System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Podsumowanie

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

Streszczenie

Interpretacja względnego wpływu autonomicznego wzorca komórkowego w porównaniu z zewnętrznym wpływem mikrośrodowiska na określenie linii komórkowej stanowi ogólne wyzwanie w badaniach biologii rozwojowej. W sercu embrionalnym może to być szczególnie trudne, ponieważ wiadomo, że regionalne różnice w ekspresji regulatorów transkrypcji, sygnały sygnalizacyjne parakrynne/jukstakrynowe i siła hemodynamiczna wpływają na dojrzewanie kardiomiocytów. Uproszczona metoda zmiany molekularnego i biomechanicznego mikrośrodowiska rozwijającego się kardiomiocytu posłużyłaby zatem jako potężna technika do zbadania, w jaki sposób warunki lokalne wpływają na los i funkcję komórki. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę fizycznego przeszczepiania młodocianych kardiomiocytów do ektopowych lokalizacji w sercu lub otaczającej tkance embrionalnej. Pozwala nam to zbadać, w jaki sposób warunki mikrośrodowiskowe wpływają na przejścia losów kardiomiocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w nienaruszonym zarodku. W tym miejscu opisujemy protokół, w którym miocyty embrionalne mogą być izolowane z różnych poddomen serca, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i mikrowstrzykiwane do zarodków gospodarza z dużą precyzją. Komórki mogą być następnie bezpośrednio analizowane in situ przy użyciu różnych technik obrazowania i histologicznych. Protokół ten jest potężną alternatywą dla tradycyjnych eksperymentów z przeszczepami, które mogą być zbyt trudne w poruszającej się tkance, takiej jak serce. Ogólny zarys tej metody można również dostosować do różnych tkanek dawcy i środowisk gospodarza, a jej łatwość użycia, niski koszt i szybkość sprawiają, że jest to potencjalnie użyteczne zastosowanie w różnych badaniach rozwojowych.

Wprowadzenie

Badania nad rozwojem serca ogromnie skorzystały z pojawienia się transgenicznych systemów modelowych linii zarodkowej, które zidentyfikowały wiele sieci regulacyjnych genów, które kształtują różne linie komórkowe i domeny funkcjonalne w sercu. Jednak określenie, w jaki sposób te sieci genów oddziałują i reagują na warunki mikrośrodowiskowe, w tym sygnały parakrynne/jukstakrynowe i dane biofizyczne (rozciąganie, odkształcenie, przepływ hemodynamiczny), może być trudne. W związku z tym nie zawsze łatwo jest określić, czy fenotyp komórkowy powstaje jako bezpośrednia konsekwencja zaburzeń genetycznych, czy jako wtórny wynik adaptacji do zmian w biomechanice serca lub składzie tkanek wyższego rzędu^1,2.

Eksperymenty z szczepieniem, które klasycznie były używane do rozwiązywania problemów związanych z określeniem losu, zaangażowaniem, indukcją i kompetencjami^3,4, stanowiłyby idealne podejście do obejścia niektórych wyzwań związanych z definiowaniem autonomicznego wpływu komórki na środowisko w sercu. Niestety, skurcze serca utrudniają standardowe metody przeszczepu. Szybki ruch tkanki często uniemożliwia przeszczepionym komórkom przyleganie do serca, a duże nakłucia tkanek (zwykle wymagane do przeszczepu) często prowadzą do niewydolności serca i śmiertelności zarodka^5,6,7. W związku z tym opracowaliśmy ciśnieniowy system mikroiniekcji do precyzyjnej implantacji komórkowej do rozwijającego się serca pisklęcia, omijając opisane wcześniej przeszkody techniczne związane z przeszczepem tkanek^8,9. Korzystając z tej techniki, pojedyncze lub małe grupy komórek serca wyizolowanych z zarodka dawcy mogą być mikrowstrzykiwane do różnych regionów serca embrionalnego gospodarza, eliminując potrzebę intensywnego przygotowania gospodarza i duże uszkodzenia tkanki, które powstają przy użyciu standardowych technik przeszczepu. Igły do mikroiniekcji używane do tych badań implantacyjnych mają średnicę zewnętrzną ~30−40 μm, co oznacza, że igła może być umieszczona bezpośrednio w tkance docelowej (tj. Może przenikać przez ścianę zarodkową mięśnia sercowego), a komórki mogą być dostarczane ogniskowo przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki. Protokół może być stosowany do wykonywania różnych manipulacji izotopowych, heterotopowych, izochorycznych i heterochronicznych, zapewniając szybkie, elastyczne i tanie podejście do bezpośredniego badania klasycznych eksperymentalnych paradygmatów embriologicznych w rozwijającym się czterokomorowym sercu.

W protokole opisanym poniżej, oznaczamy komórki dawcy barwnikiem fluorescencyjnym przenikanym przez komórkę, co pozwala na monitorowanie sukcesu eksperymentu z mikroiniekcją w czasie rzeczywistym i dokumentowanie lokalizacji przeszczepionych komórek bez potrzeby dodatkowego barwienia. Należy jednak zauważyć, że takie podejście najlepiej nadaje się do eksperymentów krótkoterminowych (około 48 godzin), ponieważ barwnik fluorescencyjny może zostać utracony w wyniku podziału komórek. W przypadku eksperymentów długoterminowych można zastosować alternatywne podejścia.

Chociaż prezentujemy tę technikę w kontekście rozwoju serca, użyliśmy jej z doskonałym skutkiem do eksperymentów z implantacją komórek do mezodermy, głowy, kończyn i somitów. W związku z tym podstawowe podejście opisane poniżej jest wysoce wykonalne i może być stosowane w różnych układach narządów.

Protokół

Wszystkie opisane metody są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill.

1. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji

1. Wyciągnij szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet. W przypadku niektórych iniekcji zaleca się ukosowanie igłą, ponieważ zapewnia ono wyjątkowo ostrą powierzchnię pozbawioną zanieczyszczeń strukturalnych. W tym celu należy wypolerować koniec ciągniętej igły na ściernicy do ukosowania pod kątem 45° przez 15−20 min.
   UWAGA: Dokładne ustawienia ciągnięcia będą się różnić w zależności od używanego ściągacza. Ostateczna średnica wewnętrzna skosu powinna wynosić od 20 do 40 μm.
2. Pokryj wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię szklanej kapilary silikonem. Najpierw zanurz igły w środku silikonowym, aby pokryć zewnętrzną powierzchnię igły, a następnie załaduj roztwór środka silikonowającego z powrotem do każdej mikropipety, aby pokryć wewnętrzną powierzchnię.
   UWAGA: Powlekanie szklanych naczyń włosowatych powinno być wykonane 24 godziny przed eksperymentem implantacyjnym. Pokrycie szklanych kapilar silikonem zapewnia chemicznie obojętną powierzchnię szkła. Jeśli naczynia włosowate nie zostaną poddane leczeniu, zawiesina komórek wytworzona w późniejszych krokach przylgnie do szkła i zatka igłę. Dlatego powlekanie jest konieczne i niezbędne dla powodzenia metody.
   UWAGA: Środek silikonowy jest gotową, dostępną na rynku mieszaniną heptanu i 1,7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-oktametylotetrasiloksanu (tabela materiałów). Jest skrajnie łatwopalny i bardzo toksyczny. Zawsze należy obchodzić się z odpowiednimi środkami ochrony osobistej wewnątrz dygestorium.
   1. Aby ponownie załadować igłę, załaduj ~5−10 μl środka silikonowającego do końcówki pipety do mikroiniekcji (tabela materiałów). Umieść końcówkę do mikroiniekcji w szerokim końcu ciągniętej szklanej kapilary i umieść końcówkę jak najdalej w dół (blisko szklanej końcówki igły). Wysuń środek silikonowyzujący, powoli wyjmując pipetę ładującą, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza w igle.
   2. Pozostaw środek silikonowy w szklanej igle na 10 minut, usuń przez zasysanie nową pipetą ładującą i pozostaw igły do wyschnięcia na noc w dygestorium.
3. Rano w dniu eksperymentu przepłukać szklane naczynia włosowate wodą dejonizowaną zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.2 i pozostawić do wyschnięcia na 3-4 godziny.

2. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 5 ml roztworu neutralizującego trypsynę, uzupełniając 4,2 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's i mieszanki składników odżywczych szynki F12 firmy Dulbecco z 750 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 50 μl penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
2. Przygotować 5 μM roztworu barwnika do etykietowania, pipetując 5 μl 1 mM podstawowego barwnika do etykietowania (w dimetylosulfotlenku [DMSO], tabela materiałów) do 995 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS). Wirować przez 1 minutę i przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
3. Przygotuj świeży paraformaldehyd (PFA), łącząc 10 ml 32% roztworu podstawowego PFA z 62 ml wody klasy biologii molekularnej i 8 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Końcowe stężenie to 4% PFA w 1x DPBS.

3. Przygotowanie zarodków gospodarza

1. Inkubować płodne jaja kurze w orientacji poziomej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C do Hamburger and Hamilton (HH) Stage 19¹⁰.
   UWAGA: Etap wybrany do manipulacji jest elastyczny i całkowicie zależny od celów każdego indywidualnego eksperymentu.
2. Naciąć "płaski" koniec skorupki jajka wzdłuż równika jaja za pomocą kątowych kleszczy, aby wykonać małe nakłucie o średnicy >1 mm. Wprowadzić igłę 18 G z dołączoną strzykawką 10 ml przez nakłucie i usunąć ~5 ml albuminy.
   UWAGA: To anatomiczne miejsce znajduje się na zewnątrz "komórki powietrznej" wewnątrz komórki jajowej i zapobiega wyciekaniu albuminy po wykonaniu nakłucia. Ten krok jest zalecany, ponieważ "upuszcza" zarodek z dala od skorupki jaja, zapobiegając potencjalnym uszkodzeniom w kolejnych etapach.
3. Nałóż przezroczystą taśmę na wierzch skorupki jajka. Naciąć kątowymi kleszczami i wyciąć okienko o długości ~2,5 cm za pomocą zakrzywionych nożyczek do tenotomii.
4. Zbadaj i uporządkuj zarodek na podstawie kryteriów ustalonych przez Hamburger i Hamilton¹⁰ i zapieczętuj nakłucie z kroku 3.2 przezroczystą taśmą.
   UWAGA: Tutaj stosuje się zarodki w stadium HH 19, które mają 37-40 somitów rozciągających się do pąka ogonowego. Nakłucie nie powinno być uszczelnione, dopóki okienko nie zostanie otwarte wzdłuż górnej części jaja (krok 3.3).
5. Wstrzyknąć ~200 μL mieszaniny India Ink/HBSS (1:5) pod zarodek za pomocą igły 32 G z dołączoną strzykawką 1 ml.
   UWAGA: Tusz indyjski zapewnia wizualny kontrast między zarodkiem a żółtkiem pod spodem. W celu poprawy kontrastu można stosować alternatywne barwniki, takie jak neutralny czerwony lub dostępne na rynku zestawy filtrów fluorescencyjnych z cyjanem białkiem fluorescencyjnym (CFP) lub niebieskim białkiem fluorescencyjnym (BFP).
6. Dodać kroplami 1 ml HBSS na krążek zarodkowy i uszczelnić otoczki z okienkami folią parafinową. Umieścić jaja z powrotem w nawilżonym inkubatorze, aż będą gotowe do wstrzyknięcia.

4. Izolacja tkanki dawcy

1. Inkubować płodne jaja kurze dawcy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 °C do etapu HH 19 (lub etapu pożądanego).
2. Usunąć zarodek z komórki jajowej i umieścić na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierającej sterylny HBSS w temperaturze pokojowej (RT).
3. Chirurgicznie mikropreparuj tkankę dawcy przedsionków z każdego zarodka, najpierw izolując całe serce embrionalne od zarodka, a następnie izolując przedsionki od serca za pomocą kleszczy, nożyczek do tenotomii i mikroszpatułki pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym. Umieścić w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml HBSS na lodzie.
4. Po pobraniu całej tkanki dawcy osadzać tkankę przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce o stałym kącie nachylenia.

5. Trawienie trypsyny w tkance dawcy

1. Zawiesić granulki komórkowe w 1 ml podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w bloku grzewczym z wytrząsaniem przy 300 obr./min. Alternatywnie można użyć łaźni wodnej z okresowym mieszaniem próbki.
2. Odpipetować roztwór wytrawiający w górę i w dół, aby rozbić pozostałą tkankę i osad jak w kroku 4.4.
3. Zawiesić osad w 1 ml roztworu neutralizującego trypsynę i odwirować jak w kroku 4.4.
4. Zawiesić komórki w 400 μl roztworu barwnika znakującego czerwoną fluorescencyjność i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w bloku grzewczym. Alternatywnie skorzystaj z kąpieli wodnej.
5. Po zakończeniu reakcji znakowania należy otoczkować komórki jak w kroku 4.4 i przemyć 1 ml HBSS (liczba etapów płukania może być zmieniona w zakresie od 1 do 3).
6. Ponownie zawiesić znakowane, granulowane komórki w stężeniu ~ 50 000 komórek/μl, co zwykle daje objętość roboczą 5-10 μl w zależności od całkowitej wydajności komórek.
   UWAGA: Stężenia komórek poniżej ~50 000 komórek/μL mogą skutkować słabą wydajnością wstrzykiwania.

6. Iniekcja in vivo

1. Załadować zawiesinę komórek do szklanej pipety kapilarnej nasączonej silikonem, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 1.2. Zamontuj pipetę w aparacie do mikroiniekcji ciśnieniowych.
2. Wyjmij zarodki gospodarza z wilgotnego inkubatora i umieść w uchwycie na jaja pod fluorescencyjnym stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym.
   1. Otwórz błonę witelinową za pomocą sterylnych cienkich kleszczy i wykonaj małe nacięcie (o długości ~0,5−1,0 mm) w osierdziu. Może być konieczna dodatkowa manipulacja/rozwarstwienie w zależności od obszaru docelowego do wstrzyknięcia.
3. Ustawić mikrowstrzykiwacz w taki sposób, aby końcówka igły do mikroiniekcji wnikała w tkankę docelową.
   1. Wstrzyknij ciśnieniowo komórki i użyj etykiety fluorescencyjnej, aby określić, czy wszczepione komórki są obecne w pożądanej tkance. W przypadku typowych wstrzyknięć należy stosować pojedyncze impulsy o czasie trwania krótszym niż 0,5 s w zakresie ciśnienia od 100 do 400 hektopaskalów.
      UWAGA: Długość impulsu i ciśnienie bezwzględne będą się różnić w zależności od liczby komórek do wstrzyknięcia i mogą być modyfikowane w zależności od indywidualnych potrzeb.
   2. Wycofać aparat do mikrowstrzykiwaczy i wyjąć jajo z uchwytu po wstrzyknięciu ciśnieniowym.
4. Dodać kroplami 1 ml ciepłego HBSS na zarodek, zamknąć jaja przezroczystą taśmą pakową i inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C przez 24 godziny po implantacji.

7. Izolacja i analiza

1. Wyizoluj zarodki gospodarza w RT HBSS za pomocą kleszczy, nożyczek do tenotomii i mikroszpatułki, podobnie jak w kroku 4.3, i utrwal w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
2. Myć zarodki 3 x 5 minut w HBSS w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem i przechowywać w HBSS w temperaturze 4 °C do dalszej analizy (mikroskopia, immunohistochemia, hybrydyzacja in situ itp.).

Wyniki

Po 24 godzinach inkubacji, serce i otaczające tkanki embrionów gospodarza zostały wyizolowane, sfotografowane (Rysunek 1A) i przetworzone do analizy immunofluorescencyjnej. W tym przykładzie miocyty przedsionkowe dawcy zostały mikrowstrzyknięte do nadsierdzia zarodka gospodarza o podobnym stadium. Zarodek gospodarza został następnie przebarwiony markerem mięśniowym (MF20 zielony) i 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI; niebieski). Wstrzyknięte komórki (czerwone) są wyraźnie widoczne (Rysunek 1B). Możliwe korekty, które należy rozważyć, jeśli komórki nie są widoczne, obejmują: nadmierne trawienie tkanki dawcy (komórki nie byłyby w stanie się przyłączyć), roztwór barwnika znakującego był zbyt rozcieńczony, komórki były nadmiernie myte lub wielokrotne podziały komórkowe powodowały utratę znacznika.

Aby potwierdzić, że wstrzyknięte komórki w tym przykładzie były mięśniem sercowym, optycznie przecięliśmy ten zarodek za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rysunek 1C-E). Jedynymi komórkami MF20 dodatnimi w obrębie nadsierdzia (PE) są fluorescencyjne czerwone dodatnie komórki, które zostały wszczepione ogniskowo.

Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy zarodków wyizolowanych 24 godziny po wstrzyknięciu. (A) Obraz w jasnym polu o małym powiększeniu obszaru tułowia zarodka pisklęcia E3.5 (HH Stage 19). (B) Scalony obraz przedstawiający wstrzyknięte komórki (czerwony), kardiomiocyty (zielony) i DAPI. Komórki wyizolowano z przedsionków i mikrowstrzyknięto do nasierdzia. (C) Obrazowanie konfokalne w dużym powiększeniu przedstawiające znakowane komórki w rdzeniu nasierdzia. (D) Obrazowanie konfokalne w dużym powiększeniu, potwierdzające, że komórki znakowane czerwienią CT są kardiomiocytami. (E) Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja ostrzykiwanych komórek z paneli D i E. W, przedsionkach; OFT, droga odpływowa; PE, nasierdzie; Vt, komora; MF20, Miozyna 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Możliwość określenia, w jaki sposób warunki mikrośrodowiskowe wpływają na specyfikację losu komórek serca i stabilizację linii, ma fundamentalne znaczenie dla stworzenia kompresyjnego zrozumienia wrodzonych wad serca, a także dla opracowania skutecznych protokołów prawidłowego dojrzewania kardiomiocytów opartych na komórkach macierzystych lub komórkach somatycznych. Opisany powyżej protokół daje badaczom możliwość bezpośredniego oznaczania rozwoju komórek serca w zmienionych warunkach in vivo, co pozwala na oddzielenie autonomicznych procesów dojrzewania komórek od sygnałów parakrynnych/jukstakrynowych i/lub hemodynamicznych. W połączeniu z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, analizą genetyczną i testami fizjologicznymi, technika ta może służyć jako potężne uzupełnienie istniejących modeli transgenicznych.

Z technicznego punktu widzenia, przedstawiony tutaj protokół opiera się na skutecznej izolacji, znakowaniu i precyzyjnym wszczepianiu komórek serca dawcy do tkanek embrionalnych gospodarza. Zastosowanie systemu mikroiniekcji znacznie pomaga w celowaniu w komórki dawcy i pozwala na udaną implantację bez konieczności tworzenia dużego miejsca wszczepienia w tkance gospodarza. Do wykonania tej techniki wymagane są jednak pewne umiejętności operacyjne, ponieważ może dojść do zmniejszonej żywotności, jeśli igła do wstrzykiwań nie zostanie ostrożnie umieszczona w tkance docelowej (powodując pęknięcie serca lub miejscowe unaczynienie). Należy również zwrócić uwagę i przemyśleć etapy izolacji i etykietowania. Nadmierne trawienie tkanki dawcy może prowadzić do słabej wydajności implantacji, a techniki znakowania przejściowego mogą ograniczać okno czasowe, w którym można śledzić komórki dawcy (ponieważ podział komórek może rozcieńczyć etykietę).

Ta technika jest wysoce modyfikowalna i może być dostosowana do różnych celów. Na przykład, komórki dawcy z wielu różnych tkanek i etapów mogą być izolowane (chociaż wymagana jest optymalizacja trawienia enzymatycznego) i mogą być podobnie wstrzykiwane do różnych tkanek gospodarza na różnych etapach rozwoju. Podobnie, podejście do znakowania można zmodyfikować w celu śledzenia komórek w różnych oknach czasowych, w tym poprzez zastosowanie fluorescencyjnych nieorganicznych nanokryształów półprzewodnikowych do dłuższego przejściowego znakowania i implantacji komórek przepiórczych lub komórek z transgenicznych zarodków dawcy z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP+)¹¹ w celu znakowania permeanowego.

Chociaż obecnie używamy tej techniki do badań nad implantacją ptaków, uważamy, że może ona być wykorzystana w szerokim zakresie badań chimerycznych w przyszłości. Na przykład genetycznie zmienione komórki serca z organizmów transgenicznych mogą być izolowane i mikrowstrzykiwane do ptasiego serca przy użyciu bardzo podobnego protokołu. Co więcej, komórki zróżnicowane w kardiomiocyty z komórek macierzystych lub za pomocą metod przeprogramowania komórek somatycznych mogą być mikrowstrzykiwane do serca embrionalnego w celu oceny ich integracji z tkanką i/lub dojrzewania w warunkach biomechanicznych in vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml strzykawka insulinowa	BD	329654
1,7 ml mikroprobówki, przezroczyste	Genesee Scientific	24-282
10 ml strzykawka	BD	305482
1000ul Reach Barrier Tip Racked, sterylna	Genesee Scientific	24-430
15 mL probówki wirówkowe, stojakowe	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator Inkubator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 igły	BD	305196
200ul Końcówka barierowa Niskie wiązanie, zębatka, sterylna	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Igła	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Chusteczki Alchohol 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
kątowe Kleszcze	Fine Scientific Tools	11260-20
Końcówki do ładowania wstecznego	Eppendorf	930001007
Black India Ink	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Zielony CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM w DMSO
CellTracker Czerwony CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM w wirówce DMSO
	Eppendorf	5424R
Zszywki	do taśmy pakowej klasy komercyjnej	2619001
Zakrzywione nożyczki do tenotomii	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, bezwodny	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), bez wapnia, bez magnezu	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher Scientific	10437-028
	Wylęgarnia
HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Mikromanipulator	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldehyd 32% w roztworze wodnym, klasa EM	VWR	100496-496
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Szalka Petriego	Genesee Scientific	32-107
Młynek do pipet	Narishige	EG-44
Ściągacz do pipet	HEKA	6
Zszywki	z przezroczystą taśmą szkocką	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Mikroskop stereoskopowy	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Cienkościenne szklane kapilary	Precision Instruments	TW100F-4
Pipeta transferowa	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher Scientific	25300-054