Opisujemy tutaj wysokoprzepustowe wykrywanie i kwantyfikację fukozylowanych oligosacharydów mleka ludzkiego (HMO) za pomocą biosensora obejmującego całe komórki. Pokazujemy tutaj również adaptację tej platformy do analizy szczepów produkcyjnych HMO, koncentrując się na poprawie stosunku sygnału do szumu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza fukozylowanych trisacharydów mleka ludzkiego w kontekście biotechnologicznym z wykorzystaniem genetycznie kodowanych biosensorów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO) to złożone składniki węglowodanowe mleka matki, które wykazują liczne korzyści dla zdrowia niemowląt. Optymalizacja ich syntezy biotechnologicznej jest jednak ograniczona przez stosunkowo niską przepustowość wykrywania i oznaczania ilościowego monosacharydów i wiązań. Konwencjonalne techniki analizy glikanów obejmują metody chromatograficzne/spektrometryczne mas o przepustowości rzędu setek próbek dziennie bez automatyzacji. Pokazujemy tutaj genetycznie kodowany bioczujnik bakteryjny do wysokoprzepustowego, specyficznego dla sprzężeń wykrywania i kwantyfikacji fukozylowanych struktur HMO, 2'-fukozylolaktozy i 3-fukozylolaktozy, które uzyskaliśmy poprzez heterologiczną ekspresję fukozydaz. Ponieważ obecność laktozy w mleku lub w procesach biotechnologicznych może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, wykazujemy również redukcję sygnału z laktozy przy użyciu różnych strategii. Ze względu na wysoką przepustowość tej techniki, wiele warunków reakcji lub parametrów bioreaktora może być testowanych równolegle w ciągu kilku godzin, co pozwala na optymalizację produkcji HMO.
Wprowadzenie
Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO) to oligosacharydy pochodzące z laktozy, zwykle zawierające od trzech do ośmiu monomerów cukru. Mają koniec redukujący laktozę (Gal-β1,4-Glc) i są dalej wydłużane przez wiązania glikozydowe (β-1,3- lub β-1,6-) do glukozy (Glc), galaktozy (Gal) lub N-acetyloglukozaminy (GlcNAc). Ponadto często dodaje się reszty fukozy (Fuc, α-1,2- lub α-1,3-) lub kwasu sjalowego (Sia lub NeuAc, α-2,3- lub α-2,6-) reszt1.
Obecna analiza oligosacharydów i innych węglowodanów jest ograniczona pod względem przepustowości i zakresu ze względu na potrzebę technologii chromatograficznej/spektrometrycznej (....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Warunki hodowli komórkowej i indukcji
UWAGA: W następujących eksperymentach używane są trzy szczepy: E. coli BL21 (DE3) z pustym wektorem, E. coli BL21 (DE3) z plazmidami pAfcA14 i pET28:zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) oraz E. coli BL21 (DE3) z plazmidami pAfcB14 i pET28:GFP. Wszystkie szczepy są uprawiane w bulionie Luria-Bertani (LB) lub w minimalnej pożywce z odpowiednimi antybiotykami. Przygotować roztwory podstawowe 1000x kanamycyny (50 mg/ml) i karbenicyliny (100 mg/ml) w wodzie dejonizowanej (DI).
- Przygotowanie podłoża
- Przygotuj poży....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zaprojektowaliśmy biosensor całokomórkowy specyficzny dla 2’-FL, który może być stosowany w połączeniu z biotechnologiczną produkcją tego oligosacharydu. Opiera się on na specyficznym enzymatycznym rozszczepieniu modyfikujących cukrów terminalnych, co generuje laktozę i w konsekwencji aktywuje operon lac, prowadząc do ekspresji reporterowego białka fluorescencyjnego pod promotorem indukowanym laktozą, proporcjonalnie do ilości 2’-FL. Aby zademonstrować specyficzność wiązania, prz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy wysokoprzepustową strategię wykrywania fukozylowanych oligosacharydów mleka kobiecego swoistego przez wiązanie. Udało się to osiągnąć poprzez zbudowanie biosensorów całych komórek poprzez genetyczną inżynierię E. coli , które po indukcji specyficznymi glikanami reagują sygnałem fluorescencyjnym. Protokół zawiera również szczegółowe informacje na temat tego, w jaki sposób bioczujnik może być wykorzystywany do wykrywania i ilościowego oznaczania HMO w metabolicznie zmodyfikowanym szczepie bakteryjnym.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Iowa State University Startup Funds. F.E. był częściowo finansowany przez NSF Trinect Fellowship i profesurę Manleya Hoppego. T.J.M. był częściowo wspierany przez Karen and Denny Vaughn Faculty Fellowship. Autorzy dziękują Zakładowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Stanowego Iowa oraz Laboratorium Badawczemu Metabolomiki W.M. Kecka za pomoc w badaniach fluorescencji i LC-MS.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2'-Fukozylolaktoza | Karbosyntez | 41263-94-9 | |
| 3-fukozylolaktoza | Karbosyntez | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Chlorek wapnia, dwuwodny | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Karbenicylina | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dekstroza (D-glukoza), bezwodna | Fisher Scientific | D16-1 | |
| BD | FACSCanto Plus RUO | ||
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC System HPLC | |
| Kolumna | Luna | C18 z odwróconymi fazami | |
| Kanamycyna | Fisher Scientific | ||
| bulion LB, młynarz | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Laktoza | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Sole minimalne, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Siarczan magnezu, Bezwodny | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL | |
| detektor Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
Bibliografia
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
