Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59270

⸱

21 marca 2019

 ,  , 
1Department for Medical Microbiology, Hygiene, Interfacultary Institute for Microbiology, Infection Medicine, University of Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Streszczenie

Badanie potencjału immunogennego bakterii komensalnych na układ odpornościowy gospodarza jest jednym z istotnych elementów podczas badania interakcji jelitowych gospodarz-mikroorganizm. Powszechnie wiadomo, że różne komensala wykazują różny potencjał do stymulowania jelitowego układu odpornościowego gospodarza. Takie badania dotyczą kręgowców, zwłaszcza gryzoni. Ponieważ z eksperymentami na kręgowcach wiążą się coraz większe obawy natury etycznej, istnieje duże zapotrzebowanie na modele zastępowania bezkręgowców.

Tutaj przedstawiamy model doustnego podawania Galleria mellonella z wykorzystaniem komensalnych bakterii niepatogennych oraz możliwą ocenę potencjału immunogennego komensali na układ odpornościowy G. mellonella. Pokazujemy, że G. mellonella jest użytecznym alternatywnym modelem wymiany bezkręgowców, który umożliwia analizę komensalów o różnym potencjale immunogennym, takich jak Bacteroides vulgatus i Escherichia coli. Co ciekawe, bakterie nie wykazywały działania zabijającego na larwy, które są podobne do ssaków. Odpowiedzi immunologiczne G. mellonella były porównywalne z wrodzonymi odpowiedziami immunologicznymi kręgowców i obejmują rozpoznawanie bakterii i wytwarzanie cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Sugerujemy, że G. mellonella była w stanie przywrócić poprzednią równowagę mikrobioty, która jest dobrze znana u zdrowych osobników ssaków. Chociaż zapewnia porównywalną wrodzoną odpowiedź immunologiczną zarówno u G. mellonella, jak i kręgowców, G. mellonella nie posiada adaptacyjnego układu odpornościowego. Ponieważ badane składniki wrodzonego układu odpornościowego są ewolucyjnie konserwatywne, model umożliwia wstępne badanie przesiewowe i pierwszą analizę właściwości immunogennych bakterii.

Wprowadzenie

Mikrobiom jelitowy jest niezbędnym elementem do utrzymania homeostazy i obejmuje zarówno wrodzoną, jak i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną1,2. Społeczność mikrobioty komensalnej charakteryzuje się różnymi głównymi składnikami komensalnymi: symbiontami, które nadają korzystne działanie dzięki ważnym funkcjom immunomodulującym, oraz patobiontami, które mogą mieć szkodliwy wpływ na genetycznie predysponowanych gospodarzy oraz promować i wywoływać zapalenie jelit3,4. Opublikowano wiele badań nad symbiontami i patobiontami oraz ich wpływem na układ odpornościowy gospodarza, głównie poświęconych adaptacyjnym odpowiedziom immunologicznym.

Ponieważ te badania obejmują wiele zwierząt do badań, a ochrona i zastępowanie zwierząt wykorzystywanych do eksperymentów jest coraz bardziej interesujące dla społeczeństwa, staramy się znaleźć model zastępczy, który pozwoliłby na badanie przesiewowe różnych właściwości immunogennych bakterii. Owady, zwłaszcza Galleria mellonella, są szeroko stosowanym modelem zastępczym w badaniach nad infekcjami. G. mellonella łączy w sobie różne zalety, takie jak niskie koszty i wysoka przepustowość; Umożliwia doustne podawanie bakterii, co jest naturalną drogą narażenia, i pozwala na infekcję ogólnoustrojową5,6. G. mellonella umożliwia ponadto inkubację w temperaturze 37 °C, która jest fizjologiczną temperaturą ciała ssaków i optymalną ekspresją czynnika wirulencji bakterii5. Główną zaletą G. mellonella jest konserwatywny wrodzony układ odpornościowy, który umożliwia odróżnienie siebie od nie-siebie i koduje różne receptory rozpoznawania wzorców, takie jak apolipoforyna lub opsonina hemolin6,7. Po rozpoznaniu drobnoustroju G. mellonella może wywołać różne humoralne odpowiedzi immunologiczne. Może indukować reakcje na stres oksydacyjny i wydzielać reaktywne formy tlenu (ROS), które obejmują aktywność NOS (syntazy oksydazy azotowej) i NOX (oksydazy NADPH)6,8. Ponadto G. mellonella aktywuje silną odpowiedź peptydu przeciwdrobnoustrojowego (AMP), która powoduje wydzielanie mieszaniny różnych AMP, takich jak gloverin, morycyna, cekropina lub defensynopodobna gallerimycyna6,8,9,10. Ogólnie rzecz biorąc, AMP mają dość szeroką specyficzność gospodarza wobec bakterii i grzybów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych i muszą zapewnić silną odpowiedź, ponieważ owady nie mają żadnej odpowiedzi adaptacyjnej10. Gloverin jest AMP aktywnym przeciwko bakteriom i grzybom oraz hamuje tworzenie się błony zewnętrznej6,11. Morycyny wykazują swoją funkcję przeciwdrobnoustrojową wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, przenikając przez błonę i tworząc pore9,11. Cekrowiny zapewniają aktywność przeciwko bakteriom i grzybom oraz przenikają błonę podobnie jak morycyny9,10. Gallerimycyna jest peptydem podobnym do defensyny o właściwościach przeciwgrzybiczych9. Co ciekawe, stwierdzono, że połączenie cekropiny i gallerimycyny miało synergistyczne działanie przeciwko E. coli10.

Ze względu na ich łatwy w użyciu charakter, larwy G. mellonella są często używanym modelem infekcji do oceny patogenności bakteryjnej. W szczególności badania, w których dane uzyskane z G. mellonella korelują z danymi uzyskanymi od myszy, potwierdzają siłę tego alternatywnego modelu gospodarza. Stwierdzono, że najbardziej patogenne serotypy Listeria monocytogenes w modelu zakażenia myszy prowadzą również do wyższej śmiertelności G. mellonella po zakażeniu ogólnoustrojowym. Co więcej, mniej zjadliwe serotypy okazały się również mniej zjadliwe w modelu G. mellonella12. Podobne obserwacje poczyniono w odniesieniu do grzybów chorobotwórczych dla ludzi Candida albicans. Zjadliwość różnych szczepów C. albicans oceniano na podstawie zakażenia ogólnoustrojowego, a następnie monitorowania przeżywalności larw. Szczepy myszy były również awirulentne lub wykazywały zmniejszoną zjadliwość u G. mellonella, podczas gdy zjadliwe szczepy myszy prowadziły również do wysokiej śmiertelności larw13. Model G. mellonella może być następnie wykorzystany do identyfikacji czynników patogenności układu wydzielniczego typu 3 Pseudomonas aeruginosa14.

Ponieważ większość badań z udziałem G. mellonella skupiała się na czynnikach wirulencji przy użyciu podejścia do infekcji ogólnoustrojowej, byliśmy szczególnie zainteresowani dostarczeniem metody odpowiedniej do analizy komensalów jelitowych w doustnym modelu siłowym, w którym możemy zastosować odrębną dawkę bakterii na larwy i nie tylko obserwować śmiertelność larw, ale analizować różne cechy charakterystyczne wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w celu utrzymania homeostazy jelit.

Nasza metoda pomaga zwiększyć wykorzystanie G. mellonella jako modelu zastępczego, ponieważ łączymy zastosowanie bakterii i analizę ekspresji RNA. Użyteczne jest nie tylko wzmocnienie znaczenia badań patogenezy bakteryjnej, gdy obejmuje to analizę odpowiedzi immunologicznej po podaniu doustnym, ale nie tylko obserwację śmiertelności po zakażeniu ogólnoustrojowym. Nasze metody pozwalają na analizę właściwości immunogennych komensalów bakteryjnych niepatogennych, ponieważ zapewniają one bardziej złożone warunki niż hodowla komórkowa, oferując barierę jelitową w żywym organizmie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla G. mellonella i przygotowanie larw do doświadczeń

UWAGA: Cykl od jaja do ostatniego stadium larwalnego trwa około 5-6 tygodni.

  1. Przenieś jaja złożone przez dorosłe ćmy do pojemników o pojemności 2 L zawierających podłoże dla moli woskowych (22% kaszy kukurydzianej, 22% mąki pszennej, 17,5% wosku pszczelego, 11% odtłuszczonego mleka w proszku, 11% miodu, 11% glicerolu, 5,5% suszonych drożdży). Cały proces hodowli prowadź w temperaturze 30 °C w ciemności.
  2. Przenieś 25 g podłoża zawierającego larwy do świeżego podłoża po około 1-2 tygodniach, gdy widoczne będą małe i bardzo małe larwy. Po 2 tygodniach zsynchronizuj larwy według ich wielkości i utrzymuj grupy po 30-40 larw w pojemnikach o pojemności 2 L na podłożu dla moli woskowych przez kolejne 2 tygodnie.
  3. Wybierz larwy do eksperymentów na podstawie ich masy. Używaj wyłącznie jasnych i szybko poruszających się larw o masie 180-200 mg.

2. Hodowla i przygotowanie Bacteroides vulgatus oraz Escherichia coli do podania doustnego

  1. Hodować beztlenowiec obligatoryjny Bacteroides vulgatus mpk w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych, wykorzystując słoje i saszetki do tworzenia atmosfery beztlenowej (patrz Tabela materiałów)15,16. Inkubować B. vulgatus przez 2 dni, a następnie przygotować subkulturę nocną w bulionie BHI (brain heart infusion).
  2. Hodować bakterię beztlenowca fakultatywnego Escherichia coli mpk w warunkach tlenowych w bulionie LB (Luria-Bertani) w temperaturze 37 °C. Inkubować E. coli nocnie w bulionie LB, a w dniu eksperymentu hodować subkulturę przez 2 h w temperaturze 37 °C.
  3. Zebrać kultury poprzez wirowanie przy 1,700 x g przez 5 min. Resuspendować osady bakteryjne w DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline). Wyznaczyć gęstość optyczną (OD) kultur bakteryjnych przy OD 600 nm i obliczyć stężenia bakterii. Stężenia bakterii dostosowano do poziomu 109/mL.

3. Przymusowe karmienie larw G. mellonella zawiesinami bakteryjnymi

  1. Każdą larwę poddać wymuszonemu karmieniu, podając 10 µL skorygowanej zawiesiny bakteryjnej zawierającej 107 bakterii na dawkę. Do doustnego podania zawiesiny bakteryjnej należy użyć strzykawki insulinowej z igłą o tępym zakończeniu.
    1. Strzykawkę należy zamocować w pompce do mikroszyderki (Rycina 1), aby zapewnić dokładność objętości zawiesiny podawanej każdej larwie (patrz Tabela materiałów). Igłę strzykawki należy ostrożnie wsunąć między żuwaczki. Nie należy forsować strzykawki między żuwaczkami. Należy odczekać, aż larwy otworzą aparat gębowy, a następnie wsunąć strzykawkę.
  2. Larwy po wymuszonym karmieniu inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez okres od 1 do 24 h. Larwy, którym podano DPBS, należy wykorzystać jako kontrole pozorowane (mock), aby wykluczyć potencjalne reakcje stresowe wywołane manipulacją larwami podczas wymuszonego karmienia.

4. Obróbka larw poddanych podaniu doustnemu i izolacja RNA

  1. Pracować pod wyciągiem i nosić okulary ochronne. Oczyścić wyciąg i spryskać go odczynnikiem zapobiegającym kontaminacji RNazami.
    1. Żywe larwy po inkubacji zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie, a następnie zhomogenizować. Do homogenizacji użyć moździerza z tłuczkiem. Dodać ciekły azot do moździerza i ucierać każdą larwę do uzyskania homogenatu w formie proszku.
    2. Przesypać homogenat do jednorazowej łódki ważnej i odczekać do odparowania ciekłego azotu.
  2. Zamrożone sproszkowane homogenaty (pozbawione ciekłego azotu) wymieszać z 1 mL Trizol w probówce o pojemności 2 mL i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  3. Odwirować mieszaninę przy 8,000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej, przenieść nadsącz do nowej probówki, a osad odrzucić. Wymieszać nadsącz z 200 µL 1-bromo-3-chloropropanu (BCP). Wymieszać w wortexie i inkubować mieszaninę przez 5 min w temperaturze pokojowej oraz przez 10 min na lodzie.
  4. Odwirować reakcje z dodatkiem BCP przy 18,000 x g przez 15 min w 4 °C. Przenieść górną przezroczystą warstwę do nowej probówki 2 mL, a resztę odrzucić. Wytrącić RNA z przeniesionej górnej warstwy za pomocą 500 µL izopropanolu poprzez mieszanie i odwracanie probówki przez 5 min.
  5. Odwirować probówkę przy 18,000 x g przez 15 min w 4 °C. Przemyć wytrącony osad RNA 500 µL 75% etanolu.
  6. Suszyć osad RNA przez 5-10 min w temperaturze pokojowej. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, gdyż utrudni to jego późniejsze rozpuszczenie.
  7. Rozcieńczyć inhibitor rybonukleazy (1:100) w wodzie wolnej od nukleaz i użyć 100 µL tego roztworu do resuspensji wysuszonego osadu RNA. Ostrożnie wymieszać probówkę w wortexie aż do całkowitego rozpuszczenia osadu.
  8. Zmierzyć jakość i ilość RNA. Upewnić się, że stosunek 260/280 wynosi około 2,0, a stosunek 260/230 mieści się w zakresie 2,0-2,2 (patrz Tabela materiałów).
  9. Użyć 5 µg wyizolowanego RNA do trawienia DNazą. Wymieszać 5 µL buforu 10x, 1 µL enzymu inhibitora rybonukleazy, 2 µL enzymu DNazy, 5 µg RNA i dopełnić wodą wolną od nukleaz do objętości 50 µL. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    1. Dodać 6 µL odczynnika inaktywującego i inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej, okresowo mieszając w wortexie. Odwirować reakcję przy 10,000 x g przez 1 min. Przenieść nadsącz do nowej probówki 1,5 mL.
      UWAGA: RNA zawiera zarówno RNA larwalne, jak i RNA bakterii odpowiedniego szczepu użytego do podania doustnego.

5. Ilościowe oznaczenie liczby kopii bakteryjnego genu 16S po wymuszonym karmieniu

UWAGA: Liczbę kopii wykazanej bakteryjnej 16S określono przy użyciu cDNA syntetyzowanego z RNA wyekstrahowanego w sekcji 4. Końcową kwantyfikację obliczono przy pomocy krzywej wzorcowej plazmidu, w którym sklonowano fragment PCR 16S B. vulgatus lub E. coli.

  1. Przygotowanie standardów plazmidowych
    1. Amplifikuj fragmenty 16S z E. coli mpk lub B. vulgatus genomic DNA mpk metodą PCR. Wymieszać 10 µL buforu 5x, 1 µL roztworu dNTP o stężeniu 10 mM, 2.5 µL z 10 µM starter forward i 2.5 µL z 10 µM rozcieńczenie startera odwrotnego, 1 µL DMSO, 1 µL matrycy genomowego DNA, 31.5 µL wody wolnej od nukleaz i 0.5 µL enzymu korygującego.
    2. Przeprowadź reakcję PCR (denaturacja wstępna: 98 °C przez 30 s, denaturacja: 98 °C przez 10 s, przyłączanie: 60 °C przez 30 s, elongacja: 72 °C przez 30 s, końcowa elongacja: 72 °C przez 5 min, powtórzyć denaturację, przyłączanie starterów i elongację przez 30 cykli).
      1. Stosuj 16S E. coli startery (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) lub 16S B. vulgatus startery (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) do amplifikacji.
    3. Użyj E. coli i B. vulgatus Fragmenty PCR 16S do klonowania tępokońcowego do wektora klonującego. Przygotowanie ligacji i mieszania 10 µL buforu 2x, 1 µL nieoczyszczonego produktu PCR, 1 µL plazmidu do klonowania tępokrawędzistego, 7 µL wody wolnej od nukleaz i 1 µL ligazy DNA T4. Inkubować reakcję ligacji przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    4. Przygotuj E. coli Komórki kompetentne DH5α.
      1. Zaszczep 100 ml pożywki LB w kolbie Erlenmeyera, dodając 1 ml kultury nocnej. Hoduj kulturę do momentu, gdy wartość OD 600 nm wyniesie od 0,4 do 0,6. Rozdziel otrzymaną kulturę do dwóch probówek o pojemności 50 ml i inkubuj kultury na lodzie przez 10 min.
      2. Wirować kultury przy 1700 x g przez 10 min w temperaturze 4 °COdrzuć nadsącz i ostrożnie resuspenduj każdy osad w 5 ml roztworu RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, dostosować pH do 5,8 za pomocą kwasu octowego lodowaczego, przefiltrować sterylnie). Każdą probówkę uzupełnić dodatkowymi 45 ml roztworu RFI.
      3. Wiruj kultury z prędkością 1700 x g przez 10 min w temperaturze 4 °COdrzucić nadsącz i ostrożnie resuspendować każdy osad w 6 ml buforu RFII (10 mM MOPS, 15 mM CaCl2).2, 10 mM KCl, 15% glicerolu, autoklawowany) roztwór. Połączyć obie frakcje i inkubować 12 ml zawiesiny na lodzie przez 15 min. Przygotować alikwoty zawiesiny komórkowej (200 µL). Przechowywać alikwoty w temperaturze -80 °C.
    5. Przenieś reakcję ligacji do jednej porcji komórek kompetentnych E. coli komórki DH5α i pozostawić reakcję w lodzie na 15 min. Poddać komórki szokowi termicznemu przez 45 s w temperaturze 42 °C i dodać 1 ml pożywki LB.
      1. Inkubować transformację przez 45 min w temperaturze 37 °CDodaj 100 µL transformatów na płytkę z agarem LB zawierającą ampicylinę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    6. Przeprowadź koloniową PCR dla 8 otrzymanych transformantów z płytki z agarem LB z etapu 5.1.5. Pobierz każdą kolonię za pomocą wykałaczką, przenieś ją na nową płytkę LB z ampicyliną (płytka matka), a następnie zanurz tę samą wykałaczkę w dołku zawierającym 5.5 µL wody wolnej od nukleaz w pasku do PCR.
      1. Dodaj 7.5 µL mieszanki PCR 2x, 0.5 µL z 10 µM starter bezpośredni i 0.5 µL z 10 µM rozcieńczanie startera odwrotnego. Należy użyć tych samych par starterów, o których wspomniano w sekcji 5.1.1.
      2. Przeprowadź reakcję PCR (denaturacja początkowa: 95 °C przez 5 min, denaturacja: 95 °C przez 1 min, wyżarzanie: 60 °C przez 30 s, elongacja: 72 °C przez 1 min, końcowa elongacja: 72 °C przez 7 min, powtórzyć denaturację, przyłączanie starterów i elongację przez 35 cykli).
    7. Zweryfikuj wielkość fragmentów 16S na 1% żelu agarozowym. Użyj 0,5x buforu Tris-Borat-EDTA (TBE) do rozpuszczenia 1 g agarozy i zagotuj go w kuchence mikrofalowej. Do żelu dodaj barwnik w stosunku 1:50 000 i wlej go do formy. Do zagłębień żelu nanieś reakcje colony PCR oraz drabinę DNA 100 bp, a następnie prowadź elektroforezę przez 45 min przy napięciu 110 V.
    8. Zaszczep kulturę nocną w 5 ml pożywki LB z dodatkiem ampicyliny jednym klonem z płytki matki (sekcja 5.1.6) dla każdego E. coli i B. vulgatus plazmid 16S zawierający wstawkę o prawidłowej wielkości.
      1. Odwiruj nocne hodowle bakterii w probówce o pojemności 2 ml przy 1700 x gOdrzucić nadsącz i resuspender osad w 600 µL woda sterylna
      2. Dodaj 100 µL buforu lizującego i wymieszać, odwracając probówkę 6 razy. Dodać 350 µL zimna (4°C) roztwór neutralizujący i wymieszać dokładnie, odwracając probówkę.
      3. Wirować z maksymalną prędkością w wirówce przez 3 min. Przenieść nadsącz (~900 µL) do kolumny wirowej i odwirować z maksymalną prędkością w wirówce przez 15 s.
      4. Odrzucić frakcję niezatrzymaną i dodać 200 µL po przemyciu w celu usunięcia endotoksyn odwiruj z maksymalną prędkością w wirówce przez 15 s.
      5. Dodaj 400 µL roztworu piorącego do kolumny i wiruj z maksymalną prędkością w wirówce przez 30 s. Przenieś kolumnę do czystej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 µL dodaj bufor elucyjny do kolumny i inkubuj przez 1 min w temperaturze pokojowej.
      6. Wirować z maksymalną prędkością w wirówce przez 30 s (patrz Tabela materiałów).
    9. Oznaczenie stężenia plazmidowego DNA metodą mieszania 1 µL plazmidowego DNA za pomocą 199 µL roztworu roboczego (1 µL barwnika fluorescencyjnego na 199 µL buforu dla każdej reakcji). Przygotować dwa standardy poprzez zmieszanie 10 µL standardu 1 lub 10 µL standardu 2 z 190 µLWymieszać próbki oraz standardy na wirówce typu vortex, a następnie inkubować reakcję przez 2 min. Zmierzyć stężenie (patrz Tabela materiałów).
    10. Przygotuj standardowe stężenia w 10-krotnych rozcieńczeniach szeregowych w zakresie od 10 do 100 000 kopii: oblicz masę pojedynczego plazmidu (m = (n) x (1,096x10-21 g/pb), gdzie n = wielkość plazmidu, m = masa). Oblicz masę DNA plazmidowego niezbędną do uzyskania pożądanej liczby kopii (pożądana liczba kopii x masa pojedynczego plazmidu = potrzebna masa DNA plazmidowego).
  2. Przygotowanie próbek do ilościowego oznaczenia
    1. Synteza cDNA. Wymieszać 2 µL buforu 7x, 1 µL RNA trawionego DNazą z sekcji 4 oraz 11 µL wody wolnej od nukleaz. Inkubować przez 2 min w temperaturze 42 °C.
      1. Natychmiast umieścić reakcję w lodzie. Wymieszać. 4 µL buforu RT 5x, 1 µL mieszaniny starterów do RT (odwrotnej transkryptazy), 1 µL enzymu RT oraz mieszaniny reakcyjnej z etapu 5.2.1. Inkubować przez 15 min w temperaturze 42 °CInkubować przez 3 min w temperaturze 95°C w celu inaktywacji enzymu RT.
    2. Ilościowo określ stężenia cDNA fluorometrycznie, zgodnie z opisem w kroku 5.1.9.
  3. Pomiar ładunku bakteryjnego
    1. Dostosować stężenia cDNA do 5 ng na 12 µL reakcja dla ilościowej PCR. Wymieszać 2x RT-PCR mix, 0.25 µL z 100 µM starter forward, 0.25 µL z 100 µM starter odwrotny (5.1.1) i 12 µL skorygowanego cDNA. Przeprowadzić qPCR (denaturacja wstępna: 95 °C przez 5 min, denaturacja: 95 °C przez 10 s, hybrydyzacja: 60 °C przez 30 s, powtórzyć denaturację i przyłączanie dla 35 cykli, topnienie: 95 °C, schłodzić do 4 °C).
    2. Dziennik wykresu10 stężenia krzywej wzorcowej plazmidu (10–100 000 kopii), t.j. 1–5 (oś X), w zestawieniu z odpowiadającymi im wartościami ct (oś Y). Przeprowadź regresję liniową w celu uzyskania równania regresji. Wyznacz z równania wartość x (stężenie). Użyj wzoru do obliczenia wartości log10 liczby kopii poprzez podstawienie wartości ct do wzoru. Oblicz antylogarytm, aby uzyskać liczby kopii.

6. Oznaczanie genów markerów odporności wrodzonej za pomocą ilościowej RT-PCR

  1. Sprawdzić swoistość genową starterów za pomocą PCR i następującej po nim elektroforezy w żelu agarozowym w celu weryfikacji poprawnego rozmiaru fragmentu. Przeprowadzić PCR zgodnie z opisem w sekcji 5.1.5.
    Ubiquitin 130 bp: forward TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, reverse CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (gen referencyjny)
    Nox-4 159 bp: forward TGGCACGGCATCAGTTATCA, reverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
    Nos 76 bp: forward ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, reverse GCCATTTTACAATCGCCACAA8
    Gst 156 bp: forward GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, reverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
    ApoIII 265 bp: forward AGACTTGCACGCCATCAAGA, reverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
    hemolin 267 bp: forward CTCCCTCACGGAGGACAAAC, reverse GCCACGCACATGTATTCACC8
    gallerimycin 161 bp: forward GAAGTCTACAGAATCACACGA, reverse ATCGAAGACATTGACATCCA8
    cecropin 158 bp: forward CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, reverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
    gloverin 101 bp: forward GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, reverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
    moricin 124 bp: forward GCTGTACTCGCTGCACTGAT, reverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT8)
  2. Ocenić wydajność starterów, aby uzyskać E=2.
    1. Połączyć 2 µL z 5-10 różnych próbek pozytywnych (tj. próbek wykazujących ekspresję genu, dla którego badana jest para starterów).
    2. Przygotować serię rozcieńczeń 1:5 z połączonych próbek: standard 1 (S1): nieobalczona mieszanina; S2: 2 µL S1 + 8 µL wody wolnej od nukleaz; S3: 2 µL S2 + 8 µL wody wolnej od nukleaz; S4: 2 µL S3 + 8 µL wody wolnej od nukleaz.
    3. Nanieść 1 µL z S1-S4 oraz kontrolę bez matrycy (woda wolna od nukleaz) na płytkę qPCR 96-dołkową. Do każdego dołka dodać 5 µL master mixu do RT, 0,1 µL każdego startera forward i reverse o stężeniu 100 µM, 3,7 µL wody wolnej od nukleaz oraz 0,1 µL mieszaniny RT.
    4. Przeprowadzić ilościową RT-PCR (odpisanie zwrotne: 50 °C przez 10 min, wstępna denaturacja: 95 °C przez 5 min, denaturacja: 95 °C przez 10 s, przyłączanie: 60 °C przez 30 s, powtórzyć denaturację i przyłączanie przez 40 cykli, topnienie: 95 °C, chłodzenie do 4 °C).
    5. Wykreślić log10 jednostek względnych dla S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (oś x) względem odpowiadających im wartości ct (oś y). Przeprowadzić regresję liniową i wyznaczyć nachylenie krzywej wzorcowej. Obliczyć wydajność E: E= 10-(1/slope).20
      UWAGA: Nachylenie wynoszące -3,32 wskazuje na idealne warunki reakcji i wydajność starterów E=2,00. Oznacza to, że ilość produktu PCR podwaja się w każdym cyklu.
  3. Użyć 100 ng przetrawionego RNA (100 ng/µL) jako matrycy do RT-PCR. Wymieszać odczynniki do RT-PCR i przeprowadzić RT-PCR zgodnie z opisem w sekcji 6.2. Przebadać wszystkie próbki podane z bakteriami oraz DPBS, używając zarówno pary starterów referencyjnych, jak i par starterów docelowych. Aby wyznaczyć wydajność, zawsze nanosić rozcieńczenia S1-S4 z parą starterów referencyjnych oraz S1-S4 z parą starterów docelowych na tę samą płytkę.
  4. Obliczyć stosunek (R) ekspresji genu RNA zgodnie z poniższym wzorem, wykorzystując eksperymentalnie wyznaczoną wydajność starterów dla pary referencyjnej i pary docelowej. Znormalizować próbki stymulowane bakteriami względem kontroli mock20.
    Wzór ilościowego qPCR; równanie do analizy ekspresji genu; metoda obliczania ΔCт.
    R: stosunek
    Etarget: wydajność S1-4 zmierzona parą starterów docelowych
    Ehousekeeping: wydajność S1-4 zmierzona parą starterów referencyjnych
    Δcttarget(kontrolna-próbka): Δct z (ct próbki podanej z DPBS)-(ct próbki podanej z bakteriami) zmierzone parą starterów docelowych
    Δcthousekeeping(kontrolna-próbka): Δct z (ct próbki podanej z DPBS)-(ct próbki podanej z bakteriami) zmierzone parą starterów referencyjnych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model infekcji hemolimfy G. mellonella jest szeroko stosowany do analizy czynników wirulencji ogromnej liczby patogenów. Większość pomiarów obejmuje analizę śmiertelności larw, co jest metodą dość prostą. Niemniej jednak metoda ta nie pozwala na wyciąganie wniosków dotyczących odpowiedzi immunologicznych w ogóle ani na powiązanie wyników odpowiedzi immunologicznych G. mellonella z mechanizmami odpornościowymi kręgowców. Z kolei model podania doustnego u G. mellonella...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model G. mellonella jest często stosowanym modelem do oceny czynników wirulencji bakteryjnej w podejściu do infekcji ogólnoustrojowej21. Ponieważ wiele patogenów i bakterii dostaje się do organizmu gospodarza drogą kolonizacji doustnej lub infekcji, konieczne jest znalezienie nowych informacji, aby ocenić G. mellonella jako model kolonizacji i infekcji jamy ustnej.

Możliwość hodowli G. mellonella w temperaturze 15-37 °C jest wielką zaletą, pon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez DFG (SPP1656), grupę szkoleniową DFG 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) oraz Niemieckie Centrum Badań nad Infekcjami (DZIF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 mlEppendorf0030120086
100 pz drabinka DNA Thermo Fisher Scientific15628019
1-bromo-3-chloropropan (BCP)Sigma-AldrichB9673
2 ml probówkiEppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033Colony PCR
50 ml probówkiGreiner Bio-One210 261
AgarozaBiozym840004
Wosk pszczeliMixed-Store.de -
Bulion do infuzji serca mózguThermo Fisher ScientificCM1135
Zestaw do klonowania CloneJET PCRThermo Fisher ScientificK1232Wektor klonowania dla fragmentów 16S
Kasza kukurydzianaOstermü hle Naturkost GmbH306Uprawa ekologiczna
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
Zestaw do usuwania DNA bez DNA Thermo Fisher Naukowy244510  Trawienie dnazy
Suszone drożdżeRoszpunka -Uprawa ekologiczna
Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Thermo Fisher Scientific14040
EtanolVWR20821.330
GlicerolSigma-AldrichW252506
MiódOstermü hle Naturkost GmbH487
Izopropanol VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IISystemy molekularne Roche 5015278001
LightCycler 480 Płytka wielodołkowa 96, białaMolecular Systems4729692001
ręczna pompa mikrostrzykawkowa z cyfrowym wyświetlaczem WorldPrecision InstrumentsStrzykawka insulinowa DMP
Micro-Fine+ U-100 0,3 x 8 mmBecton Dickinson324826Podawanie doustne
Zaprawa nieszkliwionaVWR410-9327 
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
Woda wolna od nukleaz Saszetki Thermo Fisher Scientific10977035
Oxoid AnaeroGen Thermo Fisher ScientificAN0025AJakość i ilość
pasków RNA PCRBiozym710970
Tłuczek, nieszkliwiona powierzchnia szlifierskaVWR410-9324 
Enzym do korekty tekstu Phusion Thermo Fisher ScientificF553S
PrimersBiomers -
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit Qiagen204056qPCR do pomiaru liczby kopii bakteryjnych
Zestaw QuantiFast SYBR Green RT-PCR Qiagen204156qRT-PCR do pomiarów ekspresji genów
Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTect Qiagen205311synteza cDNA
Probówki do oznaczania kubitówThermo Fisher ScientificQ32856
Zestaw DNA Qubit dsHS Thermo Fisher ScientificQ32851Kwantyfikacja próbek plazmidu i cDNA
Fluorometr QubitThermo Fisher ScientificQ33226Kwantyfikacja próbek plazmidu i cDNA
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Inhibitor rybonukleazy rnazynyPromegaN2511
Odtłuszczone mleko w proszkuSucofin -
SYBR bezpieczny żel DNA StainThermo Fisher ScientificS33102
TRI Sigma-AldrichT9424
Łódka wagowaVWR10803-148
Mączka pszennaOstermü hle Naturkost GmbH6462Uprawa ekologiczna
Roche

Bibliografia

  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310(2012).
  3. Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
  4. Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
  5. Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
  6. Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
  7. Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459(2014).
  8. Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
  9. Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
  10. Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
  11. Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
  12. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
  13. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
  14. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  15. Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
  16. Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
  17. Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788(2013).
  18. Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
  19. Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
  20. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  21. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).
  22. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bakterie komensalnewrodzona odpowiedź immunologicznaekstrakcja RNAanaliza ekspresji genóweliminacja bakteriiaktywacja markerów immunologicznychpeptydy przeciwdrobnoustrojowereaktywne formy tlenu
Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.