Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie półprzewodników do preimplantacyjnych badań genetycznych w kierunku aneuploidii

DOI:

10.3791/59273

⸱

25 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wprowadzamy metodę sekwencjonowania półprzewodników do preimplantacyjnych testów genetycznych na aneuploidię (PGT-A) z zaletami krótkiego czasu realizacji, niskich kosztów i wysokiej przepustowości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidia chromosomalna, jedna z głównych przyczyn prowadzących do zahamowania rozwoju embrionalnego, niepowodzenia implantacji lub utraty ciąży, została dobrze udokumentowana w ludzkich embrionach. Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii (PGT-A) to badanie genetyczne, które znacznie poprawia wyniki reprodukcyjne poprzez wykrywanie nieprawidłowości chromosomalnych zarodków. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) zapewnia wysokowydajne i opłacalne podejście do analizy genetycznej i wykazało kliniczne zastosowanie w PGT-A. W tym artykule przedstawiamy szybką i tanią metodę NGS opartą na sekwencjonowaniu półprzewodników do badań przesiewowych aneuploidii u zarodków. Pierwszym krokiem przepływu pracy jest amplifikacja całego genomu (WGA) próbki zarodka poddanej biopsji, następnie budowa biblioteki sekwencjonowania, a następnie sekwencjonowanie w systemie sekwencjonowania półprzewodnikowego. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku aplikacji PGT-A można załadować i zsekwencjonować 24 próbki na każdym chipie, generując 60-80 milionów odczytów przy średniej długości odczytu 150 par zasad. Metoda zapewnia wyrafinowany protokół do amplifikacji matrycy i wzbogacania biblioteki sekwencjonowania, dzięki czemu detekcja PGT-A jest odtwarzalna, wysokoprzepustowa, opłacalna i oszczędza czas. Czas pracy tego sekwenatora półprzewodnikowego wynosi tylko 2-4 godziny, co skraca czas od otrzymania próbek do wydania raportów do 5 dni. Wszystkie te zalety sprawiają, że test ten jest idealną metodą wykrywania aneuploidii chromosomowych z zarodków, a tym samym ułatwia jego szerokie zastosowanie w PGT-A.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wybór dobrej jakości żywotnych embrionów z normalną liczbą kopii chromosomów (euploid) do transferu w procesie wspomaganego rozrodu pomaga poprawić wyniki ciąży. Tradycyjnie, dobrze ugruntowany system klasyfikacji morfologicznej jest szeroko stosowany do oceny zarodków ze względu na jego łatwą dostępność i nieinwazyjny charakter. Wykazano jednak, że ocena morfologiczna może dostarczyć jedynie ograniczonych informacji na temat jakości zarodka1 i potencjału implantacyjnego2. Jednym z podstawowych powodów jest jego niezdolność do oceny składu chromosomalnego zarodków.

Aneuploidia chromosomowa (nieprawidłowa liczba kopii chromosomów) jest jedną z głównych przyczyn prowadzących do zahamowania rozwoju embrionalnego, niepowodzenia implantacji lub utraty ciąży. Występowanie aneuploidii zostało dobrze udokumentowane w ludzkich zarodkach, stanowiąc 60%−70% w zarodkach w fazie rozszczepienia3,4 i 50%−60% w blastocystach5. To, w pewnym stopniu, przyczyniło się do wąskiego gardła w poprawie wskaźnika ciąż w leczeniu zapłodnieniem in vitro (IVF), który utrzymuje się na poziomie około 35%−40%6,7. Dlatego uważa się, że wybór zarodków euploidalnych do transferu jest korzystny dla poprawy wyników ciąży. W tym celu opracowano preimplantacyjne testy genetyczne w kierunku aneuploidii (PGT-A) w celu zbadania żywotności zarodków przy użyciu metod genetycznych. Rośnie liczba randomizowanych badań kontrolowanych i badań kohortowych potwierdzających kluczową rolę PGT-A. Udowodniono, że zastosowanie PGT-A zmniejsza częstość poronień oraz zwiększa odsetek ciąż klinicznych i wskaźnik implantacji8, wskaźnik ciąż bieżących i wskaźnik żywych urodzeń9.

Historycznie rzecz biorąc, różne metody były stosowane w PGT-A, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH), macierz-CGH i polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP)-mikromacierz. Wcześniejsze badania wykazały, że PGT-A dla zarodków w fazie rozszczepienia przez FISH daje wyniki, które są słabo zgodne z wynikami uzyskanymi przez kompleksowe badanie przesiewowe chromosomów (CCS) odpowiednich blastocyst przy użyciu 59273array-CGH lub SNP-microarray5927310. Rozbieżności te można przypisać mozaicyzmowi chromosomalnemu, artefaktom technicznym FISH lub embrionalnej autokorekcji błędów segregacji chromosomów podczas rozwoju11. Powszechnie uznano, że stosowanie biopsji trofektodermy blastocysty (TE) dla PGT-A opartych na macierzy, takich jak macierz-CGH lub mikromacierz SNP, jest skuteczne w identyfikacji nierównowagi chromosomalnej w zarodkach10,12. Ostatnio sekwencjonowanie pojedynczej komórki nowej generacji (NGS) zapewnia wysokowydajne i opłacalne podejście do analizy genetycznej i wykazało kliniczne zastosowanie w PGT-A13,14,15, co czyni go obiecującą alternatywą dla obecnie dostępnych metod.

Tutaj prezentujemy szybką, solidną i tanią metodę NGS opartą na sekwencjonowaniu półprzewodników do badań przesiewowych aneuploidii u ludzkich embrionów. Pierwszym etapem przepływu pracy jest amplifikacja całego genomu (WGA) próbki zarodka poddanej biopsji przy użyciu jednokomórkowego zestawu WGA, następnie budowa biblioteki sekwencjonowania, a następnie sekwencjonowanie w systemie sekwencjonowania półprzewodników.

Poprzez wykrywanie jonów H+, które są uwalniane z każdej inkorporacji trifosforanu deoksyrybonukleozydu podczas syntezy nici DNA, system przekazuje sygnały chemiczne (zmiana pH) przechwycone przez elementy półprzewodnikowe do bezpośrednich danych cyfrowych, które są dalej interpretowane jako informacje o sekwencji DNA. Eliminując konieczność kosztownej detekcji optycznej i złożonych reakcji sekwencjonowania, ta prosta chemia sekwencjonowania zmniejsza całkowity koszt odczynnika i skraca czas sekwencjonowania do 2−4 godzin16. Co ważniejsze, w oparciu o specyfikacje wydajności producenta, platforma sekwencjonowania półprzewodników może generować do 15 GB danych sekwencjonowania (w zależności od jakości biblioteki) na przebieg, co jest znacznie wyższe niż niektóre inne sekwencery produkujące tylko około 3−4 GB danych (przy długości odczytu 2 x 75 bp)17. W zastosowaniach klinicznych PGT-A platforma ta może osiągnąć 24 próbki na chip, generując do 80 milionów odczytów17 i co najmniej milion unikalnych odczytów każdej próbki. Głębokość odczytu może zapewnić, że każda próbka ma co najmniej 0,05 raza pokrycie całego genomu. Powyższe zalety tej platformy sprawiają, że jest to idealna metoda przesiewowa, a co za tym idzie, ułatwia jej szerokie zastosowanie w PGT-A18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etyczna aprobata została udzielona przez Joint Chinese University of Hong Kong―New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (Numer referencyjny: 2010.432). Licencja badawcza została zatwierdzona przez Radę ds. Technologii Rozrodu Człowieka w Hongkongu (numer R3004).

1. Amplifikacja całego genomu

  1. Przed rozpoczęciem należy sprawdzić objętość kulek magnetycznych (Tabela materiałów), aby upewnić się, że na każdą próbkę przypada nie mniej niż 135 μl (z 20% nadmiarem). Przechowuj kulki magnetyczne w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 30 minut. Przygotować 720 μl (z 20% nadmiarem) 70% etanolu dla każdej próbki. Wyposażyć termocykler (tabela materiałów) w podgrzewaną pokrywę o temperaturze 105 °C.
    UWAGA: Nowo przygotowany 70% etanol (Tabela Materiałów) należy zużyć w ciągu 3 dni.
  2. Przygotowanie próbki
    UWAGA: W rutynowej praktyce od 5 do 10 komórek trofektodermy blastocysty jest biopsowanych zgodnie z wytycznymi praktyki19.
    1. Zawiesić biopsje w 2 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w pojedynczej probówce o pojemności 0,2 ml do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
    2. Krótko obracaj probówkę na mini wirówce przez 3 sekundy, aby zebrać kropelki.
  3. Liza i ekstrakcja komórek
    1. Rozmrozić bufor do ekstrakcji komórek (tabela materiałów) i bufor do rozcieńczania enzymu ekstrakcyjnego (tabela materiałów) na lodzie, odwirować i krótko odwirować na mini wirówce przez 3 sekundy przed użyciem.
    2. Dodać 3 μl buforu do ekstrakcji komórek do każdej probówki z kroku 1.2.2.
    3. Dla każdej próbki należy przygotować 5 μl głównej mieszaniny do lizy komórek, dodając 4,8 μl buforu do rozcieńczania enzymu ekstrakcyjnego i 0,2 μl enzymu do ekstrakcji komórek (tabela materiałów). Dobrze wymieszać i podwielokrotnić porcję do każdej probówki z kroku 1.3.2. Delikatnie obróć probówkę i krótko zakręć na mini wirówce przez 3 s.
      UWAGA: końcówki nie powinny dotykać cieczy zawierającej próbki komórek podczas dodawania mieszanki wzorcowej.
    4. Inkubować probówkę z kroku 1.3.3 w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program z następującymi ustawieniami: 10 min w 75 °C, 4 min w 95 °C, przytrzymaj w 4 °C.
  4. Przedwzmacniacz
    1. Rozmrozić bufor przedwzmacniacza (tabela materiałów) na lodzie, odwirować i krótko wirować na mini wirówce przez 3 sekundy przed użyciem.
    2. Przygotować 5 μl głównej mieszanki preamplifikacji dla każdej próbki, dodając 4,8 μl buforu do preamplifikacji i 0,2 μl enzymu do preamplifikacji (tabela materiałów). Dobrze wymieszać i podwielokrotnić porcję do każdej probówki z kroku 1.3.4. Delikatnie obróć probówkę i krótko zakręć na mini wirówce przez 3 s.
      UWAGA: Końcówki nie powinny dotykać płynu zawierającego próbki DNA podczas dodawania mieszanki wzorcowej.
    3. Inkubować probówkę w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program z ustawieniami przepływu: 2 min w 95 °C; 12 cykli przez 15 s w 95 °C, 50 s w 15 °C, 40 s w 25 °C, 30 s w 35 °C, 40 s w 65 °C, 40 s w 75 °C; przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. wzmocnienie
    1. Rozmrozić bufor wzmacniający (tabela materiałów) na lodzie, odwirować i krótko wirować na mini wirówce przez 3 sekundy przed użyciem.
    2. Przygotować 60 μl głównej mieszanki amplifikacyjnej dla każdej próbki, dodając 25 μl buforu amplifikacyjnego, 0,8 μl enzymu amplifikacyjnego (tabela materiałów) i 34,2 μl wody wolnej od nukleaz dla WGA (tabela materiałów). Dobrze wymieszać i podwielokrotność porcji do każdej probówki z kroku 1.4.3. Delikatnie odwróć probówkę i krótko obracaj na mini wirówce przez 3 sekundy.
    3. Inkubować probówkę w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program z następującymi ustawieniami: 2 min w 95 °C; 14 cykli przez 15 s w temperaturze 95 °C, 1 min w temperaturze 65 °C, 1 minuta w temperaturze 75 °C; przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Oczyszczanie produktów WGA
    1. Przenieś każdy produkt WGA z kroku 1.5.3 do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 112,5 μl kulek magnetycznych do każdej probówki. Wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Całkowicie wymieszaj kulki magnetyczne przed użyciem.
    2. Umieść probówki na stojaku magnetycznym (tabela materiałów) na 3 minuty, aż supernatant będzie czysty. Wyrzuć cały supernatant bez naruszania kulek.
    3. Do każdej probówki dodać 300 μl 70% etanolu. Obróć każdą rurkę o 180°, aby kulki przepłynęły przez etanol i obróciły się z powrotem do pierwotnej pozycji. Wyrzuć cały supernatant po opadnięciu koralików, nie naruszając ich bez naruszania koralików. Powtórz ten krok raz.
      UWAGA: Trzymaj rurkę na stojaku magnetycznym, obracając rurkę w poziomie.
    4. Krótko obracaj każdą probówkę na mini wirówce przez 3 sekundy. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aż resztkowy supernatant będzie czysty. Odrzucić cały pozostały supernatant bez naruszania kulek. Suszyć koraliki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 3 minuty.
    5. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś wysuszone kulki, dodając 35 μl buforu o niskiej zawartości Tris-EDTA (TE) (Tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 3 minuty, aż supernatant będzie czysty. Przenieś cały supernatant zawierający eluowane DNA do nowych probówek o pojemności 1,5 ml bez naruszania kulek.

2. Kontrola jakości produktów WGA

  1. Oznacz ilościowo każdy oczyszczony produkt WGA z kroku 1.6.6 za pomocą testu fluorometrycznego (tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta, używając 1 μl produktu WGA jako materiału wyjściowego.
    UWAGA: Dopuszczalne stężenie produktu WGA wynosi ≥ 10 ng/μL. Żaden produkt poniżej tego progu nie jest zalecany, aby przejść do kolejnych kroków.

3. Rozdrobnienie produktów WGA

  1. Przed rozpoczęciem należy podgrzać suchy blok grzejny do temperatury 37 °C. Przygotować 6 μl (z 20% nadmiarem) 0,5 M EDTA dla każdej próbki. Na podstawie stężenia, podamy 300 ng DNA z każdego oczyszczonego produktu WGA w kroku 1.6.6 do nowych probówek PCR o pojemności 0,2 ml i doprowadzimy objętość do 16 μl wodą wolną od nukleaz dla każdej probówki.
  2. fragmentacja
    1. Przygotować 4 μl mieszaniny reakcyjnej fragmentacji dwuniciowego DNA (dsDNA) dla każdej próbki, dodając 2 μl buforu reakcji fragmentacji dsDNA (tabela materiałów) i 2 μl enzymów fragmentacji dsDNA (tabela materiałów). Dobrze wymieszać i podaszkę do każdej probówki z kroku 3.1. Wiruj i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 sekundy. Inkubować probówki przez 25 minut w temperaturze 37 °C w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą.
    2. Natychmiast dodać 5 μl 0,5 M EDTA do każdej probówki. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 sekundy.
  3. Oczyszczanie i ponowne zawieszenie
    1. Przenieść każdy produkt z kroku 3.2.2 do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 37,5 μl kulek magnetycznych do każdej probówki. Mieszać przez wierzchołkowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Oczyść produkty zgodnie z opisem od kroku 1.6.2 do kroku 1.6.4.
    3. Eluować każdy oczyszczony produkt zgodnie z opisem w krokach 1.6.5 i 1.6.6, dodając 32 μl buforu o niskiej zawartości TE.

4. Budowa biblioteki

  1. Blunt-e nd r epairing, wybór rozmiaru i oczyszczanie
    1. Przygotować 20 μl mieszanki naprawczej dla każdej próbki, dodając 9,5 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 5x buforu do naprawy końcówek (probówka z tabelą materiałówz kroku 3.3.3. Wiruj i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 sekundy.
    2. Dodaj 50 μl kulek magnetycznych do każdej probówki z kroku 4.1.1. Wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Całkowicie wymieszaj kulki magnetyczne przed użyciem.
    3. Umieść każdą probówkę na stojaku magnetycznym na 3 minuty, aż supernatant będzie klarowny. Przenieść cały supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml, do których dodaje się 25 μl kulek magnetycznych. Zwirować probówki z przeniesionym supernatantem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Oczyścić produkty w inkubowanych probówkach zgodnie z opisem w kroku 1.6.2 do kroku 1.6.4.
    5. Eluować każdy oczyszczony produkt zgodnie z opisem w krokach 1.6.5 i 1.6.6, dodając 32 μl buforu o niskiej zawartości TE.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania; oczyszczone DNA z tego etapu jest stabilne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny.
  2. Adaptor ligacja i puryfikacja
    1. Przygotuj 17 μl mieszanki ligacyjnej z adapterem dla każdej próbki, dodając 10 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl 10-krotnego buforu ligazy (tabela materiałów), 1 μl adaptera P1 (tabela materiałów) i 1 μl ligazy DNA (tabela materiałów). Dobrze wymieszać przez wirowanie przez 5 s i wirować na mini wirówce przez 15 s, a następnie porcjować do każdej probówki z kroku 4.1.5.
    2. Dodać 1 μl adapterów (tabela materiałów) do każdej probówki z kroku 4.2.1 zgodnie z arkuszem próbki (Plik uzupełniający: Arkusz próbki do podwiązania adaptera). Wiruj i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 sekundy. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej (20−25 °C) przez 20 minut.
    3. Dodać 75 μl kulek magnetycznych do każdej probówki z kroku 4.2.2. Mieszać przez wierzchołkowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie oczyść produkty zgodnie z opisem od kroku 1.6.2 do kroku 1.6.4.
    4. Eluować każdy oczyszczony produkt zgodnie z opisem w krokach 1.6.5 i 1.6.6, dodając 15 μl buforu o niskiej zawartości TE. Przenieść cały supernatant zawierający wymyte DNA do nowych pasków 8-probówkowych o pojemności 0,2 ml.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania; oczyszczone DNA z tego etapu jest stabilne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny.
  3. Amplifikacja i oczyszczanie
    1. Przygotować 50 μl głównej mieszanki amplifikacyjnej dla każdej próbki, dodając 47,5 μl super mieszanki (tabela materiałów) i 2,5 μl mieszanki startera (tabela materiałów). Dobrze wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować na mini wirówce, a następnie podzielić na paski o pojemności 0,2 ml z 8 probówek z kroku 4.2.4.
    2. Wiruj paski przez 30 s i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 s. Inkubuj paski w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program z następującymi ustawieniami: 20 min w temperaturze 72 °C; 5 min w temperaturze 95 °C; 10 cykli przez 15 s w temperaturze 95 °C, 15 s w temperaturze 62 °C, 1 min w temperaturze 70 °C; 5 min w temperaturze 70 °C; przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieś każdy produkt z kroku 4.3.2 do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 97,5 μl kulek magnetycznych do każdej probówki. Mieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Oczyść produkty zgodnie z opisem od kroku 1.6.2 do kroku 1.6.4.
    5. Eluować każdy oczyszczony produkt zgodnie z opisem w krokach 1.6.5 i 1.6.6, dodając 25 μl buforu o niskiej zawartości TE.

5. Kontrola jakości i rozcieńczanie biblioteki DNA

  1. Określić ilościowo każdą przygotowaną bibliotekę DNA od kroku 4.3.5 za pomocą testu fluorometrycznego zgodnie z instrukcją producenta, używając 2 μl biblioteki DNA jako materiału wyjściowego.
  2. Przyjęte stężenie biblioteki DNA wynosi ≥ 0,5 ng/μl, a kontroli pozytywnej (tabela materiałów) ≤ 15 ng/μl. Jeżeli stężenie kontroli dodatniej różni się zbyt mocno od 15 ng/μl, należy powtórzyć oznaczanie ilościowe kontroli dodatniej, aż stężenie zbliży się do 15 ng/μl. Jeśli stężenie w bibliotece jest niższe niż 0,5 ng/μL, należy wznowić pracę od fragmentacji (sekcja 3).
    UWAGA: Upewnij się, że stężenie kontroli pozytywnej osiągnie akceptowalną wartość przed ilościowym określeniem biblioteki DNA.
  3. Rozcieńczyć każdą bibliotekę do 100 pmol, dodając wodę wolną od nukleaz. Dodać 1 μl biblioteki do n μl wody wolnej od nukleaz; Oblicz n, korzystając z poniższego równania:
    figure-protocol-1
    gdzie Q jest stężeniem każdej biblioteki mierzonym za pomocą testu fluorometrycznego, a C jest stężeniem kontroli dodatniej mierzonym za pomocą testu fluorometrycznego.

6. Sekwencjonowanie

  1. Przed rozpoczęciem należy przygotować 48 μl (z 20% nadmiarem) 1 M NaOH dla każdej próbki i jednej probówki 1,5 ml wolnej od nukleaz. Rozmrozić bufor do PCR master mix (tabela materiałów) (2000 μl objętości) w temperaturze pokojowej. Przynieś cząstki kuli (tabela materiałów) do temperatury pokojowej.
  2. Łączenie bibliotek
    1. Wiruj każdą rozcieńczoną bibliotekę z kroku 5.3 i krótko wiruj 4x na mini wirówce przez 3 sekundy za każdym razem. Weź 5 μl z każdej biblioteki, aby zebrać je w probówce 1,5 ml bez nukleaz. Wiruj wymieszaną bibliotekę i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 sekundy.
  3. Emulsyjny PCR przy użyciu systemu emulsyjnego
    1. Dodać 150 μl roztworu łamiącego do 2 nowych probówek regeneracyjnych (tabela materiałów). Zainstaluj nowe rurki regeneracyjne, router do odzyskiwania i płytkę wzmacniającą.
    2. Wymieszaj, odwracając butelkę z olejem (tabela materiałów) 3 razy. Upewnij się, że zarówno olej, jak i roztwór odzysku (tabela materiałów) są wypełnione w co najmniej 2/3.
    3. Wirować bufor PCR master mix przez 30 s i krótko wirować na mini wirówce przez 3 s. Wirować cząstki kuli i wymieszaną bibliotekę z kroku 6.2.1 przez 1 minutę i krótko wirować w mini wirówce przez 3 s.
    4. Przygotować mieszaninę ligacyjną o objętości 2400 μl, dodając 172 μl wody wolnej od nukleaz, 8 μl mieszanej biblioteki z kroku 6.3.3, 120 μl mieszaniny enzymów (tabela materiałów) i 100 μl cząstek kuli do probówki zawierającej 2000 μl buforu do PCR master mix.
    5. Ustawić pipetę na 800 μl. Załadować mieszaninę do ligacji z kroku 6.3.4 do filtra reakcyjnego (tabela materiałów) przez port próbki. Za pomocą pipety 1000P dodaj 200 μl oleju reakcyjnego do filtra reakcyjnego.
    6. Wybierz program Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit, a następnie wybierz przycisk Wspomagany, aby upewnić się, że urządzenie zostało poprawnie skonfigurowane, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na monitorze. Następnie kliknij przycisk Dalej, aby uruchomić program.
  4. Wzbogacanie za pomocą automatycznego systemu wzbogacania
    1. Po zakończeniu programu emulsji PCR kliknij przycisk Dalej, a następnie kliknij przycisk Ostatnie wirowanie, aby wirować przez 10 minut. Wyjmij 2 probówki regeneracyjne po kliknięciu Otwórz pokrywę.
    2. Wyrzucić supernatant z 2 probówek regeneracyjnych do momentu, aż w każdej probówce pozostanie 100 μl i odpowiednio oznaczyć. Dobrze wymieszaj roztwór i przenieś do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 200 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki odzyskiwania, przemyć, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie przenieść cały roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml w kroku 6.4.2. Powtórz krok prania raz.
    4. Dodaj 200 μl wody wolnej od nukleaz do jednej z probówek regeneracyjnych i przemyj, pipetując kilkakrotnie w górę iw dół. Przenieś cały roztwór do drugiej probówki regeneracyjnej i przemyj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie przenieś cały roztwór do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml z kroku 6.4.3. Wirować probówkę o pojemności 1,5 ml przez 30 s i wirować przez 8 minut przy 15 500 x g.
      UWAGA: Ostateczna całkowita objętość produktu emulsyjnego PCR na tym etapie powinna wynosić około 1200 μL.
    5. Wyrzucić sklarowany osad z probówki i zachować 20 μl emulsyjnego produktu PCR. Dodać 80 μl roztworu do ponownego zaparowania (tabela materiałów) do probówki. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
    6. Przygotować 320 μl roztworu topniejącego dla każdego wióra, dodając 280 μl roztworu monolaurynianu glikolu polietylenowego sorbitanu (tabela materiałów) i 40 μl 1 M NaOH.
      UWAGA: 1 M NaOH należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub świeżo przygotowany. Wirować przed użyciem.
    7. Wirować probówkę zawierającą kulki C1 (tabela materiałów) przez 30 s. Weź 100 μl kulek C1 do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć cały supernatant po opadnięciu kulek, nie naruszając ich bez naruszania kulek.
    8. Dodać 1 ml roztworu myjącego C1 (tabela materiałów) do probówki z kroku 6.4.7. Wir przez 30 s. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć cały supernatant po opadnięciu kulek bez naruszania kulek. Ponownie zawiesić kulki, dodając 130 μl roztworu do wychwytywania kulek (tabela materiałów).
    9. Konfiguracja systemu wzbogacania (ES)
      1. Do paska składającego się z 8 probówek należy załadować próbkę (100 μl emulsyjnego produktu PCR) z kroku 6.4.5, przemyte kulki (130 μl) z kroku 6.4.8, roztwór płuczący ES (300 μl) (tabela materiałów) i roztwór do stopienia (300 μl) z kroku 6.4.6. Kolejność układu jest następująca: próbka (probówka 1), przemyte kulki (probówka 2), roztwór do płukania ES (probówki 3, 4, 5) i roztwór do stopienia (probówka 7). Probówki 6 i 8 powinny być puste.
      2. Umieść pasek z 8 rurkami z kroku 6.4.9.1 na ES. Zainstaluj końcówkę do pipety i nową probówkę o pojemności 0,2 ml i uruchom program.
        UWAGA: Upewnij się, że pipetowanie przebiega normalnie.
    10. Umyj cząstki kuli po zakończeniu wzbogacania.
      1. Odwirować probówkę o pojemności 0,2 ml z kroku 6.4.9.2 przez 5 minut przy 15 500 x g. Odrzucić sklarowany osad i zachować 10 μl produktu wzbogacającego. Do probówki dodać 200 μl wody wolnej od nukleaz. Wymieszaj przez wirowanie.
      2. Odwirować probówkę o pojemności 0,2 ml przez 5 minut przy 15 500 x g. Odrzucić sklarowany osad i zachować 10 μl produktu wzbogacającego. Do probówki dodać 90 μl wody wolnej od nukleaz. Wymieszaj przez wirowanie.
  5. Przygotowanie szablonu
    1. Odwiruj kontrolę pozytywną i krótko zakręć. Dodać 5 μl kontroli dodatniej do 100 μl matrycy (produkt wzbogacający z kroku 6.4.10.2). Wirować i wirować przez 5 minut przy 15 500 x g. Odrzucić supernatant i zachować 10 μl matrycy.
    2. Dodać 20 μl startera sekwencyjnego (tabela materiałów) i 15 μl buforu do wyżarzania (tabela materiałów) do probówki z szablonem z kroku 6.5.1. Wiruj probówkę i krótko wiruj na mini wirówce przez 3 sekundy.
    3. Inkubować probówkę z kroku 6.5.2 w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program z następującymi ustawieniami: 2 min w 95 °C, 2 min w 37 °C, przytrzymaj w 4 °C.
    4. Dodać 10 μl buforu ładującego (tabela materiałów) do probówki z kroku 6.5.3. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
  6. Inicjalizacja sekwencera
    1. Sprawdź ciśnienie azotu gazowego w butli (ciśnienie całkowite ≥ 500 psi, ciśnienie wyjściowe ≥ 10 psi, optymalne 20-30 psi). Uzupełnij 100 ml wody dejonizowanej (18,2 MΩ) do probówek C1 i C2 (Tabela materiałów) i zainstaluj je w odpowiednich pozycjach C1 i C2 na sekwencerze.
    2. Przygotować roztwory W1 (32 μl 1 M NaOH) i W3 (40−50 ml buforu W3 [tabela materiałów]). Przygotuj roztwór W2, dodając 1920 ml wody dejonizowanej (18,2 MΩ), całą butelkę buforu W2 (tabela materiałów) i 8−12 μl 1 M NaOH i odwróć 4−8 razy, aby wymieszać.
      UWAGA: Ponieważ jakość wody różni się geologicznie, w razie potrzeby dostosuj objętość 1 M NaOH. Początkowe pH W2 wynosi 5,9−6,1, a optymalny zakres po regulacji to 7,4−7,6. Wymień i zainstaluj nowe probówki z odczynnikami i użyj ostatnio używanego chipa do mycia.
    3. Przygotuj 4 nowe puste probówki z zestawu suplementów do sekwencjonowania (tabela materiałów). Oznacz 4 probówki jako dGTP, dCTP, dATP i dTTP i dodaj 70 μl dGTP, dCTP, dATP lub dTTP (tabela materiałów) do odpowiedniej probówki (tj. 70 μl dGTP do probówki oznaczonej jako dGTP itp.). Zmieszaj rurki przed użyciem. Zamontuj rurki w odpowiednich pozycjach wyznaczonych na sekwencerze (Tabela materiałów).
  7. Mycie wiórów
    1. Umyj wiór (tabela materiałów) raz, wstrzykując 100 μl izopropanolu do studzienki załadowczej chipa. Usuń wyrzuconą ciecz z przeciwległej studzienki.
    2. Umyj chip dwukrotnie, wstrzykując 100 μl wody wolnej od nukleaz do studzienki załadowczej chipa. Usuń wyrzuconą ciecz z przeciwległej studzienki.
    3. Umyj wiór raz, wstrzykując 100 μl 0,1 M NaOH do studzienki załadowczej chipa. Usuń wyrzuconą ciecz z przeciwległej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
    4. Umyj chip raz, wstrzykując 100 μl wody wolnej od nukleaz do dołka załadowczego chipa. Usuń wyrzuconą ciecz z przeciwległej studzienki.
    5. Umyj wiór dwukrotnie, wstrzykując 100 μl izopropanolu do studzienki załadowczej wióra. Usuń wyrzuconą ciecz z przeciwległej studzienki. Wysuszyć, wdmuchując azot na wiór. Przechowywać z dala od światła.
  8. Ładowanie i sekwencjonowanie próbek
    1. Wymieszać próbkę o objętości 55 μl z kroku 6.5.4, pipetując w górę i w dół, a następnie załadować próbkę do dołka załadowczego chipa.
      UWAGA: Zachowaj końcówkę pipety i probówkę do PCR o pojemności 0,2 ml użytą na tym etapie.
    2. Umieść wiór na mini wirówce do wiórów (tabela materiałów), gdy
    3. Przygotuj dwie nowe probówki o pojemności 1,5 ml na bufor do wyżarzania i roztwór płuczący. Przygotować 50% bufor do wyżarzania, dodając 500 μl buforu do wyżarzania i 500 μl wody wolnej od nukleaz. Przygotować roztwór do płukania, dodając 500 μl buforu do wyżarzania i 500 μl 100 % 2-propanolu.
    4. Przygotować dwie nowe probówki o pojemności 1,5 ml i przygotować mieszaninę pieniącą, mieszając 49 μl 50% buforu do wyżarzania i 1 μl roztworu pianotwórczego (tabela materiałów) w obu probówkach.
    5. Ustawić pipetę na 100 μl. Uzyskać pęcherzyki, pipetując powietrze do mieszaniny spieniającej z jednej z dwóch probówek z kroku 6.8.4. Przygotować > 120 μl pęcherzyków i pipetować tak długo, aż nie będzie widać widocznych pęcherzyków. Załaduj 120 μl bąbelków do studzienki załadowczej.
      UWAGA: Upewnij się, że nie ma widocznych pęcherzyków. W przeciwnym razie zacznij go od nowa.
    6. Przenieść nadmiar wydmuchiwanej cieczy ze studzienki wyjściowej z kroku 6.8.5 do studzienki załadowczej za pomocą pipetowania. Nie należy pipetować pęcherzyków powietrza. Wiruj wiór przez 30 sekund na mini wirówce do chipsów.
    7. Powtórzyć krok 6.8.5, używając drugiej probówki zawierającej mieszaninę pieniącą z kroku 6.8.4.
    8. Dodać 55 μl 50% buforu do wyżarzania do probówki o pojemności 0,2 ml przechowywanej w kroku 6.8.1. Użyj zachowanej końcówki pipety opisanej w kroku 6.8.1, aby pipetować w górę i w dół. Załaduj cały bufor do wyżarzania o pojemności 55 μl do studzienki załadowczej. Wiruj wiór przez 30 sekund na wyznaczonej mini wirówce do wiórów.
    9. Załadować 100 μl roztworu płuczącego do studzienki załadowczej wiórów i wyrzucić wyrzuconą ciecz ze studzienki wyjściowej. Powtórz ten krok ładowania raz.
      UWAGA: Jeśli w chipie znajdują się bąbelki, usuń małe bąbelki dużymi bąbelkami i przepłucz roztworem do spłukiwania. Można to osiągnąć, pipetując 100 μl roztworu płuczącego i pozostawiając 5 μl powietrza poniżej roztworu płuczącego. Dlatego podczas pipetowania 105 μl do chipa powietrze utworzy duży pęcherzyk, który może usunąć małe pęcherzyki, a następnie duży pęcherzyk może zostać wydalony przez następujący roztwór do płukania.
    10. Załaduj 100 μl 50% bufora do wyżarzania do studzienki załadowczej wiórów. Powtórz ten krok ładowania w sumie 3 razy.
    11. Dodać 6 μl enzymu sekwencjonującego do 60 μl 50% buforu do wyżarzania do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Załadować 65 μl tego zmieszanego roztworu do studzienki załadowczej wiórów. Pipetować powoli, aby uniknąć pienienia.
    12. Trzymaj chip z dala od światła i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    13. Po inkubacji natychmiast załaduj chip do sekwencera i kliknij Rozpocznij sekwencjonowanie na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie.
      UWAGA: Surowe dane sekwencjonowania i pliki kontroli jakości zostaną automatycznie przesłane do firmy w celu analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na podstawie tego zmodyfikowanego protokołu, platforma sekwencjonowania półprzewodników została po raz pierwszy zastosowana do PGT-A. Testowaliśmy na biopsjach zarówno blastomerów w stadium rozszczepienia, jak i zarodków w stadium blastocysty. Sugeruje się, aby biopsyjne komórki zostały poddane WGA tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec jakiejkolwiek degradacji DNA. W poprzednim badaniu porównano wydajność różnych metod WGA i wskazano, że opisana przez nas metoda miała najlepszą jednoro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W odróżnieniu od innych chemii sekwencjonowania, opisany tutaj sekwencer wykorzystuje półprzewodnik do wykrywania nukleotydów. Sam chip jest urządzeniem elektronicznym, które wykrywa jony wodoru poprzez inkorporację zasady17 sterowanej polimerazą, co umożliwia czas sekwencjonowania programu Proton w ciągu 2-4 godzin. Poza tym chip jest chipem mikrodołkowym, który umożliwia lokalizację jednej cząsteczki docelowej, co różni się od chemii sekwencjonowania komórek przepływowych przez innych dostawców ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez General Research Fund (Ref No. 14162417) z Hong Kongu, National Natural Science Foundation of China (Ref No. 81860272), Major Research Plan of the Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref No. AB16380219) oraz grant Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (nr ref. 2018M630993) z Chin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do PCR, 0,2 mlAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575020
PBS, pH 7,4, Ca2+ i Mg2+ThermoFisher10010023
1,0 M roztwór NaOH (1,0N)SIGMA-ALDRICHS2567Do roztworu do stopienia. Probówki
Eppendorf LoBind klasy molekularnej, 1,5 mlFisher Scientific13-698-791
Zestaw biblioteki fragmentów Ion PlusThermoFisher4471252
ELGA PURELAB Flex 3 lub
Odpowiednik 18 MΩ system wodny		ThermoFisher4474524
Ion Plus Zestaw biblioteki fragmentówThermoFisher4471252
Bufor do amplifikacji PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplifikacja enzymuRubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-03.
Płytka wzmacniającaOneTouch W zestawie: Materiały eksploatacyjne Ion OneTouch 2 (nr części A26367). Rozszerzony element zestawu w arkuszu 5
wyżarzania jonów PI
MyOne Beads Capture Solution Agilent
2100 Bioanalyzer Agilent 2100AgilentG2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (nasadka)W zestawie: Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (nr części A26429). Rozszerzony element zestawu w arkuszu 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA Bufor do ekstrakcji komórekRubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Enzym do ekstrakcji komórekRubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-03.
Zestaw chipów Ion PI v3ThermoFisherA26771
Mini chip jonowy, 230 VThermoFisher4479673
Ion PI dATPThermoFisherA26772
Ion PI dCTPThermoFisherA26772
Ion PI dGTPThermoFisherA26772
Zestaw biblioteki fragmentów Ion PlusThermoFisher4471252
Zestaw biblioteki fragmentów Ion PlusThermoFisher4471252
ThermoQ– Temperatura Sucha kąpielTAMARHB-T2-A
NEBNext dsDNA FragmentazaNew England BiolabsM0348L
NEBNext dsDNA FragmentazaNew England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 InstrumentThermoFisherINS1005527ThermoFisher Numer katalogowy: 4474778.
Zestaw biblioteki fragmentów Ion PlusThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher Numer katalogowy: 4469495. Rozszerzony element zestawu w arkuszu 5
EtanolSIGMA-ALDRICH51976Można go zastąpić absolutnym etanolem molekularnym dowolnej marki.
Bufor do rozcieńczania enzymów ekstrakcyjnych PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Bufor do rozcieńczania enzymów ekstrakcyjnychRubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-02.
Fluorometr Qubit 3.0ThermoFisherQ33216Ten model został zastąpiony przez Fluorometr Qubit 4, numer katalogowy: Q33226.
Zestaw testowy Qubit ds DNA HSThermoFisherM2002-02
Probówki do testów kubitowychThermoFisherQ32856
Roztwór spieniający Ion PIThermoFisherA26772
Indeks do kodów kreskowych bibliotekBaseCarejest to indeks przygotowany przez nas. Użytkownicy mogą kupić produkt komercyjny od ThermoFisher Ion Xpress Zestawy adapterów kodów kreskowych (Kat. Nr 4474517)
Bufor ładujący Ion PIThermoFisherA26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE BufferThermoFisher4389764
Agencour AMPure XP KitBeckman CoulterA63880
Magnes DynaMag-2 (stojak magnetyczny)Bufor
Ion PI Master Mix
Sorvall Legend Micro 17 MikrowirówkaMicro 1775002430
Zestaw biblioteki fragmentów Ion PlusThermoFisher4471252
Woda wolna od nukleazThermoFisherAM9922Można go zastąpić inną marką.
PicoPLEX WGA Woda wolna od nukleazRubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-03.
ButelkaOneTouch Ion PI Cześć? Q OT2 Solutions 200 (nr części A26429). Rozszerzony komponent zestawu w arkuszu 5
Zestaw biblioteki fragmentów jonów plusThermoFisher4471252Rozszerzony składnik zestawu w arkuszu 3
dwuniciowy standardJest to opracowany przez nas wzorzec DNA do kalibracji kubitu przed kwantyfikacją biblioteki.
Bufor do preamplifikacji PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-03.
Enzym do preamplifikacji PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Można go zastąpić systemem amplifikacji DNA SurePlex, numer katalogowy: PR-40-415101-03.
Biblioteka Amplification Primer MixThermoFisher4471252Rozszerzony składnik zestawu w arkuszu 3
Ion OneTouch Reaction FilterRozszerzony składnik zestawu w arkuszu 5
Recovery RouterRozszerzony składnik zestawu w arkuszu 5
Probówki regeneracyjneRozszerzony składnik zestawu w arkuszu
Ponowne zawieszenie ISP Rozwiązanie
Jon ProtonThermoFisherDA8600Ten model jest importowany przez Da An Gene Co., LTD. z Uniwersytetu Sun Yat-Sen z ThermoFisher i został certyfikowany przez Chińską Agencję ds. Żywności i Leków do zastosowań klinicznych. Numer katalogowy w ThermoFisher to 4476610.
Ion PI: Cześć? Q Sekwencjonowanie PolimerazaThermoFisherA26772
Jonowy PI Sekwencjonowanie
Starter Serwer do sekwencjonowaniaLenovoT260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High FidelityThermoFisher4471252
Nalgene 25mm Filtry strzykawkoweThermoFisher724-2045Wielkość porów: 0,45 μm. Specjalnie dla płynów wodnych.
Ion PI: Cześć? Q W2 RoztwórThermoFisherA26772
Ion PI 1X W3 RoztwórThermoFisherA26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
Ion PGM Cześć? Q View Zestaw sekwencjonowaniaThermoFisherA30044Rozszerzony składnik zestawu w arkuszu 2
Zestaw biblioteki fragmentów Ion PlusThermoFisher4471252Rozszerzony składnik zestawu w arkuszu 3
Zestaw sekwencjonowania Ion PI Hi-Q 200 (1 przebieg sekwencjonowania na inicjalizację)ThermoFisherA26772Rozszerzony składnik zestawu w arkuszu 4
Ion PI Cześć? Q OT2 200 KitThermoFisherA26434Rozszerzony element zestawu w arkuszu 5
System oczyszczania wody Ion Bufor do PCR ThermoFisher 12321D oleju Ion DNA 5

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779(2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36(2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252(2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewanie aneuploidiiamplifikacja ca ego genomukonstrukcja bibliotekiamplifikacja matrycyprotok wzbogacaniaPCR w emulsjisekwencjonowanie na chipiewariacje liczby kopii

Powiązane artykuły