Artykuł metodologiczny

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

DOI:

10.3791/59259

⸱

27 marca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wrodzony coloboma oka to zaburzenie genetyczne, które zazwyczaj obserwuje się jako rozszczep w dolnej części oka, wynikający z niepełnego zamknięcia szczeliny naczyniówkowej. Ostatnio identyfikacja osób z coloboma w górnym aspekcie tęczówki, siatkówki i soczewki doprowadziła do odkrycia nowej struktury, określanej jako górna szczelina lub górna bruzda oczna (SOS), która jest przejściowo obecna na grzbietowej stronie muszli wzrokowej podczas rozwoju oka kręgowców. Chociaż ta struktura jest zachowana u myszy, piskląt, ryb i traszki, nasza obecna wiedza na temat SOS jest ograniczona. Aby wyjaśnić czynniki, które przyczyniają się do jego powstawania i zamykania, niezbędna jest umiejętność jego obserwacji i identyfikacji nieprawidłowości, takich jak opóźnienie w zamknięciu SOS. W tym miejscu postanowiliśmy stworzyć ustandaryzowaną serię protokołów, które można wykorzystać do efektywnej wizualizacji SOS poprzez połączenie powszechnie dostępnych technik mikroskopowych z powszechnymi technikami biologii molekularnej, takimi jak barwienie immunofluorescencyjne i nadekspresja mRNA. Chociaż ten zestaw protokołów koncentruje się na możliwości obserwacji opóźnienia zamknięcia SOS, można go dostosować do potrzeb eksperymentatora i można go łatwo modyfikować. Ogólnie rzecz biorąc, mamy nadzieję, że uda nam się stworzyć przystępną metodę, dzięki której nasze zrozumienie SOS może zostać pogłębione w celu poszerzenia obecnej wiedzy na temat rozwoju oka kręgowców.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formowanie oka kręgowców to wysoce konserwatywny proces, w którym starannie zaaranżowane międzykomórkowe szlaki sygnałowe ustalają typy tkanek i określają tożsamość regionalną1. Zaburzenia wczesnej morfogenezy oka skutkują głębokimi defektami w architekturze oka i często są oślepiające2. Jedna z takich chorób wynika z niemożności zamknięcia szczeliny naczyniówkowej oka po brzusznej stronie miseczki nerwu wzrokowego3. Szacuje się, że to zaburzenie, znane jako coloboma oczne, występuje u 1 na 4-5000 żywych urodzeń i powoduje 3-11% ślepoty u dzieci, zwykle objawiając się jako struktura przypominająca dziurkę od klucza, która wystaje niżej ze źrenicy w środku oka4,5,6. Funkcją szczeliny naczyniówki jest zapewnienie punktu wejścia dla wczesnego układu naczynieniowego wrażliwego w miseczkę wzrokową, po czym boki szczeliny zrośnią się, aby zamknąć naczynia 7.

Chociaż coloboma oczna jest znana od czasów starożytnych, niedawno zidentyfikowaliśmy nową podgrupę pacjentów z coloboma z utratą tkanki wpływającą na górny/grzbietowy aspekt oka. Ostatnie prace w naszym laboratorium doprowadziły do odkrycia struktury oka w oku grzbietowym danio pręgowanego, którą nazywamy górną bruzdą oczną (SOS) lub górną szczeliną8. Ważne jest, aby pamiętać, że struktura ma cechy zarówno bruzdy, jak i szczeliny. Podobnie jak bruzda, jest to ciągła warstwa tkanki, która rozciąga się od nosa do skroniowej siatkówki. Ponadto zamknięcie struktury nie jest pośredniczone przez fuzję dwóch przeciwległych błon podstawnych i wydaje się, że wymaga procesu morfogenetycznego, w którym struktura jest zasiedlona przez komórki. Jednak, podobnie jak szczelina, tworzy strukturę, która oddziela nosową i skroniową stronę oka grzbietowego z błoną podstawną. Dla spójności w tym tekście będziemy odnosić się do niego jako SOS.

SOS jest ewolucyjnie zachowany u kręgowców, będąc widocznym podczas morfogenezy oka u ryb, piskląt, traszek i myszy8. W przeciwieństwie do szczeliny naczyniówki, która jest obecna od 20 do 60 godzin po zapłodnieniu (hpf) u danio pręgowanego, SOS jest wysoce przejściowy, jest łatwo widoczny od 20-23 hpf i nieobecny przez 26 hpf8. Ostatnie badania w naszym laboratorium wykazały, że podobnie jak szczelina naczyniówki, SOS odgrywa rolę w prowadzeniu naczyń krwionośnych podczas morfogenezy oka8. Chociaż czynniki kontrolujące powstawanie i zamykanie SOS nie są jeszcze w pełni poznane, nasze dane podkreśliły rolę genów wzorcujących wzorzec oka grzbietowo-brzusznego8.

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem modelowym do badania SOS. Jako system modelowy zapewnia szereg korzyści w badaniu rozwoju oka: jest modelem kręgowców; każde pokolenie wykazuje wysoką płodność (~200 zarodków); jego genom został w pełni zsekwencjonowany, co ułatwia manipulacje genetyczne; Około 70% ludzkich genów ma co najmniej jeden ortolog danio pręgowanego, co czyni go idealnym, opartym na genetyce modelem choroby człowieka9,10. Co najważniejsze, jego rozwój odbywa się na zewnątrz matki, a jego larwy są przezroczyste, co pozwala na wizualizację rozwijającego się oka ze względną łatwością11.

W tym zestawie protokołów opisujemy techniki, za pomocą których SOS może być wizualizowany u larw danio pręgowanego. Różnorodność technik wizualizacji zastosowanych w tym raporcie pozwoli na wyraźną obserwację SOS podczas normalnego rozwoju oka, a także możliwość wykrycia wad zamknięcia SOS. Nasze przykładowe protokoły będą zawierały badania Gdf6, BMP zlokalizowanego w oku grzbietowym i znanego regulatora zamknięcia SOS. Co więcej, techniki te można łączyć z eksperymentalnymi manipulacjami w celu identyfikacji czynników genetycznych lub czynników farmakologicznych, które wpływają na prawidłowe tworzenie i zamykanie SOS. Ponadto dołączyliśmy protokół, dzięki któremu możliwe jest obrazowanie fluorescencyjne wszystkich błon komórkowych, co pozwala eksperymentatorowi zaobserwować zmiany morfologiczne w komórkach otaczających SOS. Naszym celem jest ustanowienie zestawu ustandaryzowanych protokołów, które mogą być wykorzystywane w całej społeczności naukowej, aby zaoferować nowy wgląd w tę nową strukturę rozwijającego się oka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alberty.

1. Protokół 1: Wizualizacja SOS za pomocą stereomikroskopii i obrazowania z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC)

  1. Pobieranie zarodków
    1. W zbiorniku z odchlorowaną wodą przygotuj wieczorem krzyżówki danio pręgowanego gdf6a+/-, łącząc samca danio pręgowanego z samicą danio pręgowanego. Pamiętaj, aby oddzielić mężczyznę od samicy za pomocą przegrody, aby upewnić się, że zarodki urodziły się w krótkim czasie.
    2. Następnego ranka pociągnij za przegrodę i pozwól danio pręgowanemu rozmnażać się nie dłużej niż 30 minut. Zbierz zarodki na szalkach Petriego z pożywką E3, opisaną w The Zebrafish Book12, i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
    3. Usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub martwe zarodki, które będą białe i nieprzezroczyste.
  2. Przygotowanie i obrazowanie w czasie rzeczywistym zarodków danio pręgowanego
    1. Przy 20 hpf zastąp pożywkę E3 pożywką E3 zawierającą 0,004% 1-fenylo 2-tiomocznika (PTU), aby zapobiec produkcji pigmentu.
      UWAGA: Dodanie PTU w nieco późniejszym punkcie czasowym, takim jak 22-24 hpf, jest mało prawdopodobne, aby zakłóciło eksperyment ze względu na wczesny wiek zarodków w momencie obrazowania. Zaleca się jednak wczesne leczenie zarodków, aby całkowicie zapobiec pigmentacji, ponieważ w oku grzbietowym pojawia się pasmo pigmentacji, które może zakłócać obrazowanie SOS.
    2. Upewnij się, że wszystkie zarodki znajdują się we właściwych stadiach rozwoju w różnych momentach prowadzących do czasu obserwacji. Zaleca się, aby robić to na etapach, na których liczba somitów jest wyraźnie widoczna, jak opisano w Kimmel et al.13. Usuń te, które są niedojrzałe rozwojowo.
    3. Umieść zarodki pod mikroskopem preparacyjnym i usuń zarodki, delikatnie rozsuwając kosmówkę za pomocą cienkich kleszczy. Wizualizuj SOS w oku grzbietowym. SOS może pojawić się jako wgłębienie na grzbietowym brzegu oka, a linia powinna być widoczna w poprzek oka grzbietowego. Aby uzyskać normalne zamknięcie SOS, obserwuj zarodki w temperaturze około 20-23 hpf. W celu zbadania fenotypów opóźnionego zamknięcia SOS obserwuj zarodki w temperaturze 28 hpf lub późniejszej.
    4. Oddziel zarodki, które wykazują opóźnienie zamknięcia SOS od tych, które go nie wykazują.
    5. Aby sfotografować te zarodki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, przygotuj szalkę Petriego zawierającą 1% agarozy w E3. Lekko nakłuj środek agarozy, aby utworzyć płytki otwór, w którym żółtko zarodka może siedzieć, gdy zarodek zostanie umieszczony na agarozie. Zapewni to, że zarodek nie będzie znajdował się pod kątem podczas fotografowania.
    6. Znieczulić zarodki 0,003% trikainą w E3 i umieścić bocznie na agarozie.
    7. Aby zobrazować zarodki za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego, przenieś zarodek na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą mały bolus nieżelowej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w E3 (w/v). Szybko ustaw zarodek na boki za pomocą cienkiej żyłki lub rzęsy i poczekaj, aż agaroza ostygnie. Gdy agaroza będzie twarda, wlej do naczynia tyle E3, aby przykryła agarozę. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Distel i Köster14.
      UWAGA: W przypadku korzystania z odwróconego mikroskopu, zarodek można umieścić na szkle naczynia ze szklanym dnem szkiełka nakrywkowego i zobrazować za pomocą standardowej soczewki obiektywowej 20X.
    8. Użyj soczewki obiektywowej 20x zanurzonej w wodzie, aby zobrazować SOS za pomocą mikroskopu złożonego. Po wizualizacji delikatnie wyciągnij agarozę z zarodków i utrwal w 4% paraformaldehydzie (PFA) lub pozwól im kontynuować rozwój.

2. Protokół 2: Barwienie immunofluorescencyjne lamininy w całości

  1. Barwienie immunofluorescencyjne lamininy w całości: Dzień 1
    1. Dekorionate zarodki zgodnie z opisem w kroku 1.2.3, jeśli nie zostało to jeszcze wykonane. Utrwalić zarodki w probówce do mikrowirówki w żądanym punkcie czasowym w świeżo przygotowanym 4% PFA przez 2 godziny na wytrząsarce o temperaturze pokojowej (22-25 °C). Prać w 1x PBST przez 5 minut, cztery razy.
      UWAGA: Po gastrulacji zarodki mogą lepiej się utrwalać po dechorionacji.
    2. Przepuszczalność zarodków w 10 μg/ml proteinazy K w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Czas inkubacji będzie zależał od etapu rozwoju, na którym zarodki są utrwalone (patrz Thisse i Thisse15).
    3. Prać w 1x PBST przez 5 minut, cztery razy.
    4. Zablokować zarodki w roztworze 5% surowicy koziej i 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1xPBST przez 1-2 godziny na wytrząsarce o temperaturze pokojowej.
    5. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając królicze przeciwciało anty-lamininowe w roztworze blokowym w rozcieńczeniu 1:200.
    6. Inkubować zarodki w pierwszorzędowym przeciwciałie anty-lamininy przez noc na wytrząsarce o temperaturze 4 °C.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne lamininy w całości: Dzień 2
    1. Prać w 1x PBST przez 15 min, pięć razy.
    2. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488 w 1x PBST do rozcieńczenia 1:1000,
      UWAGA: Możliwe jest dostosowanie tego kroku do zasobów dostępnych dla eksperymentatora poprzez użycie innego przeciwciała drugorzędowego.
    3. Inkubować zarodki w przeciwciałach drugorzędowych przez noc na wytrząsarce o temperaturze 4 °C. Począwszy od tego kroku, osłaniaj się przed światłem tak bardzo, jak to możliwe.
    4. Prać w 1x PBST przez 15 minut, cztery razy. W razie potrzeby zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
  3. Wypreparowanie i montaż oczu embrionalnych
    1. W razie potrzeby umieść zarodki na małej szalce Petriego i ogol je w 1x PBST. Zrób to, delikatnie rozbijając żółtko drobnymi kleszkami i usuwając komórki żółtka poprzez łagodne zeskrobanie woreczka żółtkowego.
    2. Przygotować następujące stężenia roztworów z serii PBS-glicerol w probówkach do mikrowirówek: 30%, 50% i 70% glicerolu w PBS. Przenieś zarodki do 30% glicerolu/PBS, upewniając się, że umieściłeś zarodki na wierzchu roztworu i przenosząc jak najmniej poprzedniego roztworu. Poczekaj, aż zarodki opadną na dno probówki.
    3. Gdy zarodki opadną na dno, przenieś je do 50% glicerolu/PBS. Powtórz i przenieś do 70% glicerolu/PBS.
    4. Gdy zarodki zanurzą się w 70% glicerolu/PBS, przenieś je do małego plastikowego naczynia do sekcji.
    5. Odetnij zarodek z tyłu tyłomózgowia i w razie potrzeby użyj tylnej tkanki do genotypowania.
    6. Przenieś głowę na szklane szkiełko, przenosząc jak najmniej glicerolu. Użyj kleszczy lub innych drobnych narzędzi do preparowania, aby przytrzymać tylny koniec, aby utrzymać głowę nieruchomo. Użyj cienkiej szpilki do drobnego smarowania lub innych drobnych narzędzi do preparowania, aby delikatnie włożyć do komory przodomózgowia od przodu i popchnąć w dół, aby oddzielić od siebie prawą i lewą połowę głowy. Powtórz to, przesuwając się do tyłu przez śródmózgowie i do komory tylnego mózgu, zasadniczo piłując głowę w dół linii środkowej. Minimalizuje to ręczną manipulację oka i otaczających tkanek, pozostawiając w ten sposób SOS nieuszkodzony
      7. .
    7. Zamontuj każdą stronę głowy linią środkową w dół, okiem do góry. Umieścić cztery wkładki smaru próżniowego w rogach (w odpowiedniej odległości od siebie dla używanego szkiełka nakrywkowego) i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym, dociskając kolejno każdy wkład, aż szkiełko nakrywkowe zetknie się z próbkami. Odpipetować 70% glicerolu na krawędzi szkiełka nakrywkowego, tak aby glicerol został wciągnięty pod spód, wypełniając przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
    8. Próbki należy pobrać w ciągu jednego dnia lub uszczelnić wokół szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i próbkami obrazu dopiero po wyschnięciu lakieru do paznokci. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.

3. Protokół 3: Wizualizacja SOS za pomocą mRNA eGFP-CAAX

  1. Synteza mRNA eGFP-CAAX
    1. Linearyzować 1 μg plazmidu pCS2-eGFP-CAAX 16 z NotI w objętości reakcji 40 μL przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Aby zatrzymać reakcję trawienia restrykcyjnego, dodaj 10 μl wody wolnej od RNaz, 2,5 μl 10% SDS i 2,0 μl 10 mg/ml proteinazy K.
    3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
    4. Dodać do reakcji (całkowita objętość 200 μl) i przejść do następnego etapu: 50 μl wody wolnej od RNaz, 20 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 75,5 μl wody wolnej od RNazy
      UWAGA: Woda wolna od RNaz jest dodawana przy dwóch oddzielnych okazjach, aby zapobiec nadmiernemu rozcieńczeniu octanu sodu.
  2. Oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu
    1. Dodać 200 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego i wirować przez 20 s. Oddzielić fazę wodną i organiczną przez odwirowanie przy 18 000 x g przez 5 min.
    2. Przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby uniknąć przeniesienia dolnej warstwy organicznej. Dodać równą objętość chloroformu do nowej probówki.
      UWAGA: Dodanie chloroformu jest opcjonalne, ale zaleca się zapewnienie całkowitego usunięcia fenolu z próbki.
    3. Wirować przez 20 s. Oddzielić fazę wodną i organiczną poprzez odwirowanie przy 18 000 x g przez 5 minut.
    4. Tak jak poprzednio, przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby uniknąć przeniesienia dolnej warstwy organicznej.
    5. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2.
    6. Wytrącić DNA, dodając 3 objętości etanolu w 100% wolnego od RNaz i schłodzić w temperaturze -20 °C przez 15 minut. Wirować przy 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Granulka powinna być widoczna. Zdekantować supernatant.
    7. Umyj granulat 100 μl zimnej wody bez etanolu 70% i RNaz. Po delikatnym wymieszaniu w celu rozbicia osadu, odwirować przy 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Granulka powinna być widoczna. Zdekantować supernatant.
    8. Suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut i ponownie zawiesić DNA w 7 μl wody.
      UWAGA: Pelet może wymagać suszenia przez okres dłuższy niż 5 minut, w zależności od dostępnego przepływu powietrza.
  3. Transkrypcja i oczyszczanie mRNA eGFP-CAAX
    1. W sposób wolny od RNaz przygotować reakcję transkrypcji in vitro z dostępnym w handlu zestawem polimerazy RNA Sp6, używając około 1 μg oczyszczonego linearyzowanego plazmidowego DNA uzyskanego w kroku 3.2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Polimeraza RNA Sp6 musi być używana do produkcji mRNA z czapeczką.
    2. Dodać 1 μl DNazy (2 U/μL; Nie zawiera RNaz) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Oczyść mRNA za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania RNA. Podwielokrotnić mRNA, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Iniekcja i wizualizacja
    1. Pozyskać zarodki zgodnie z Protokołem 1.1.
    2. Za pomocą aparatu do mikroiniekcji wstrzyknij 300 pg mRNA eGFP-CAAX na etapie 1 komórki.
    3. Badania przesiewowe w kierunku zarodków z jasną ekspresją eGFP w oczach przy użyciu stereoskopu fluorescencyjnego.
    4. Zobrazuj zarodki zgodnie z opisem w Protokole 1.2.
    5. Alternatywnie, dekorionacja i utrwalenie zarodków w pożądanym punkcie czasowym w 4% PFA przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C. Myj zarodki w 1x PBST przez 5 minut, cztery razy i dechorionat, jeśli nie zostało to wcześniej zrobione. Przeciąć oczy i zamontować je na szkiełkach, jak opisano w Protokole 2.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SOS danio pręgowanego pojawia się na 20 hpf w przypuszczalnej siatkówce grzbietowej8. Przy 23 hpf SOS przechodzi od początkowej wąskiej architektury do szerokiego wcięcia, a po 26 hpf nie jest już widoczny8. Dlatego, aby zbadać SOS podczas normalnego rozwoju oka danio pręgowanego, zarodki muszą być obserwowane w zakresie 20-23 hpf. W tym okresie SOS można zaobserwować za pomocą mikroskopu preparacyjnego i obrazowania DIC jako cienką linię w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy ustandaryzowaną serię protokołów obserwacji SOS w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Aby określić fenotypy opóźnienia zamknięcia, nasze protokoły skupiły się na zdolności do rozróżnienia separacji dwóch dyskretnych płatów grzbietowo-nosowej i grzbietowo-skroniowej strony oka, podobnie jak w technikach stosowanych do wizualizacji fenotypów opóźnienia zamknięcia szczeliny naczyniówki w oku brzusznym.

Te techniki wizualizacji mogą być używane w połączeniu z ró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC), Alberta Innovates Technology Futures oraz Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fenylo 2-tiomocznikSigma AldrichP7629-10G
100 mm szalka PetriegoFisher ScientificFB0875713
35 mm szalka PetriegoCorningCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA7906-100G
Mikroskop DIC/fluorescencyjnyZeissAxioImager Z1
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZX12
Kamera do mikroskopu preparacyjnegoQimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning Smar wysokopróżniowyFisher Scientific14-635-5D
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)Sigma AldrichA5040-25G
Kozia anty-królik Alexa Fluor 488Abcamab150077
Kozia surowicaSigma AldrichG9023
Oprogramowanie do przechwytywania obrazuInkubator ZeissZEN
VWRModel 1545
Szkiełko nasadkowe mikroskopu (22 mm x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
Szkiełko mikroskopoweFisher Scientific12-544-2
Pinek MinutienFine Science Tools26002-10
mMessage Zestaw do transkrypcji mMachine Sp6InvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldehyd ( PFA)Sigma AldrichP6148-500G
Fenol: Chloroform: alkohol izoamylowy pH 6,7 +/- 0,2Fisher ScientificBP1752-100
Proteinaza KSigma AldrichP4850
Przeciwciało anty-lamininowe królikaMillipore SigmaL9393
TURBO Dnaza (2 U/µ L)InvitrogenAM2238
Ultraczysta agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520-100
Ultraczysty dodecylosiarczan sodu (SDS)Invitrogen15525017

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525(2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Embriogeneza Danio przebranybarwienie immunofluorescencyjnenadekspresja mRNAkontrast fazowy z r nicowaniem DICmikroskopia konfokalnamikroskopia stereoskopowabarwienie lamininyekspresja GFP CAXop nienie zamkni cia SOS

Powiązane artykuły