Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59268

⸱

16 maja 2019

 ,  ,  ,  , 
1Aix Marseille Université, Institut de Neurosciences des Systèmes (INS), 2Electrical Engineering Division, University of Cambridge, 3Department of Bioelectronics, Centre Microélectronique de Provence - Ecole Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne (CMP-EMSE), 4Institut de Neurosciences de la Timone, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) UMR 7289 & Aix- Marseille Université, 5Neuroengineering Research Group, Interdisciplinary Excellence Center, Department of Medical Microbiology and Immunobiology, University of Szeged

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wyzwaniem badań nad padaczką jest opracowanie nowych metod leczenia dla pacjentów, u których klasyczna terapia jest niewystarczająca. Korzystając z nowego protokołu - za pomocą wszczepialnego systemu dostarczania leków - jesteśmy w stanie kontrolować napady padaczkowe u znieczulonych myszy poprzez elektroforetyczne dostarczanie GABA do ogniska padaczkowego.

Streszczenie

Epilepsja to grupa zaburzeń neurologicznych, która dotyka miliony ludzi na całym świecie. Chociaż leczenie farmakologiczne jest pomocne w 70% przypadków, poważne działania niepożądane wpływają na jakość życia pacjentów. Ponadto wysoki odsetek pacjentów z padaczką jest oporny na leki; W ich przypadku konieczna jest neurochirurgia lub neurostymulacja. Dlatego głównym celem badań nad padaczką jest odkrycie nowych terapii, które są w stanie wyleczyć padaczkę bez skutków ubocznych lub zapobiec nawrotom napadów u pacjentów opornych na leki. Neuroinżynieria zapewnia nowe podejścia poprzez wykorzystanie nowatorskich strategii i technologii w celu znalezienia lepszych rozwiązań w leczeniu zagrożonych pacjentów z padaczką.

Jako demonstracja nowego protokołu eksperymentalnego w ostrym mysim modelu padaczki, zastosowano system bezpośredniego dostarczania leków elektroforetycznych in situ. Mianowicie, wszczepiono sondę neuronową wyposażoną w mikroprzepływową pompę jonową (μFIP) do dostarczania leku na żądanie i jednoczesnego rejestrowania lokalnej aktywności neuronalnej, która wykazała, że jest w stanie kontrolować aktywność napadów padaczkowych (SLE) indukowaną przez 4-aminopirydynę (indukowaną przez 4AP). Stężenie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) jest utrzymywane w zakresie fizjologicznym poprzez precyzyjną kontrolę dostarczania GABA w celu osiągnięcia efektu przeciwpadaczkowego w ognisku napadu, ale nie w celu spowodowania wybuchów odbicia wywołanych nadmiernym hamowaniem. Metoda ta pozwala zarówno na wykrycie aktywności patologicznej, jak i interwencję w celu zatrzymania napadów poprzez dostarczanie neuroprzekaźników hamujących bezpośrednio do ogniska padaczkowego z precyzyjną kontrolą czasoprzestrzenną.

W wyniku rozwoju metody eksperymentalnej, SLE mogą być indukowane w wysoce zlokalizowany sposób, który pozwala na kontrolę napadów poprzez precyzyjnie dostrojone dostarczanie GABA na początku napadu.

Wprowadzenie

Epilepsja jest czwartym najczęściej występującym zaburzeniem neurologicznym: około 1% populacji cierpi na epilepsję, a około jedna trzecia dotkniętych chorobą ma nawracające napady. W większości przypadków napady można kontrolować za pomocą leków. Jednak leczenie farmakologiczne musi być ustalane indywidualnie dla każdego pacjenta, gdzie znalezienie prawidłowego dawkowania może zająć lata1,2. Ponadto większość leków ma poważne skutki uboczne, które obniżają jakość życia3,4,5,6,7. Wreszcie, w 30% przypadków pacjenci są oporni na leki, a w przypadku stałego pojedynczego locus generatora napadów, tylko neurochirurgia resekcyjna może złagodzić występowanie napadów8. Dlatego główną inicjatywą we współczesnych badaniach nad padaczką jest odkrycie nowych strategii, które mogą zapobiec nawrotom napadów u pacjentów z grupy ryzyka, jednocześnie zmniejszając konieczność stosowania silnych terapii lekowych i inwazyjnych operacji resekcyjnych.

Napady padaczkowe występują, gdy występuje brak równowagi w obwodach pobudzających i hamujących w całym mózgu (padaczka uogólniona) lub w zlokalizowanej części mózgu (padaczka ogniskowa), tak że neurony rozładowują się w nieprawidłowy sposób9,10,11. Leki przeciwpadaczkowe mogą działać na dwa różne sposoby w zapobieganiu napadom: albo zmniejszając pobudzenie, albo wzmacniając hamowanie12. W szczególności mogą one modyfikować aktywność elektryczną komórek nerwowych poprzez wpływ na kanały jonowe w błonie komórkowej13 lub wpływać na transmisję chemiczną między neuronami, wpływając na hamujący neuroprzekaźnik GABA lub pobudzający glutaminian w synapsach14,15. W przypadku niektórych leków sposób działania jest nieznany18. Ponadto leczenie farmakologiczne ma ciągły wpływ na pacjentów i nie może dostosować się do dynamiki występowania napadów. Idealnie byłoby, gdyby leki o określonych mechanizmach działania działały na podstawowe procesy padaczkowe. Optymalna terapia nie dotykałaby mózgu w odstępach międzyobszarowych, ale działałaby natychmiast, gdy zaczyna się rozwijać napad. W przeciwieństwie do tego, we wszystkich przypadkach padaczki, leki oznaczają teraz systematyczne leczenie, wpływające na cały mózg i całe ciało pacjenta9.

Napady padaczkowe mogą pojawić się wiele lat po początkowym znieważeniu, takim jak uraz mózgu. Okres między początkowym zniewagą a wystąpieniem pierwszych napadów samoistnych charakteryzuje się znacznymi reorganizacjami molekularnymi i komórkowymi, w tym śmiercią neuronów z zanikiem połączeń sieci neuronalnej i kiełkowaniem aksonów/neosynaptogenezą z pojawieniem się nowych połączeń19,20,21. Gdy napady stają się nawracające, ich częstotliwość i nasilenie mają tendencję do zwiększania, obejmując więcej obszarów mózgu. Ważne jest, aby odróżnić miejsca wystąpienia napadów (regiony padaczkowe) od sieci propagacyjnych, ponieważ zasady genezy i rozprzestrzeniania się napadów mogą się różnić. Badania przeprowadzone na tkankach ludzkich i eksperymentalnych modelach padaczki dostarczyły ważnych danych dotyczących reorganizacji obwodów i ich zdolności do generowania napadów20,21,22,23. Trudno jednak określić, czy te reorganizacje są reakcjami adaptacyjnymi, czy też są przyczynowo związane z epileptogenezą lub genezą i rozprzestrzenianiem się napadów12.

Dlatego lokalizacja ogniska padaczkowego i miejscowe stosowanie leków przeciwpadaczkowych jest jednym z głównych wyzwań we współczesnych badaniach nad padaczką. Kilka eksperymentów z wykorzystaniem zwierzęcych modeli padaczki oraz niektóre badania kliniczne miały na celu ustalenie początku napadów i zdefiniowanie mechanizmów leżących u ich podstaw w mózgu24,25,26,27. W tym celu opracowaliśmy nowy protokół eksperymentalny wykorzystujący model padaczki indukowanej przez 4AP28,29,30,31 w preparacie na ostrą myszy, który pozwala na precyzyjne wprowadzenie trzech urządzeń do danego obszaru hipokampa, gdzie aktywność sieci in vivo jest manipulowana w wysoce zlokalizowany sposób. Miejscowe wstrzyknięcie 4AP za pomocą szklanej mikropipety pomaga w indukcji padaczkowego SLE w zlokalizowanym miejscu w hipokampie, podczas gdy za pomocą nowatorskiej sondy μFIP na bazie polimeru kontrola aktywności napadowej jest osiągana jednocześnie poprzez rejestrowanie aktywności elektrycznej neuronów w miejscach rejestracji urządzenia. Aktywność lokalnego pola hipokampa jest również monitorowana za pomocą wielokanałowej sondy krzemowej w sposób specyficzny dla warstwy w korze mózgowej i hipokampie jednocześnie.

Niedawno wynalezione sondy μFIP działają poprzez wykorzystanie pola elektrycznego do przepychania naładowanych leków przechowywanych w kanale mikroprzepływowym przez membranę wymiany jonowej (IEM) i na zewnątrz do otaczającej tkanki (Rysunek 1). IEM selektywnie transportuje tylko jeden rodzaj jonów (kation lub anion), a tym samym działa w celu ograniczenia zarówno pasywnej dyfuzji w stanie "wyłączonym", jak i transportu przeciwnie naładowanych gatunków z otaczającej tkanki do urządzenia. Pole elektryczne jest wytwarzane na żądanie poprzez przyłożenie małego napięcia (<1 V) między elektrodą źródłową, która jest wewnętrzna w kanale mikroprzepływowym, a elektrodą docelową, która znajduje się na zewnątrz urządzenia (w tym przypadku śruba z w modelu zwierzęcym). Szybkość dostarczania leku jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia i zmierzonego prądu między elektrodą źródłową a docelową. Precyzyjna możliwość dostrajania dostarczania leku jest jedną z głównych zalet μFIP. Kolejną istotną zaletą, w porównaniu z systemami dostarczania leków opartymi na przepływie lub ciśnieniu, jest to, że w μFIP występuje tylko znikomy wzrost ciśnienia na wylocie leku, ponieważ leki są dostarczane przez IEM bez roztworu nośnego.

Występuje niewielka ilość pasywnego wycieku GABA, gdy μFIP jest "wyłączony", ale stwierdzono, że nie wpływa to na SLE. μFIP są wykonywane na zamówienie zgodnie z konwencjonalnymi metodami mikrowytwarzania, o których pisaliśmy wcześniej31.

Ponieważ jednym ze sposobów zapobiegania nawracającym napadom jest blokada wyładowań sieciowych na samym początku lub nawet przed pierwszym napadem, przedstawiona metoda dostarczania hamującego neuroprzekaźnika GABA do ogniska padaczkowego ma duży potencjał terapeutyczny dla kontroli napadów u pacjentów z padaczką ogniskową. Ponieważ GABA jest endogennym substratem, pozostawia wewnętrzne właściwości neuronalne niezmienione w stężeniach fizjologicznych. Miejscowe stosowanie niskiego poziomu GABA wpłynie tylko na komórki naturalnie reagujące na hamowanie i spowoduje tylko podobne efekty do hamowania fizjologicznego, w przeciwieństwie do głębokiej stymulacji mózgu (DBS), która ma niespecyficzne działanie poprzez stymulację wszystkich komórek sieci neuronalnej w swoim środowisku, powodując mieszaną odpowiedź obejmującą zarówno pobudzenie, jak i hamowanie. Podsumowując, proponowana metoda zapewnia bardziej szczegółowe podejście do kontroli napadów niż DBS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Institut de Neurosciences des Systèmes i zatwierdzone przez lokalne Komisje Etyczne i Biura Weterynaryjne.

UWAGA: Do eksperymentów użyto siedemnastu dorosłych samców myszy OF1. Myszy zostały przystosowane do 12-godzinnego cyklu światło/ciemność z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum.

1. Znieczulenie

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg masy ciała i 10 mg/kg masy ciała) w celu znieczulenia zwierzęcia.
  2. Sprawdź poziom znieczulenia, obserwując częstość oddechów i trzepotanie oraz sprawdzając reakcję myszy na ból.
    UWAGA:     Gdy oddech myszy staje się regularny, nie można zaobserwować trzepania, a zwierzę nie reaguje na szczypanie ogona, znieczulenie jest wystarczająco głębokie, aby kontynuować.
    1. Umieść zwierzę na elektrycznie programowalnej poduszce grzewczej. Przykryj sondę temperatury doodbytniczej produktem na bazie wazeliny (patrz Tabela materiałów) i delikatnie umieść ją w odbytnicy (1–2 cm głębokości) myszy, aby monitorować temperaturę jej ciała. Utrzymuj temperaturę ciała między 36,5 a 37,5 °C podczas zabiegów chirurgicznych i zapisów eksperymentalnych.
    2. Monitoruj poziom znieczulenia, sprawdzając odruchy myszy, ruchy wąsów i częstotliwość jej oddychania. Biorąc pod uwagę poziom znieczulenia rejestrowany co najmniej co 30 minut, podawaj domięśniowo niewielką dawkę koktajlu ketaminowo-ksylazynowego (20–50 μL, w takim samym stężeniu jak dotychczas).

2. Chirurgia/Kraniotomia

  1. Zamocuj głowę myszy w ramce stereotaktycznej. Za pomocą igły 30 G wstrzyknąć miejscowo przeciwbólową ropiwakainę (5 μl, 7,5 mg/ml, patrz tabela materiałów) podskórnie w planowane miejsce nacięcia. Odczekaj 5 minut, aż zacznie działać.
  2. Wykonaj skalpelem prostą linię środkową w skórze nad czaszką. Delikatnie pociągnij skórę na boki za pomocą cienkich kleszczy i zaciśnij ją na bok za pomocą zacisków bulldog serrefine, aby czaszka była odsłonięta do dalszej pracy.
  3. Oczyść czaszkę z powięzi skalpelem lub innym podobnym narzędziem. W przypadku powierzchownego krwawienia należy usunąć krew wacikami lub małymi kawałkami ręcznika papierowego.
  4. Weź uziemiającą pokrytą poli(3,4-etylenodioksytiofenem) sulfonianem polistyrenu (PEDOT: PSS) (rozmiar: #00, średnica: 0,047 cala, długość: 1/8 cala, patrz tabela materiałów) z lutowanym przewodem i podłącz go za pomocą złącza do amplifier headstage.
  5. Zwilż czaszkę w żądanym miejscu otworu i wywierć otwór z dużą prędkością za pomocą drobnego, okrągłego wiertła (o średnicy 0,4 mm) w czaszce nad móżdżkiem, aż opona twarda będzie widoczna. Włóż uziemiającą do otworu i wkręć ją precyzyjnym śrubokrętem, aż dotrze do górnej części móżdżku.
    nuta: Śruba z została pokryta zanurzeniowo roztworem PEDOT:PSS zawierającym wagowo 1% 3-glicydyloksypropylo)trimetoksysilanu (GOPS), a następnie wypalana w temperaturze 140 °C przez 90 minut. PEDOT:PSS jest sprzężonym polimerem o pojemności wolumetrycznej, o której wiadomo, że jest biokompatybilna. GOPS jest środkiem sieciującym zmieszanym z PEDOT:PSS w celu zwiększenia stabilności w środowisku wodnym (Rysunek 2).
  6. Za pomocą ramki stereotaktycznej zmierz współrzędne stereotaktyczne dla żądanego obszaru mózgu. Na przykład obszar zainteresowania to hipokamp, przednio-tylny (AP) -1,8 mm i przyśrodkowo-boczny (ML) 1,8 mm od punktu Bregma na podstawie atlasu mózgu dla myszy32.
    nuta: Są to współrzędne prawej półkuli (Rysunek 2).
  7. Rozcieńczyć obszar czaszki o średnicy około 1 do 2 mm powyżej obszaru docelowego za pomocą niezawodnego wiertła dentystycznego (patrz Tabela materiałów) ustawionego z dużą prędkością, aż pozostanie cienka, dobrze wypolerowana, przezroczysta błona kostna.
  8. Następnie, jeśli grubość błony kostnej jest wystarczająco cienka (<200 μm), wykonaj mały otwór cienkimi kleszczami i delikatnie usuń cienką warstwę kości33. Użyj specjalnie wykonanej igły z haczykowatą końcówką, aby usunąć oponę twardą. Zminimalizuj rozmiar kraniotomii i durotomii, aby zapobiec rozwojowi obrzęków i zminimalizować pulsacje serca i/lub oddechowe mózgu.
    nuta: Kraniotomia musi być wypełniona kroplą roztworu soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie regularnie uzupełniana podczas eksperymentu (Ryc. 2).

3. Wprowadzenie wielokanałowej sondy krzemowej

  1. Użyj ramion stereotaktycznych pod niewielkim kątem AP (20°), aby sonda krzemowa pozostawiła wystarczająco dużo miejsca na ustawienie pozostałych dwóch implantów i aby miejsca rejestracji i wstrzyknięcia elektrody, pompy jonowej i mikropipety były jak najbliżej siebie.
    nuta: Elektrody, strzykawki i pompy jonowe pokryto kroplą roztworu barwienia DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny [DiI]) w celu wizualizacji post hoc śladów implantacji (0,5 mg/ml DiI w dimetylosulfotlenku).
  2. Umieść sondę silikonową na ramieniu stereotaktycznym przymocowanym do uchwytu magnetycznego i umieść ją obok ramy stereotaktycznej. Ustaw kąt AP (20°), a następnie podłącz sondę do headstage i do uziemiającej.
  3. Powoli opuść sondę krzemową do hipokampa za pomocą precyzyjnego ramienia stereotaktycznego lub zmotoryzowanego mikromanipulatora, aby uniknąć ruchów bocznych (Rysunek 2 i Rysunek 3).
    1. Uruchom oprogramowanie do nagrywania i nagrywaj - za pomocą sceny głównej, podłączonego wzmacniacza i komputera - elektryczne sygnały neuronalne, przesuwając wielokanałową sondę krzemową od szczytu kory mózgowej, aż do osiągnięcia docelowej pozycji grzbietowo-brzusznej (DV) (-1,800 μm od powierzchni kory). Nagrywaj i obserwuj na ekranie komputera sygnał potencjału pola lokalnego (LFP) podczas penetracji.
      nuta: Kontroluj opadanie sondy tak, aby poruszała się powoli i w sposób ciągły podczas nagrywania, aby mieć lepszą kontrolę wizualną nad penetracją i dotarciem do strefy docelowej.
    2. Wykorzystaj aktywność falowania w warstwie piramidalnej formacji hipokampa w zarejestrowanym LFP jako marker strefy docelowej.
      nuta: Aktywność tętnień jest widoczna na jednym lub dwóch sąsiednich kanałach wielokanałowej sondy krzemowej (Si) o odległości 100 μm między miejscami rejestracji (Rysunek 4).
    3. Rejestruj sygnały LFP z warstw kory mózgowej i hipokampa jednocześnie przez oprogramowanie wzmacniacza wielokanałowego (patrz Tabela materiałów) za pomocą wielokanałowych sond Si (Rysunek 4).

4. Wstawienie μFIP

  1. Podłącz rurki (patrz Tabela materiałów) do wlotu μFIP i napełnij sondę roztworem 0,05 M GABA. Wyjmij rurki i zamknij wlot folią parafinową. Podłącz przewody elektryczne do źródłowej jednostki pomiarowej.
  2. Włóż μFIP za pomocą ramienia stereotaktycznego pod kątem przyśrodkowo-bocznym (MP) (20°). Sonda Si pozostaje włożona podczas całego procesu.
    UWAGA: μFIP jest bardzo elastyczny i może korzystać z pomocy małego i czystego pędzla, aby utrzymać go prosto, dopóki nie dotrze do powierzchni mózgu. Po tym kroku μFIP można delikatnie opuścić ruchami osiowymi.
  3. Obniżaj μFIP powoli ruchami osiowymi i nigdy nie pozwól mu się zginać podczas trajektorii, dopóki nie osiągnie współrzędnej grzbietowo-brzusznej (DV) (-1,200 μm od powierzchni kory).
    nuta: Spróbuj umieścić oba urządzenia (μFIP i sondę krzemową) jak najbliżej siebie, biorąc pod uwagę odległość wylotu 300 μm od końcówki μFIP.
    UWAGA: Unikaj wszelkich problemów mechanicznych między urządzeniami i ich złączami podczas wkładania (Rysunek 2B i Rysunek 3B).

5. Przygotowanie urządzeń do indukcji napadów

  1. Wymienić metalową igłę strzykawki (10 μl) (patrz tabela materiałów). Wyjąć metalową część przytrzymującą igłę, umieścić i zamocować mikropipetę (średnica zewnętrzna [OD]: 1,2 mm, średnica wewnętrzna [ID]: 0,75 mm, średnica końcówki: 20–50 μm przy ± 0,5 cm zwężenia trzonka), a następnie wymienić element mocujący igłę.
  2. Ustawić strzykawkę i dołączoną mikropipetę borokrzemianową pod kątem 20° boczno-przyśrodkowym (LM) do wstrzyknięcia 4AP (50 mM w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym [ACSF]).
    ostrożność: Nie używać metalowej igły strzykawki ani mikropipety z końcówką większą niż 50 μm.
  3. Pobierz 500 nL–1 μL z 50 mM 4AP za pomocą automatycznej pompy do mikroiniekcji.

6. Wprowadzenie szklanej pipety dołączonej do strzykawki do wstrzykiwania 4AP

  1. Opuścić szklaną mikropipetę dołączoną do strzykawki do wycelowanej pozycji DV (-1 500 μm), a następnie wstrzyknąć 250 nL roztworu 4AP (Rysunek 2 i Rysunek 3). Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do nagrywania. Obserwuj ekran i poczekaj, aż pojawi się pierwszy skok międzynapadowy.
  2. Rozpocznij dostarczanie GABA za pomocą μFIP natychmiast po pojawieniu się pierwszego kolca międzynapadowego. Dostarczyć GABA, przykładając 1 V między źródłem a celem przez 100 s, a następnie 1 s wyłączyć, przez 30 cykli. Za pomocą oprogramowania do nagrywania nagrywaj przez co najmniej 2 godziny < br / > nuta: Całkowita masa dostarczonego GABA wynosi około 1 nmol (Rysunek 5).
  3. Pod koniec eksperymentu delikatnie wyjmij włożone sondy i uziemiającą, a następnie wyjmij zwierzę ze sprzętu stereotaktycznego. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przy użyciu przedawkowania narkotyku (i.p.100mg/kg pentobarbitalu). Zgon został potwierdzony przez zatrzymanie oddechu i krążenia.

7. Ocena rozmieszczenia implantów

  1. Po eutanazji zwierzęcia należy je perfuzjować przezskórnie, najpierw 50 ml soli fizjologicznej, a następnie 150 ml lodowatego roztworu utrwalającego zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB)34.
    ostrożność: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Odetnij głowę zwierzęciu, a następnie usuń skórę i mięsień z góry i boków czaszki. Zaczynając od otworu wielkiego, wykonaj boczne nacięcia w czaszce w kierunku uszu i strzałkowe nacięcie w linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Delikatnie usuń czaszkę za pomocą trymera do kości. Usuń mózg, a następnie wytnij blok tkankowy z obszaru zainteresowania (od punktu Bregma, od -1 do -3 mm AP) za pomocą macierzy mózgowej (patrz tabela materiałów).
  3. Przyklej blok tkanki do uchwytu próbki wibratomu, włóż do niego stojak i ustaw wibratom na grubość 40 μm w kąpieli PB, wykonaj przekroje koronalne 40 μm.
  4. Umyć obficie 0,1 M PB. Postępuj zgodnie z protokołem histologicznym barwienia kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP)31.
  5. Zamontuj sekcje na szkiełkach i przykryj je podłożem montażowym zawierającym 2-(4-amidinofenylo)-1H-indolo-6-karboksyamidynę (DAPI) (patrz tabela materiałów).

8. Mikroskopia konfokalna

  1. Umieść szkiełka z wybarwionymi sekcjami koronalnymi pod 20-krotnym obiektywem mikroskopu konfokalnego. Wybierz region docelowy.
  2. Należy wybrać optymalne zestawy filtrów wzbudzenia i emisji (exc/ems) dla barwników w następujący sposób: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm i fluoresceina (patrz tabela materiałów) = 490/525 nm.
    nuta: Ponieważ barwienie różni się w zależności od sekcji, należy określić odpowiedni zakres minimalnego i maksymalnego wzbudzenia i wykrywania dla każdej sekcji, w której zarówno najmniej gęste, jak i najbardziej gęste obszary wykazują emisję.
  3. Wybierz obszar o najmniejszej gęstości i ustaw intensywność lasera i detekcję na wysokie wartości, a następnie sprawdź w najgęstszych obszarach, czy wartości te powodują przesycenie wykrywanej emisji. Jeśli tak, obniż wartości i sprawdź je ponownie z najmniej gęstym regionem. Powtarzaj te kroki, aż osiągniesz najwyższą możliwą detekcję przy niskich poziomach barwienia i właściwych, nie przesyconych poziomach w silnie zabarwionych obszarach. Powtórz ten proces dla wszystkich barwników.
  4. Użyj funkcji skanowania kafelków mikroskopu o rozdzielczości 512 x 512 pikseli na płytkę, aby uzyskać duży przegląd miejsc wprowadzania sondy z odpowiednią rozdzielczością do przetwarzania post hoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując przedstawioną tutaj procedurę z modelem epilepsji wywołanej 4AP u znieczulonych myszy, można uzyskać kontrolę nad napadami drgawek w ognisku padaczkowym. Precyzyjna lokalizacja implantów (Rysunek 2) pozwoliła na rejestrację lokalnych potencjałów polowych (LFP, Rysunek 4) w hipokampie, wywoływanie niewielkich napadów w hipokampie oraz podawanie GABA w momencie wystąpienia napadu. Lokalizacja implantów była weryfikowana po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowując nowy protokół eksperymentalny w ostrym mysim modelu padaczki, SLE można było z powodzeniem kontrolować za pomocą μFIP wszczepionego w ognisko padaczkowe. Dzięki swojej zdolności do dostarczania GABA z precyzją czasową i przestrzenną, SLE wywołane przez 4AP były kontrolowane na początku napadów. Leczenie padaczki jest teoretycznie możliwe, jeśli kontrola wyładowań w sieci neuronowej zostanie osiągnięta w miejscu rozpoczęcia napadu. Przedstawiony protokół udowodnił, że jest to możliwe, jeśli lokalizacja wstrzyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

C.M.P. dziękuje za finansowanie z grantu Whitaker International Scholar zarządzanego przez Instytut Edukacji Międzynarodowej. A.K. był sponsorowany przez IEF Marie Curie (nr 625372). A.W. potwierdza finansowanie przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 716867). A.W. dodatkowo docenia Inicjatywę Doskonałości Uniwersytetu Aix-Marseille - A*MIDEX, francuski program "Investissements d'Avenir". Autorzy dziękują dr Ilke Uguz, dr Sahika Inal, dr Vincenzo Curto, dr Mary Donahue, dr Marc Ferro i Zsófii Maglóczky za ich udział w owocnych dyskusjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4APSigma275875
Alexa Fluor 488Abcamab15007
WzmacniaczNeuralynx, Montana, USAWzmacniacz Digital Lynx 4SX
AmpliplexKJE-1001
Atlas Stereotaxique Allen Atlas978-0470054086
Pipeta ze szkła borokrzemionkowegoSutterBF120-69-15
Brain MatrixWPI RBMA-200C
Trymer do kościFST16109-14
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 510
ŁącznikINSTECHSC20/15
Coton tigeMonoprixEMD 6107OD
Szkiełko nakrywkoweMenzel-Glass15747592
DiI Stain Thermo FisherD282
DMSOSigma11412-11
WiertarkaFOREDOMK1070
KleszczeFST11412-11
GABASigmaA2129
GFAP Przeciwciało monoklonalneThermofisher53-9892-80
GOPSSigma440167-100M
Seria Hamiltona Hamilton 80330
Zasilanie elementów zTX00-2FH
Poduszka grzewcza Aparat Harvarda341446
pompa wtryskowaWPI UMP3-3
KeithleyTektoronix216A
KetaminaRenaudin5787419
Uchwyt magnetycznySupertech InstrumentsMH-1
MyszyCharles River612
Manipulator motorycznyScientifica, Wielka BrytaniaIVM
Na2HPO4Sigma255793
NaH2PO4Sigma7558807
NeuroTrace DiI ThermofisherN22880
Ręcznik papierowyKIMBERLY CLARK7552000
PBSigmaP4417
PEDOT:PSSCLEVIOS
PFAAcros Organic30525-89-4
Sonda temperatury doodbytnicyAparat Harvard521591
Ropiwakaina Skalpel KABI1260216
SalineSigma7982
F.S.TAUST
Seringue Zalecany
SerrefineFST18050-284
Sonda silikonowaNeuroNexus, Michigan, USAA2x16-10mm-50-500-177 lub A1x16-5mm-150-703
Ramka stereotoksycznaStoelting51733U
SuperfrostSlide Rurki doJ38000AMNZ
INSTECHLS20
Wazelina Laboratoire Gilbert3518646126611
Vectashield DAPIVector Laboratories, Kalifornia, USAH-1200-10
Vibratome, Leica VT1200SLeica Microsystems1491200S001
Ksylazyna Sonda krzemowa Bayer4007221032311
Neuromicrosystems LtdA1x32_dbl_5.0_50_0_176_50
81076212 R195806 jest zacisk BD Medical 324826 ThermoScientific

Bibliografia

  1. Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
  2. Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
  3. Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
  4. Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
  5. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  6. Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
  7. Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
  8. Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
  9. Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
  10. Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
  11. Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
  12. Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  13. Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
  14. Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
  15. Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
  16. Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93(2017).
  17. Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
  18. Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
  19. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  20. Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
  21. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
  22. Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
  23. Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
  24. Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
  25. Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
  26. Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
  27. Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15(2018).
  28. Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
  29. Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
  30. Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
  31. Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291(2018).
  32. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
  33. Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564(2012).
  35. Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
  36. Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Elektroforetyczne dostarczanie lekówmikrofluidyczna pompa jonowakontrola napadów GABAchirurgia stereotaktycznarejestracja hipokampalnaindukcja napadówimplantacja sondy neuronalnejlokalny potencjał polowymodel z zastosowaniem 4-aminopirydynyprecyzyjna lokalizacja
Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.