Pomiar poziomu stresu biofizycznego i psychicznego po wizycie w trzech miejscach o różnym poziomie natury

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest zidentyfikowanie zmian w poziomie stresu po wizycie w trzech różnych miejscach i opisanie metod stosowanych do identyfikacji poziomów stresu na podstawie pomiarów kortyzolu w ślinie, α-amylazy i psychologicznego narzędzia do samoopisu.

Streszczenie

Wizyta w naturalnym środowisku wiąże się z redukcją stresu psychicznego. Chociaż większość badań związanych ze stresem opiera się na formatach samoopisowych, coraz więcej badań obejmuje obecnie biologiczne hormony i katalizatory związane ze stresem, takie jak kortyzol i α-amylaza, do pomiaru poziomu stresu. Przedstawiono tutaj protokół mający na celu zbadanie wpływu na poziom stresu biofizycznego i psychicznego po wizycie w trzech różnych miejscach o różnym poziomie natury. Poziomy stresu biofizycznego i psychicznego są mierzone natychmiast po wejściu do wybranych lokalizacji i tuż przed opuszczeniem terenu przez odwiedzających. Stosując metodę "śliny", miara biofizyczna składa się z 1-2 ml próbek śliny dostarczonych przez uczestników badania po wejściu do jednego z trzech miejsc badania. Zgodnie z zaleceniami istniejącej literatury, ślina jest pobierana w ciągu 45 minut od zakończenia zaangażowania odwiedzającego w dane miejsce. Po pobraniu śliny próbki są znakowane i transportowane do laboratorium biologicznego. Kortyzol jest zmienną biofizyczną będącą przedmiotem zainteresowania w tym badaniu i mierzoną za pomocą procesu ELISA z czytnikiem płytek TECAN. Aby zmierzyć stres zgłaszany przez samych siebie, stosuje się Kwestionariusz Postrzeganego Stresu (PSQ), który informuje o poziomie zmartwień, napięcia, radości i postrzeganych wymagań. Dane są zbierane we wszystkich trzech lokalizacjach od późnego popołudnia do wczesnego wieczora. W porównaniu we wszystkich trzech ustawieniach, poziom stresu, mierzony zarówno za pomocą markerów biologicznych, jak i raportów własnych, jest znacznie niższy po wizycie w najbardziej naturalnym otoczeniu.

Wprowadzenie

Podwyższony poziom stresu od dawna wiąże się z wieloma poważnymi schorzeniami, takimi jak choroby serca, otyłość i zaburzenia psychiczne^1,2,3. Coraz więcej badań sugeruje, że bliskie sąsiedztwo lub odwiedziny w naturalnym otoczeniu, takim jak park i niezagospodarowane krajobrazy, może mieć niezwykły wpływ na samopoczucie psychiczne i zmniejszenie poziomu stresu1^{,4,5,6,7,8,9,10}. Wyjaśnienia dotyczące wpływu naturalnych ustawień i poziomów stresu są następujące: (1) naturalne warunki zapewniają miejsca do aktywności fizycznej8^,11 i (2) odwiedzający naturalne środowisko mają zdolność do skupienia się na bardziej niezwiązanych z zadaniami procesach myślowych, co prowadzi do zmniejszenia zmęczenia uwagi¹². Aby określić wpływ natury na redukcję stresu, w badaniu wykorzystano samoopis stresu psychologicznego (PSQ) i dwa biomarkery oparte na ślinie, kortyzol i α-amylazę, po wizycie w trzech różnych miejscach rekreacyjnych. Lokalizacje te różnią się między sobą poziomem "naturalności" i obejmują otoczenie typu dzikiej przyrody, park miejski oraz lokalny obiekt fitness i rekreacyjny.

To badanie ma na celu odpowiedź na następujące pytania badawcze: (RQ₁) Czy istnieją różnice w poziomach stresu biofizycznego mierzonego za pomocą kortyzolu w ślinie i α-amylazy w porównaniu we wszystkich trzech miejscach (tj. naturalny, półnaturalny, zbudowany)? (RQ₂) Czy istnieją różnice w poziomach stresu psychicznego mierzonego przez PSQ (przejawiającego się w czterech konstruktach: wymaganiach, zmartwieniach, napięciu i radości) w porównaniu we wszystkich trzech miejscach (tj. naturalny, półnaturalny, zbudowany)?

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami i wytycznymi Programu Ochrony Badań z Udziałem Ludzi (Human Research Protection Program) Komisji Bioetycznej (Institutional Review Board) Uniwersytetu w Indianie.

1. Wybór lokalizacji

1. Wybierz liczbę obszarów (n) w oparciu o różne poziomy kontaktu z naturą.
   UWAGA: W naszej pracy wybraliśmy trzy obszary. Stosując kontinuum oparte na poziomach „naturalności”, obszar A uznano za najbardziej naturalny; obejmuje on około 1 200 akrów zalesionych grzbietów graniczących z jeziorem, położonych wewnątrz lasu liściastego. Najczęstsze aktywności to spacery i obserwacja dzikiej przyrody. Obszar B stanowił miejski park o powierzchni 33 akrów, wyposażony w ścieżki spacerowe, miejsca spotkań, place zabaw oraz otwarte przestrzenie polne do swobodnych działań rekreacyjnych. Obszar C był miejskim, krytym obiektem do ćwiczeń, charakteryzującym się najniższym poziomem naturalności. Wszystkie trzy obszary znajdują się w stosunkowo bliskiej odległości od średniej wielkości miasta (szacowana liczba mieszkańców: 46 000 osób) w środkowo-zachodniej części Stanów Zjednoczonych.

2. Przesiew i przygotowanie uczestników

1. Zakończ rekrutację uczestników przed rozpoczęciem przez badanych doświadczeń rekreacyjnych.
   UWAGA: W przypadku lokalizacji A i B badani zostali zaproszeni do udziału przez badacza na parkingu przy wejściu do parku. W lokalizacji C badani zostali zaproszeni przy recepcji krytej hali sportowej. Aby kontrolować różnice w rodzaju aktywności, osoby zrekrutowane w lokalizacjach A i B zajmowały się głównie wędrówkami pieszymi, natomiast w lokalizacji C główną aktywnością był bieg lub marsz po krytej bieżni.
2. Podczas rekrutacji przypomnij badanym o przestrzeganiu wytycznych dotyczących pobierania próbek kortyzolu z śliny. Nie mogą oni jeść ani pić na 10 min przed pobraniem próbki śliny.
   UWAGA: Należy zauważyć, że w tym przypadku próbki śliny nie były normalizowane pod kątem objętości ani rozcieńczenia (stężenia) – tzn. czy uczestnicy byli odpowiednio nawodnieni i/lub czy stopień nawodnienia zmienił się między pobraniami próbek.
3. Wręcz każdemu uczestnikowi czerwoną opaskę na ramię (lub równoważny, rzucający się w oczy element ubioru), aby umożliwić łatwą identyfikację po zakończeniu aktywności.
4. Wyznacz przedział czasowy od 30-40 min, tak aby wszyscy badani we wszystkich trzech lokalizacjach spędzili podobną ilość czasu w każdej z nich. Wyklucz badanych, którzy spędzili znacznie więcej lub mniej czasu niż reszta grupy.
5. Zachowaj spójność rodzaju podejmowanej aktywności.
   UWAGA: W tym przypadku aktywnością o „umiarkowanej” intensywności był marsz lub wędrówka piesza. Z próby wykluczono osoby, których aktywność znacząco odbiegała od marszu lub wędrówki. Na przykład osoby łowiące ryby, piknikujące lub ćwiczące z ciężarami nie zostały włączone do odpowiednich grup.

3. Warunki i projekt eksperymentalny

1. Zastosuj quasi-eksperymentalny schemat badania z pomiarem przed i po interwencji.
2. Po zidentyfikowaniu uczestników i uzyskaniu ich zgody na udział, poproś każdą osobę o przeczytanie i podpisanie formularza IRB wyjaśniającego dobrowolność, cel oraz procedury badania.
3. Po zakończeniu tego procesu przydziel uczestnikom element garderoby (np. czerwoną opaskę na ramię) w celu przyszłej identyfikacji i wykonaj pomiary fizjologiczne oraz psychologiczne poziomu stresu (tj. PSQ, 1-2 mL śliny wyplutej lub wypływającej do probówki). Próbki należy pobierać od późnego popołudnia do wczesnego wieczoru.
   UWAGA: Dane te były zbierane przez badaczy zarówno 1) tuż przed wejściem uczestników na obszar badania, jak i 2) niezwłocznie po zakończeniu wizyty na tym obszarze.

4. Próbki śliny

1. Aby uniknąć rozcieńczenia próbek, poproś badanych, aby nie jedli, nie pili i nie płukali ust na 10 min przed pobraniem próbek śliny.
2. Poproś badanych o przekazanie próbek śliny o objętości 1-2 mL (z wyłączeniem piany) tuż przed doświadczeniem rekreacyjnym oraz niezwłocznie po jego zakończeniu.
3. Pobierz próbki śliny metodą pasywnego ślinienia:
   1. Przekaż badanym 2-calową plastikową słomkę do picia, aby mogli nalać ślinę do 2 mL krioprobówki (patrz Tabela materiałów).
   2. Poleć badanym, aby pozwolili ślinie zebrać się w ustach, a następnie spłynęła ona przez słomkę do krioprobówki. Zgodnie z Saliva Collection and Handling Advice (2011), 1 mL (z wyłączeniem piany) jest wystarczające dla większości testów.
   3. Oznacz próbki przypisanym 3-cyfrowym numerem ID (np. 001) oraz literą wskazującą czas pobrania danych (np. A oznacza przed testem, B oznacza po teście; gdzie 001A reprezentuje próbkę śliny przekazaną przez uczestnika 001 przed przeprowadzeniem doświadczenia rekreacyjnego).
   4. Po pobraniu i oznaczeniu próbki należy ją tymczasowo przechowywać w zamrożeniu w pudełku ze styropianu wypełnionym suchym lodem przez nie więcej niż 2 h.
   5. Przetransportuj oznaczone próbki do laboratorium i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu analizy.

5. Oznaczanie ilościowe α-amylazy

UWAGA: W tym teście α-amylaza hydrolizuje 2-chloro-p-nitrofenylo-α-D-maltotriozyd do 2-chloronitrofenolu i tworzy glukozę, 2-chloro-p-nitrofenylo-α-D-maltozyd, maltotriozę oraz glukozę. Reakcję monitoruje się przy absorbancji 405 nm, co odpowiada aktywności α-amylazy w próbce. Test ten wykazuje liniowość w zakresie od 0 do 2000 U/L.

1. Materiały
   1. Do ilościowego oznaczenia α-amylazy w próbkach śliny użyto zestawu odczynników do płynnego oznaczenia amylazy (patrz Tabela materiałów). Wszystkie odczynniki są dostarczane w formie gotowych do użycia roztworów i przechowywane w temperaturze 0-4 °C.
   2. Należy użyć czytnika wielofunkcyjnego (patrz Tabela materiałów) zdolnego do pomiaru gęstości optycznej przy 405 nm z kontrolą temperatury na poziomie 37 °C podczas analizy.
2. Analiza
   1. Próbki należy rozmrozić na lodzie przed analizą.
   2. Próbki należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 w 1x PBS (10 µL śliny + 90 µL PBS).
   3. Każdą próbkę należy analizować w dubletach.
   4. Odczynnik amylazy należy doprowadzić do temperatury 20-25 °C przez co najmniej 30 min.
   5. Do mikropłytki 96-dołkowej należy dodać 0,1 mL odczynnika amylazy dla każdej próbki.
   6. Mikropłytkę należy wstępnie inkubować w temperaturze 37 °C przez minimum 5 min.
   7. Do odczynnika amylazy należy dodać 2,5 µL próbki.
   8. Pierwszy pomiar należy wykonać po 60 s.
   9. Kolejne pomiary należy wykonywać co 60 s przez dodatkowe 2 min.
   10. Należy obliczyć średnią różnicę absorbancji na minutę (ΔAbs/min).
3. Obliczenia
   1. Aby obliczyć aktywność amylazy, należy zastosować następujący wzór:
      
      Gdzie ΔAbs/min = zmiana różnicy absorbancji na minutę; TV = całkowita objętość analizy (0,1025 mL); *1000 = przeliczenie U/mL na U/L; MMA = absorpcja molowa 2-chloro-p-nitrofenolu = 12,9; SV = objętość próbki (0,0025 mL); oraz LP = droga optyczna (1 cm). Po podstawieniu otrzymujemy:
      
      W związku z tym, należy pomnożyć wartość ΔAbs/min przez 3178 oraz przez czynnik rozcieńczenia (10), aby otrzymać stężenie amylazy w U/L.
   2. W przypadku próbek przekraczających 2000 U/L (liniowość analizy) należy je dodatkowo rozcieńczyć (co najmniej 2x w PBS) i ponownie zbadać, a następnie pomnożyć wynik dla α-amylazy przez dodatkowy czynnik rozcieńczenia.

6. Oznaczanie ilościowe kortyzolu

UWAGA: W tym teście wolny kortyzol w ślinie jest ilościowo określany przy użyciu krzywej wzorcowej kortyzolu. Standardy oraz rozcieńczone próbki nanosi się na płytkę mikrotitracyjną pokrytą uprzednio przeciwciałem. Do dołków dodaje się koniugat kortyzol-peroksydaza, a następnie przeciwciało monoklonalne przeciwko kortyzolowi. Ilość związanego koniugatu kortyzol/peroksydaza zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia kortyzolu w próbce.

1. Materiały
   1. Do oznaczenia ilości kortyzolu w próbkach śliny należy użyć zestawu do enzymatycznego immunoanalizy kortyzolu (patrz Tabela materiałów). Wszystkie odczynniki niezbędne do wykonania tego testu znajdują się w zestawie. Wszystkie komponenty zestawu przechowuje się w temperaturze 0-4 °C do dnia upływu terminu ważności.
   2. Należy użyć spektrofotometru zdolnego do pomiaru gęstości optycznej (OD) przy 450 nm (patrz Tabela materiałów), a także oprogramowania umożliwiającego wykorzystanie zapisów OD z czytnika płytek do dopasowania krzywej logistycznej czteroparametrowej (4 PLC).
2. Przygotowanie odczynników
   1. Należy pozwolić wszystkim odczynnikom osiągnąć temperaturę 20-25 °C przez minimum 30 min.
   2. Bufor do analizy kortyzolu należy rozcieńczyć 1:5 wodą dejonizowaną.
   3. Bufor płuczący należy rozcieńczyć 1:20 wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Bufory do analizy i płukania są stabilne przez 3 miesiące przy przechowywaniu w temperaturze 0-4 °C.
3. Przygotowanie próbek
   1. Próbki należy rozmrozić na lodzie przed analizą.
   2. Próbki należy rozcieńczyć 1:10 buforem do analizy kortyzolu (20 µL śliny + 180 µL buforu) i wykorzystać w ciągu 2 h od przygotowania.
4. Przygotowanie standardów
   1. Szklane probówki należy opisać od #1 do #7.
   2. Do probówki #1 należy pipetować 225 μL buforu do analizy, a do probówek #2-#7 po 125 μL buforu.
   3. Do probówki #1 należy dodać 25 μL roztworu zapasowego kortyzolu, a następnie wymieszać w wiertaku (vortex).
   4. Z probówki #1 należy pobrać 125 μL buforu i dodać go do probówki #2, a następnie wymieszać w wiertaku.
   5. Rozcieńczenia seryjne należy powtórzyć dla probówek #3-#7.
      UWAGA: Końcowe stężenia kortyzolu dla każdego standardu przedstawiono w Tabeli 1.
   6. Standardy muszą zostać zużyte w ciągu 2 h od przygotowania.

Standard	#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
Objętość buforu do testu (μL)	225	125	125	125	125	125	125
Dodawanie	Roztwór wzorcowy (Stock Std)	#1	#2	#3	#4	#5	#6
Objętość dodawanej ilości (µL)	25	125	125	125	125	125	125
Stężenie końcowe (pg/ml)	3200	1600	800	400	200	100	50

Tabela 1: Tabela przygotowania krzywej standardowej.

5. Analiza
   1. Należy posłużyć się schematem płyty przedstawionym poniżej na Ryc. 1 w celu przygotowania mikropłytki.
   2. Zaleca się użycie pipety wielokanałowej do dodawania reagentów.
   3. Do odpowiedniej liczby studzienek na płytce należy dodać po 50 μL próbek lub standardów. Próbki i standardy powinny być analizowane w duplikatach.
   4. Do studzienek wiązania nieswoistego (NSB) należy dodać bufor do analizy (75 μL).
   5. Do studzienek wiązania maksymalnego (B0) oraz studzienek standardu zero (blank) należy dodać bufor do analizy (50 μL).
   6. Do każdej studzienki należy dodać 25 μL koniugatu kortyzolu.
   7. Do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienek NSB, należy dodać 25 μL przeciwciała przeciwko kortyzolowi.
   8. Należy delikatnie ostukać bok płytki, aby wymieszać reagenty.
   9. Płytkę należy przykryć uszczelniaczem i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) 20-25 °C przez 1 h przy potrząsaniu.
   10. Należy usunąć zawartość studzienek i przemyć każdą z nich 4x buforem do mycia (300 Μl). Między myciami płytkę należy ostukać o ręczniki chłonne w celu osuszenia.
   11. Do każdej studzienki należy dodać substrat TMB (100 μL).
   12. Płytkę należy inkubować w temperaturze 20-25 °C przez 30 min bez potrząsania.
   13. Do każdej studzienki należy dodać roztwór stopujący (50 μL).
   14. Należy odczytać gęstość optyczną w każdej studzience mikropłytki przy 450 nm.
   15. Należy obliczyć średnią gęstość optyczną dla każdego standardu, a następnie próbki, i odjąć średnią gęstość optyczną dla studzienek NSB.
   16. Należy obliczyć % wiązania (B/B0) dla wszystkich próbek, korzystając z kontroli wiązania maksymalnego (B0).
   17. Należy sporządzić krzywą wzorcową przy użyciu oprogramowania umożliwiającego dopasowanie krzywej regresji logistycznej czteroparametrowej, obliczone na podstawie krzywej %B/B0.
   18. Wynik należy pomnożyć przez czynnik rozcieńczenia (10), aby otrzymać wartości kortyzolu w pg/mL.
   19. Próbki, których gęstość optyczna przekracza wartość najwyższego standardu, powinny zostać dodatkowo rozcieńczone buforem do analizy i poddane ponownemu badaniu, a następnie wynik należy pomnożyć przez dodatkowy czynnik rozcieńczenia.

Rysunek 1: Przykładowy układ płytki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Pomiar psychologiczny (Kwestionariusz Odczuwanego Stresu)

1. Zmierz poziom psychologiczny badanych za pomocą kwestionariusza PSQ opublikowanego przez Fliege i współpracowników¹³, który obejmuje cztery czynniki (martwienie się, napięcie, niepokój, radość) i składa się z 20 punktów.
2. Poproś badanego o wypełnienie kwestionariusza PSQ bezpośrednio przed rozpoczęciem doświadczenia rekreacyjnego oraz niezwłocznie po jego zakończeniu.
3. Oznacz kwestionariusze 3-cyfrowym numerem identyfikacyjnym, zgodnym z numerem przypisanym do biofizjologicznego poziomu stresu każdego badanego.

Wyniki

Opis próby
Z wykorzystaniem techniki doboru kwotowego w badaniu zrekrutowano po 35 odwiedzających z każdego z trzech miejsc. Łącznie do badania włączono 105 osób, w tym 63 mężczyzn i 42 kobiety. Średni wiek osób zrekrutowanych z trzech różnych miejsc wynosił odpowiednio 25,9 roku (Miejsce A), 37,2 roku (Miejsce B) oraz 28,8 roku (Miejsce C). Odnotowano również częstotliwość odwiedzin badanych osób w wybranych trzech miejscach. W przypadku Miejsca A i Miejsca C większość osób odwiedzała dany obiekt od...

Dyskusja

Celem tego badania jest zidentyfikowanie potencjalnych zmian w stresie za pomocą narzędzi biofizycznych i psychologicznych po rekreacyjnych wizytach w trzech różnych miejscach o różnych poziomach natury. Wykazano, że zarówno kortyzol, jak i α-amylaza są wiarygodnymi wskaźnikami poziomu stresu psychologicznego. Procedura oznaczania amylazy opisana w tym badaniu została dostosowana do formatu 96 dołków. Gdy poziom amylazy w ślinie jest wysoki, zmiany absorbancji zachodzą szybko. Dlatego bardzo ważne jest ograniczenie liczb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania enzymów kortyzolu	DetectX	K003-H1	Zestaw do oznaczania enzymów kortyzolu jest przeznaczony do ilościowego pomiaru kortyzolu obecnego w suszonych ekstraktach kałowych, ślinie, moczu, surowicy, osoczu i próbkach pożywek hodowlanych.
Etykiety kriogeniczne do przechowywania kriogenicznego	Fisherbrand	5-910-A	Unikalny klej wytrzymuje ekstremalne temperatury
Odczynnik w płynie Amylaza (CNPG3) Set	Pointe Scientific	A7564	Do ilościowego oznaczania kinetycznego aktywności &alfa-amylazy w surowicy ludzkiej.
Probówki polipropylenowe o okrągłym dnie 2 ml z nasadką z gwintem zewnętrznym	Greiner Bio-One	07-000-257	2,0 ml U-BTM Cryo.s wolnostojący sterylizowany polipropylenem
wielomodowy czytnik mikropłytek Synergy			to jednokanałowy czytnik mikropłytek absorbancji, fluorescencji i luminescencji, który wykorzystuje konstrukcję z podwójną optyką do wykonywania pomiarów próbek w formacie mikropłytki.

Jest