Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza fukozylowanych trisacharydów mleka ludzkiego w kontekście biotechnologicznym z wykorzystaniem genetycznie kodowanych biosensorów

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59253

⸱

13 kwietnia 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj wysokoprzepustowe wykrywanie i kwantyfikację fukozylowanych oligosacharydów mleka ludzkiego (HMO) za pomocą biosensora obejmującego całe komórki. Pokazujemy tutaj również adaptację tej platformy do analizy szczepów produkcyjnych HMO, koncentrując się na poprawie stosunku sygnału do szumu.

Streszczenie

Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO) to złożone składniki węglowodanowe mleka matki, które wykazują liczne korzyści dla zdrowia niemowląt. Optymalizacja ich syntezy biotechnologicznej jest jednak ograniczona przez stosunkowo niską przepustowość wykrywania i oznaczania ilościowego monosacharydów i wiązań. Konwencjonalne techniki analizy glikanów obejmują metody chromatograficzne/spektrometryczne mas o przepustowości rzędu setek próbek dziennie bez automatyzacji. Pokazujemy tutaj genetycznie kodowany bioczujnik bakteryjny do wysokoprzepustowego, specyficznego dla sprzężeń wykrywania i kwantyfikacji fukozylowanych struktur HMO, 2'-fukozylolaktozy i 3-fukozylolaktozy, które uzyskaliśmy poprzez heterologiczną ekspresję fukozydaz. Ponieważ obecność laktozy w mleku lub w procesach biotechnologicznych może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, wykazujemy również redukcję sygnału z laktozy przy użyciu różnych strategii. Ze względu na wysoką przepustowość tej techniki, wiele warunków reakcji lub parametrów bioreaktora może być testowanych równolegle w ciągu kilku godzin, co pozwala na optymalizację produkcji HMO.

Wprowadzenie

Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO) to oligosacharydy pochodzące z laktozy, zwykle zawierające od trzech do ośmiu monomerów cukru. Mają koniec redukujący laktozę (Gal-β1,4-Glc) i są dalej wydłużane przez wiązania glikozydowe (β-1,3- lub β-1,6-) do glukozy (Glc), galaktozy (Gal) lub N-acetyloglukozaminy (GlcNAc). Ponadto często dodaje się reszty fukozy (Fuc, α-1,2- lub α-1,3-) lub kwasu sjalowego (Sia lub NeuAc, α-2,3- lub α-2,6-) reszt1.

Obecna analiza oligosacharydów i innych węglowodanów jest ograniczona pod względem przepustowości i zakresu ze względu na potrzebę technologii chromatograficznej/spektrometrycznej (MS)2,3,4,5,6,7, co może zająć około godziny na próbkę, nie wspominając o konieczności stosowania drogiego sprzętu, specjalistycznych kolumn i środków do derywatyzacji oraz wiedzy specjalistycznej na temat działania tego sprzętu8. Wiązania oligosacharydowe są szczególnie trudne do określenia, wymagają zaawansowanego MS9,10 lub technik magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)11. Szybka optymalizacja syntezy tych oligosacharydów jest więc ograniczona przez przepustowość tego powolnego kroku analitycznego.

W tym badaniu demonstrujemy specyficzne dla sprzężeń wykrywanie fukozylowanych trisacharydów HMO na bazie laktozy, koncentrując się na 2'-fukozylolaktozie (2'-FL), która jest najobficiej występującym HMO w mleku kobiecym, używając genetycznie kodowanego biosensora całych komórek Escherichia coli z granicą wykrywalności na poziomie 4 mg/L. Ważną cechą tego biosensora jest jego zdolność do rozróżniania izomerycznych trisacharydów. Zasada projektowania opiera się na ekspresji specyficznych fukozydaz w E. coli, które uwalniają laktozę z HMO, której obecność jest wykrywana przez operon lac, który z kolei generuje sygnał fluorescencyjny. Osiągamy to, budując system dwuplazmidowy, z których jeden zawiera specyficzną dla wiązania fukozydazę, a drugi fluorescencyjne białko reporterowe. Ta platforma biosensoryczna nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych za pomocą cytometrii przepływowej lub czytnika mikropłytek. Demonstrujemy również wykorzystanie biosensora do ilościowego oznaczania 2'-FL wytwarzanego przez zmodyfikowany szczep12. W ramach tego badania przedstawiamy również trzy strategie selektywnego usuwania laktozy, które mogą skutkować fałszywie dodatnim sygnałem z bioczujnika, biorąc pod uwagę, że zmodyfikowany szczep producenta jest hodowany na laktozie.

Razem wzięte, genetycznie kodowane biosensory pozwalają nam wykrywać i określać ilościowo HMO w sposób specyficzny dla połączenia, co jest trudne nawet przy użyciu technik chromatograficznych, MS czy NMR. Ze względu na wysoką przepustowość i łatwość użycia, metoda ta powinna mieć szerokie zastosowanie w inżynierii metabolicznej i syntezie HMO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Warunki hodowli komórkowej i indukcji

UWAGA: W następujących eksperymentach używane są trzy szczepy: E. coli BL21 (DE3) z pustym wektorem, E. coli BL21 (DE3) z plazmidami pAfcA14 i pET28:zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) oraz E. coli BL21 (DE3) z plazmidami pAfcB14 i pET28:GFP. Wszystkie szczepy są uprawiane w bulionie Luria-Bertani (LB) lub w minimalnej pożywce z odpowiednimi antybiotykami. Przygotować roztwory podstawowe 1000x kanamycyny (50 mg/ml) i karbenicyliny (100 mg/ml) w wodzie dejonizowanej (DI).

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotuj pożywkę LB, dodając 25 g bulionu w proszku LB do 1 l wody DI. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Poczekaj, aż temperatura wysterylizowanej pożywki LB spadnie poniżej 60 °C przed dodaniem 1 μl antybiotyku na każdy 1 ml pożywki LB.
    2. Aby przygotować płytki LB, dodaj 15 g agaru do podłoża LB przed sterylizacją. Poczekaj, aż temperatura wysterylizowanego agaru LB spadnie poniżej 60 °C przed dodaniem antybiotyku.
    3. 1.1.3 Dla komórek biosensorycznych należy przygotować pożywki lub płytki z podwójnymi antybiotykami, kanamycyną i karbenicyliną.
  2. Induktory węglowodanów
    1. Przygotować roztwory podstawowe induktorów węglowodanów o równoważniku molowym 20 g/l laktozy: 29 g/l laktozy 2'-FL i 3-FL.
      UWAGA: Każde 200 μL komórek będzie wymagało 20 μL 2'-FL lub 3-FL.
    2. Indukować 200 μl komórek z końcowym stężeniem laktozy 2,0 g/l lub końcowym stężeniem 2'-FL/3-FL 2,9 g/l. Inkubować w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem i pozostawić kultury do wzrostu przez noc.
  3. Hodowla komórkowa
    1. Dzień przed eksperymentem wysiewać 5 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i karbenicyliną ze świeżej kolonii bakteryjnej, stosując sterylną technikę.
    2. Inkubować wszystkie kultury w temperaturze 37 °C z mieszaniem i hodować kultury przez noc.
    3. Przenieś 50 μl hodowli przez noc do 5 ml świeżej pożywki LB/M9 z kanamycyną i karbenicyliną. Inkubować w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem i rosnąć, aż kultura osiągnie gęstość optyczną 0,5–0,7 przy długości fali 600 nm (OD600). W tej środkowej fazie logarytmicznej komórki mogą być indukowane.

2. Pomiar fluorescencji i granice wykrywalności

  1. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej
    1. Przenieś nocne kultury do probówek o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 12 500 x g przez 1 minutę.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl w wodzie DI, pH 7,2) w celu przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki i przeniesienia zawiesiny jednokomórkowej do probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml.
    3. Utrzymywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu przepuszczenia próbek na cytometrze przepływowym. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeanalizuj komórki tak szybko, jak to możliwe.
    4. Wybierz laser 488 nm, aby wzbudzić GFP. Zbierz poziomy fluorescencji izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (20 000–40 000 zdarzeń, bramkowane do przodu i z boku, aby uniknąć zagregowanych komórek i zanieczyszczeń) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 525/50 nm.
  2. Kalibracja biosensora
    1. Aby wykonać krzywą kalibracyjną, należy wykonać 8–10 rozcieńczeń wzorca 2'-FL w zakresie 0–2,500 mg/l.
    2. Hodować komórki biosensoryczne 2'-FL (zawierające pAfcA i pET28:GFP) i indukować je wzorcowymi rozcieńczeniami, jak opisano wcześniej w sekcji 1.3. Przeprowadzić trzy kontrpróby biologiczne dla każdego rozcieńczenia.

3. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe 2'-FL w szczepie producenckim

  1. Uprawa szczepu producenta
    1. Aby uzyskać minimalną ilość pożywki, należy przygotować oddzielne roztwory 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, cytrynianu sodu i 1 M tiamino-HCl. Wysterylizuj roztwory za pomocą filtra 0,22 μm. Wymieszaj bulion M9 w proszku z 1 litrem wody DI. Roztwór M9 należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min. Schłodzić roztwór do temperatury 50 °C. DodaćMgSO4, CaCl2,K2HPO4, FeSO4·7H2O, cytrynian sodu i tiaminę do końcowych stężeń odpowiednio 2 mM, 0,1 mM, 12 g/l, 11 mg/L, 75 mg/L i 7,5 μg/L.
    2. Rozpocznij hodowlę szczepu wytwarzającego 2'-FL, np. JM109 gwBC-F2, w 5 ml pożywki LB i pozwól mu rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C, jak opisano w Baumgartner et al.12.
    3. Subkultura w dawce 1%, jak opisano wcześniej w kroku 1.3.3, w 250 ml minimalnej pożywki przygotowanej w kroku 3.1.1. Dodać glicerol do końcowego stężenia 10 g/l i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C.
    4. Gdy hodowla osiągnie OD600 0,5–0,7, dodać izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,5 mM i laktozę do końcowego stężenia 2 g/l.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem i pozostawić kultury do wzrostu przez 24 godziny.
  2. Ekstrakcja 2'-FL
    1. Przenieść nocne kultury do sterylnych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 900 x g przez 15 minut.
    2. 3.2.2 Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w wodzie demineralizowanej. Powtórz etap prania trzy razy, aby usunąć resztki laktozy, a na koniec ponownie zawiesić w 5 ml wody demineralizowanej.
    3. Aby zlizować zawiesinę komórki, użyj sonikatora o mocy 30%, w impulsach 30 s. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas.
    4. Odwirować zlizane komórki przez 25 minut przy 2 000 x g. Usunąć sklarowany osad, przepuścić go przez sterylny (np. 0,22 μm) filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
  3. Oznaczanie ilościowe za pomocą biosensora
    1. Zaszczepić kulturę komórek biosensorycznych 2'-FL i w połowie fazy logarytmicznej indukować lizatem komórkowym równoważnym szacowanym stężeniom 2'-FL użytym do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej, jak opisano w sekcji 2.2. Kalibrację należy przeprowadzić w tym samym środowisku, w którym znajduje się próbka, która ma być analizowana (np. lizat komórkowy), dodając rozcieńczenia 2'-FL w celu kontrolowania (tj. niebędącego producentem) przefiltrowanego lizatu komórkowego przed indukcją komórek biosensora.
    2. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym. Wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź, wykreślając wynik fluorescencji w stosunku do stężenia oligosacharydów. Porównaj reakcję wzorców na lizat komórkowy.

4. Selektywne usuwanie laktozy

UWAGA: Komórki biosensoryczne są wrażliwe na laktozę i pożądane jest, aby biosensor selektywnie wykrywał HMO nad laktozą. Jedna ze strategii obejmowałaby mycie komórek, jak opisano w sekcji 3.2. Poniżej opisano trzy inne strategie.

  1. Leczenie oczyszczoną β-galaktozydazą dostępną w handlu
    1. Rozpuścić liofilizowaną β-galaktozydazę do 1,000 jednostek (laktaza FCC) / ml w 1 mM MgCl2 lub użyć dostępnej w handlu β-galaktozydazy w roztworze.
    2. Aby określić optymalne stężenie potrzebnego enzymu, należy wyhodować inokulum komórek biosensorycznych 2'-FL i indukować 2 g/L laktozy i 2,9 g/L 2'-FL w środkowej fazie logarytmicznej.
    3. Do 100 μl kultur dodać zmienne ilości β-galaktozydazy, do 12 jednostek, i pozostawić kultury do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C z ciągłym wstrząsaniem.
    4. Zmierzyć fluorescencję zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i obliczyć optymalne jednostki enzymu potrzebne do określenia minimalnego stężenia enzymu do osiągnięcia pożądanego tłumienia sygnału.
    5. Do komórek wytwarzających 2'-FL hodowanych przez 24 godziny, dodać optymalne jednostki β-galaktozydazy i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Postępować zgodnie z protokołem oznaczania miana 2'-FL, jak opisano w sekcji 3.3.
  2. Obróbka wstępna szczepem LacZ+
    1. Rozpocząć hodowlę 25 ml szczepu wytwarzającego 2'-FL, a po indukcji w połowie fazy logarytmicznej inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    2. Zaszczepić kulturę E. coli BL21 (DE3) w LB, wyhodować ją do połowy fazy logarytmicznej w temperaturze 37 °C i dodać 50 ml kultury (2:1) do 24-godzinnej hodowli.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Postępować zgodnie z protokołem oznaczania miana 2'-FL, jak opisano w ppkt 3.3.
  3. Wytrącanie laktozy etanolem
    UWAGA: Ta sekcja została zaadaptowana z Matsuki et al.12.
    1. Rozpocząć hodowlę szczepu wytwarzającego 2'-FL w ilości 25 ml i po indukcji w połowie fazy logarytmicznej inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    2. Dodać dwie objętości 100% etanolu do kultury, dobrze wstrząsnąć i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    3. Odwirować zawiesinę o sile 900 x g przez 15 minut. Zebrać supernatant i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, co powoduje wytrącenie laktozy.
    4. Usunąć wytrąconą laktozę, przepuszczając roztwór przez bibułę filtracyjną (11 μm). Zebrać przesiąk, który jest lizatem komórkowym zawierającym 2'-FL, który można określić ilościowo, postępując zgodnie z sekcją 3.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaprojektowaliśmy biosensor całokomórkowy specyficzny dla 2’-FL, który może być stosowany w połączeniu z biotechnologiczną produkcją tego oligosacharydu. Opiera się on na specyficznym enzymatycznym rozszczepieniu modyfikujących cukrów terminalnych, co generuje laktozę i w konsekwencji aktywuje operon lac, prowadząc do ekspresji reporterowego białka fluorescencyjnego pod promotorem indukowanym laktozą, proporcjonalnie do ilości 2’-FL. Aby zademonstrować specyficzność wiązania, prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy wysokoprzepustową strategię wykrywania fukozylowanych oligosacharydów mleka kobiecego swoistego przez wiązanie. Udało się to osiągnąć poprzez zbudowanie biosensorów całych komórek poprzez genetyczną inżynierię E. coli , które po indukcji specyficznymi glikanami reagują sygnałem fluorescencyjnym. Protokół zawiera również szczegółowe informacje na temat tego, w jaki sposób bioczujnik może być wykorzystywany do wykrywania i ilościowego oznaczania HMO w metabolicznie zmodyfikowanym szczepie bakteryjnym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Iowa State University Startup Funds. F.E. był częściowo finansowany przez NSF Trinect Fellowship i profesurę Manleya Hoppego. T.J.M. był częściowo wspierany przez Karen and Denny Vaughn Faculty Fellowship. Autorzy dziękują Zakładowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Stanowego Iowa oraz Laboratorium Badawczemu Metabolomiki W.M. Kecka za pomoc w badaniach fluorescencji i LC-MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2'-Fukozylolaktoza Karbosyntez 41263-94-9
3-fukozylolaktoza Karbosyntez 41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500
Chlorek wapnia, dwuwodnyFisher ScientificC79-500
Karbenicylina Fisher ScientificBP26481
Dekstroza (D-glukoza), bezwodnaFisher ScientificD16-1
BDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100 Series HPLC System HPLC
KolumnaLunaC18 z odwróconymi fazami
KanamycynaFisher Scientific
bulion LB, młynarz Fisher Scientific12-795-027
LaktozaFisher Scientific64044-51-5
M9, Sole minimalne, 5xSigma-AldrichM6030
Siarczan magnezu, BezwodnyFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesMass Selective Trap SL
detektor Chlorek soduSigma-Aldrich7647-14-5
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-Aldrich7558-79-4
Fosforan sodu jednozasadowySigma-Aldrich13472-35-0
Cytometr przepływowy 11815024

Bibliografia

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939(2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Fukozylowane HMOdetekcja za pomocą biosensoracytometria przepływowaprzesiew wysokoprzepustowyinterferencja laktozybeta-galaktosydazainżynieria genetycznaekspresja w E. coliilościowe oznaczanie oligosacharydówspecyficzność wiązań
Analiza fukozylowanych trisacharydów mleka ludzkiego w kontekście biotechnologicznym z wykorzystaniem genetycznie kodowanych biosensorów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.