiej części prawej komory do analizy RNA i/lub białka. Zamrozić w suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Użyj nożyczek do tęczówki, aby odizolować płuca od serca i wszelkich innych pozostałych tkanek.
    UWAGA: Dla przygotowania płuc duże znaczenie ma opisana powyżej perfuzja (kroki 2.4.3-2.4.5).
  4. Zamroź część płuc i przechowuj ją do RNA, ekstrakcji białka lub innych testów.
  5. Użyj drugiej części płuc do analizy histologicznej. W tym celu należy włożyć strzykawkę zawierającą 50% PBS i 50% OCT do oskrzela używanego lobe10,11. Eksperymentator może łatwo zauważyć, że płuco zostaje napompowane, gdy zawartość strzykawki jest perfundowana w tkance.
  6. Umieść te kawałki płuc w foremkach do osadzania wstępnie wypełnionych OCT i zatrzaskowo zamroź je w suchym lodzie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C po ich zamrożeniu.
  7. Przygotować 8 μm skrawki RV i płuc za pomocą maszyny do kriostatu. Suszyć sekcje na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  8. Utrwal szkiełka w temperaturze pokojowej za pomocą 10% paraformaldehydu (PFA) przez 10 min.
    UWAGA: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w Karcie Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS).
  9. Ocena przebudowy naczyń krwionośnych za pomocą barwienia Hematoxylin/Eozyna
    Uwaga: Wykonaj barwienie Hematoxyliną/Eozyną, aby ocenić zmiany strukturalne serca i przebudowę naczyń krwionośnych w płucach (Ryc. 3).
    1. Barwieć roztworem Hematoksyliny przez 8 min.
    2. Spłukiwać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie szybko spłukać w wodzie destylowanej.
    3. Płukać w 95% EtOH przez 1 minutę i przeciwdziałać barwieniu w roztworze Eozyny przez 1 minutę.
    4. Odwodnić (80% etanolu 10-30 s, 100 etanolu przez 1 min i 100% toluolu przez 3 min).
    5. Zamontuj i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełka suszyć przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Roztwory używane do barwienia mogą być niebezpieczne. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki.
  10. Ocena zwłóknienia prawej komory za pomocą Picrosirius Red Staining
    UWAGA: W barwieniu Picrosirius Red, Picrosirius Red, który jest kwasem, wiąże się z collagen12. Dlatego to barwienie może być wykorzystane do badania histologicznego zawartości kolagenu.
    1. Inkubować szkiełka w podgrzanym roztworze Bouina w temperaturze 58 °C przez 1 godzinę.
    2. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć żółty kolor z sekcji przez 10-15 minut.
    3. Bejcować w 0,1% Fast Green przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Płukać w 1% kwasie octowym przez 1 min.
    5. Płukać w wodzie z kranu przez 5 minut.
    6. Zabarwić w 0,1% czerwieni Syriusza przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwodnić w Toluolu.
      UWAGA: Roztwory używane do barwienia mogą być niebezpieczne. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki.
  11. Ocena przerostu kardiomiocytów RV metodą WGA Staining
    UWAGA: Przerost prawej komory (RV) na poziomie komórkowym można ocenić, wykonując barwienie aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA) (Rysunek 4).
    1. Zamocuj szkiełka w zimnym roztworze acetonu na 15 minut, a następnie wykonaj 3 etapy mycia w PBS (5 minut każdy).
    2. Blokuj 10% kozią surowicą w roztworze Dako przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować szkiełka z WGA: Dodać WGA 1:200 i inkubować przez 1 1/2 godziny w temperaturze 37 °C w ciemności.
    4. Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą PBS.
    5. Inkubować szkiełka z barwnikiem kwasu nukleinowego.
    6. Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą PBS.
    7. Do montażu usuń nadmiar płynu i nałóż media montażowe oraz szkiełko nakrywkowe. Suszyć szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Roztwory używane do barwienia mogą być niebezpieczne. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki.
  12. Wykonaj immunochemię płuc, aby dalej i specyficznie ocenić przebudowę naczyń krwionośnych. Na przykład barwienie komórek mięśni gładkich można wykorzystać do oceny muskularizacji naczyń, podczas gdy barwienie czynnikiem von Willebranda można wykorzystać do wizualizacji zmian śródbłonka. Metody te są opisane gdzie indziej5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole szczegółowo opisujemy tworzenie modelu Hypoxia/SU5416 do indukowania pH u myszy. Ponadto szczegółowo opisujemy wszystkie kroki niezbędne do przeprowadzenia oceny naczyń płucnych i serca pod koniec okresu obserwacji.

Przegląd eksperymentalnego projektu dla tego modelu jest pokazany w Rysunek 1A13,14. Myszy poddaje się hipoksji normobarycznej (10%O2) i wstrzykuje s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, jak modelować PH u myszy, łącząc dwa patologiczne bodźce: przewlekłe niedotlenienie i wstrzyknięcie SU5416 (Hipoksja/SU5416)18. Próbując skorelować ten mysi model z ludzkim stanem PH, nieuchronnie należy spojrzeć na obecną klasyfikację PH, pokazaną w Tabeli 1. PH w prawie wszystkich postaciach charakteryzuje się zwężeniem naczyń płucnych i nieprawidłową proliferacją komórek śródbłonka i mięśni gładkich. Prowadzi to do podwyższonego ciśnienia w tętnicach płucn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 i 18IPA34170258) oraz z National Institutes of Health NIH K01 HL135474 do Y.S. O.B było wspierane przez Deutsche Herzstiftung.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy lodowatyRoth3738.1
Aceton, klasa histologicznaThe Lab DepotVT110D
ADVantage System ciśnieniowo-objętościowyTransonicADV500
Roztwór BouinaSigmaHt10132
System kauteryzacjiFine Science Tools18000-00
Rurki połączeniowe i zawory
Aplikatory z bawełnianą końcówkąCovidien8884541300
Szkiełka nakrywkowe, 24 x50 mmRoth1871
Akwizycja i analiza danychEmkaiox2
Czerwień bezpośrednia 80Sigma365548-5G
DMSO (Dimetylosulfotlenek)Sigma Aldrich276855
Suchy lód
Dumont # 5 kleszczeFine Science Tools11251-10
Dumont # 7 Fine ForcepsFine Science Tools11274-20
Formy do zatapianiaSigma AldrichE-6032
Roztwór eozyny Wodnyroztwór SigmaHT110216
Etanol, laboratoryjny GradeCarolina Biological Supply Company861285
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
Cienkie nożyczkiFine Science Tools14090-09
Kozie seruminvitrogen16210-064
Poduszka grzewcza Gaymar T/Pump
Hematoxylin 2Thermo Scientific7231
Komora hipoksyjnaBiospherixA30274P
Komora indukcyjnaDRE Veterinary12570
Cewnik do intubacji (cewnik dożylny SurFlash (20 G x 1") )Terumo SR*FF2025
Nożyczki do irysówFine Science Tools14084-08
IsofluraneBaxterNDC-10019-360-40
Waporyzator izofluranowyDRE Veterinary12432
Myszy (C57BL/6)Charles River
Needles 25 G x 5/8"BD305122
OCT Tissue Tek4583
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning21-031-CV
Kwas pirynowy - roztwór nasycony 1,3SigmaP6744-1GA
Cewnik ciśnieniowyTransonicFTH-1212B-4018
RetraktorKent ScientificSURGI-5001
Statyczny kontroler tlenu ProOx 360BiospherixP360
SU 5416Sigma AldrichS8442
Szew chirurgiczny, pleciony jedwab, 5.0Surgical Specialties Corp. SP116
Taśma chirurgiczna3M1527-1
Strzykawka 10 mlBD303134
Strzykawki z igłą 1 mlBD309626
Sytox Zielona plama kwasowa nukleinowaThermo ScientificS7020
Nożyczki do tenotomiiPricon60-521
ToluolRoth9558.3
Wentylator CWESAR-830/P
WGA Alexa Fluor Thermo ScientificW11261
KsylenRoth
% objętościowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
  2. Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
  3. Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
  4. Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
  5. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  6. Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
  7. Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
  8. Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
  9. Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184(2013).
  10. Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167(2018).
  11. Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
  12. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  13. Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
  14. Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
  15. van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
  16. Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448(2014).
  17. Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
  19. Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
  20. Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
  21. Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
  22. Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
  23. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942(2015).
  24. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335(2016).
  25. Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810(2016).
  26. Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pulmonary HypertensionHypoxia SU5416 ModelRight Ventricle PressureVascular RemodelingCardiomyocyte HypertrophyFulton IndexWheat Germ AgglutininOpen Chest MethodHypoxic ChamberSU5416 Injection

Powiązane artykuły