Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59277

⸱

23 lutego 2019

 , 
1Department of Regenerative and Cancer Cell Biology, Albany Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Optymalna funkcja mitochondriów jest kluczowa dla zdrowej aktywności komórkowej, szczególnie w komórkach o wysokim zapotrzebowaniu na energię, takich jak te w układzie nerwowym i mięśniach. W związku z tym dysfunkcja mitochondriów jest związana z niezliczonymi chorobami neurodegeneracyjnymi i ogólnie starzeniem się. Caenorhabditis elegans są potężnym systemem modelowym do wyjaśniania wielu zawiłości funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne jest silnym wskaźnikiem funkcji mitochondriów, a niedawno opracowane respirometry oferują najnowocześniejszą platformę do pomiaru oddychania w komórkach. W tym protokole udostępniamy technikę analizy żywych, nienaruszonych C. elegans. Protokół ten obejmuje okres ~ 7 dni i obejmuje etapy (1) hodowli i synchronizacji C. elegans, (2) przygotowania związków do wstrzyknięcia i uwodnienia sond, (3) ładowania leku i równoważenia wkładu, (4) przygotowania płytki testowej robaków i przebiegu testu oraz (5) analizy danych po eksperymencie.

Wprowadzenie

Adenozynotrójfosforan (ATP), główne źródło energii komórkowej, jest wytwarzany w mitochondriach przez enzymy w łańcuchu transportu elektronów (ETC) znajdującym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Pirogronian, kluczowy metabolit wykorzystywany do produkcji mitochondrialnego ATP, jest importowany do macierzy mitochondrialnej, gdzie ulega dekarboksylacji w celu wytworzenia acetylokoenzymu A (CoA). Następnie acetylo-CoA wchodzi w cykl kwasu cytrynowego, w wyniku czego powstaje dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH), kluczowa cząsteczka nośnika elektronów. Gdy elektrony z NADH są przekazywane do tlenu przez ETC, protony gromadzą się w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, co powoduje generowanie gradientu elektrochemicznego w poprzek błony. Protony te będą następnie przepływać z przestrzeni międzybłonowej przez ten gradient elektrochemiczny z powrotem do macierzy mitochondrialnej przez pory protonowe syntazy ATP, napędzając jej rotację i syntezę ATP1 (Rysunek 1).

Funkcja mitochondriów nie ogranicza się do produkcji energii, ale jest również kluczowa dla homeostazy wapnia, wychwytywania reaktywnych form tlenu (ROS) i apoptozy, krytycznie pozycjonując ich funkcję w zdrowiu organizmu2. Funkcję mitochondriów można ocenić za pomocą różnych testów, w tym między innymi analiz mierzących potencjał błony mitochondrialnej, poziomy ATP i ROS oraz stężenia wapnia w mitochondriach. Jednak testy te zapewniają pojedynczy obraz funkcji mitochondriów i dlatego mogą nie zapewniać kompleksowego obrazu zdrowia mitochondriów. Ponieważ zużycie tlenu podczas wytwarzania ATP zależy od niezliczonych sekwencyjnych reakcji, służy on jako doskonały wskaźnik funkcji mitochondriów. Co ciekawe, zaobserwowano różnice w tempie zużycia tlenu w wyniku dysfunkcji mitochondriów3,4,5.

Wskaźniki zużycia tlenu (OCR) żywych próbek mogą być mierzone za pomocą technik, które można ogólnie podzielić na dwie grupy: amperometryczne czujniki tlenu i luminofory na bazie porfiryny, które mogą być gaszone przez tlen6. Amperometryczne czujniki tlenu są szeroko stosowane do pomiaru OCR w hodowanych komórkach, tkankach oraz w systemach modelowych, takich jak C. elegans. Jednak luminofory zawierające respirometry na bazie porfiryny mają następujące zalety: (1) pozwalają na porównanie obok siebie dwóch próbek w trzech egzemplarzach, (2) wymagają mniejszej wielkości próbki (np. 20 robaków na studzienkę w porównaniu z ~2000−5000 robaków w komorze)7, oraz (3) respirometr można zaprogramować tak, aby wykonywał cztery różne wstrzyknięcia związków w żądanych momentach podczas całego przebiegu doświadczalnego, eliminując potrzebę ręcznej aplikacji.

W tym protokole opisane są kroki związane z użyciem respirometru z czujnikiem tlenu na bazie porfiryny do pomiaru OCR u żywych, nienaruszonych C. elegans. Chociaż istnieje pisemny protokół do korzystania z respirometru o dużej przepustowości o dużej przepustowości8, protokół ten został dostosowany do użytku z bardziej przyjaznym dla budżetu, dostępnym i mniejszym instrumentem. Protokół ten jest szczególnie przydatny do oceny różnicy w OCR między dwoma szczepami, w przypadku których wysokoprzepustowe badania przesiewowe nie są wymagane, a ich stosowanie byłoby nadmierne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd pełnego protokołu.

1. Wzrost i synchronizacja populacji nicieni9,10

  1. Przenieś larwy L4 o pożądanym tle genetycznym (np. N2 [typ dziki] i zwierzęta sel-12) na płytki pożywki hodowlanej nicieni (NGM) (patrz Tabela 1 dla przepisu) świeżo wysiane trawnikiem Escherichia coli (OP50)11. Użyć co najmniej dwóch płytek 100 mm lub trzech płytek 60 mm dla każdego odkształcenia. Inkubować robaki w odpowiedniej temperaturze wzrostu (między 15–25 °C) przez 3–4 dni lub do momentu, gdy płytki zostaną zagęszczone dużą liczbą jaj i grawitacyjnych robaków.
  2. Zmyć jaja i robaki z płytek za pomocą około 6 ml buforu M9 (przepis znajduje się w tabeli 1) na 100 mm płytkę nicieni i przenieść je za pomocą szklanych pipet Pasteura do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml dla każdego szczepu. Obracaj te probówki przez 3 minuty przy 6,180 x g i odessaj bufor M9, zatrzymując tylko osady zwierząt i jaj.
  3. Dodać 3-4 ml roztworu wybielacza (przepis znajduje się w Tabeli 1) do każdej probówki i z przerwami wirować przez 6 minut. Dodać bufor M9, aby napełnić każdą probówkę i wirować przy 6,180 x g przez 1 minutę i odsysać supernatant. Powtórzyć to płukanie M9 trzy razy i przenieść granulki jaj do świeżej probówki o pojemności 15 ml zawierającej około 9 ml buforu M9.
  4. Zsynchronizuj świeżo wyklute robaki, nutując w temperaturze 20 °C przez 16–48 godzin. Obracaj te rurki w temperaturze 6 180 x g przez 1,5 minuty i połóż zsynchronizowane zwierzęta L1 na indywidualnych płytkach NGM, świeżo obsianych trawnikiem OP50 (około 6 000–10 000 zwierząt na płytkę 100 mm) i utrzymuj w temperaturze 20 °C.
  5. Zwierzęta te osiągną stadium larwalne L4 po ~42 godzinach. W tym czasie przenieś larwy L4 za pomocą platynowego kilofa na płytki NGM z nasionami OP50 zawierające 0,5 mg/ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR), aby zapobiec wytwarzaniu przez nie potomstwa.
    UWAGA: Upewnij się, że w ramach eksperymentu wszystkie szczepy są synchronizowane przez podobny czas. Zabieg FUdR sterylizuje zwierzęta i zapobiega składaniu jaj i produkcji potomstwa, co może mieć wpływ na OCR. Te wysterylizowane zwierzęta zostaną przeanalizowane następnego dnia (dzień 1 dorosłe zwierzęta po ~66 godzinach) do testu. Doniesiono, że FUdR wpływa na fizjologię i długość życia niektórych zmutowanych robaków. Dlatego należy to wziąć pod uwagę, gdy lek jest używany do sterylizacji12,13,14. Robaki można również sterylizować za pomocą mutacji feminizujących, takich jak fem-1 (hc17) lub fem-3 (e2006). Jednak mutacje te mogą wpływać na funkcję mitochondriów.

2. Przygotowanie związków do wstrzykiwania i hydratacja sond

UWAGA: Podczas testu mierzone są zarówno podstawowe, jak i maksymalne tempo oddychania nicieni. Maksymalne oddychanie jest wyzwalane u zwierząt po dodaniu cyjanku karbonylu-4 (trifluormetoksy)fenylohydrazonu (FCCP), jonoforu rozprzęgającego, który zaburza potencjał błony mitochondrialnej, a tym samym syntezę ATP poprzez transport protonów przez błonę mitochondrialną, umożliwiając jednocześnie pompowanie protonów, transport elektronów i zużycie tlenu4,15 odłączony od syntezy ATP (Rysunek 1). Ostatnim etapem testu jest dodanie azydku sodu (NaN3), leku, który hamuje kompleksy IV i V w ETC, co pozwala określić oddychanie niemitochondrialne16 (Rysunek 1). Poniższe kroki można wykonać dzień przed właściwym testem.

  1. Przygotować 1 ml roztworów podstawowych FCCP (10 mM w dimetylosulfotlenku [DMSO]: 1000x końcowe stężenie testowe) i NaN3 (400 mM w dH2O: 10x końcowe stężenie testowe) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Przeprowadź krzywą stężenia, aby zoptymalizować stężenie FCCP wymagane do uzyskania maksymalnej odpowiedzi OCR dla każdego instrumentu i ustawienia laboratoryjnego.
  2. Uwodnić wkład czujnika, dodając 200 μl dH2O do każdej studzienki (i otaczającego zbiornika) w płytce, upewniając się, że sondy czujnika są zanurzone w dH2O i przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Sondy nabojowe można pozostawić zanurzone do 72 godzin, ale w przypadku długotrwałego uwodnienia płytki należy owinąć folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C. Jeśli nawodnienie przez noc nie jest możliwe, wkład z czujnikiem należy nawodnić przez co najmniej 4 godziny przed badaniem.
  3. Wyłącz element grzejny w interfejsie respirometru i przechowuj instrument w inkubatorze o temperaturze 15 °C na noc, aby obniżyć temperaturę rdzenia w instrumencie, aby zapobiec przegrzaniu zwierząt podczas testu.
    UWAGA: Respirometr jest wyposażony w element grzejny, ale nie może być chłodzony. W inkubatorze o temperaturze 15 °C respirometr będzie miał stabilną temperaturę w zakresie 18–22 °C, która jest zdrową temperaturą dla utrzymania C. elegans.

3. Ładowanie narkotyków i równoważenie nabojów

  1. Odpipetować i wyrzucić dH2O używane do uwodnienia sond czujników i zastąpić je 200 μl roztworu kalibru (pH 7,4) w każdym dołku. Rozcieńczyć roztwór podstawowy FCCP do 100 μM FCCP w dH2O i dodać 20 μl rozcieńczonego roztworu do portu wtryskowego A we wkładzie czujnika. Dodać 22 μl 400 mM azydku sodu do portu B wkładu czujnika.
  2. Włącz respirometr i na ekranie głównym wybierz Start; pojawi się strona szablonów. Na stronie szablonów wybierz opcję Pusty lub wcześniej zaprojektowany szablon; pojawi się strona Grupy. Na stronie Grupy wybierz studzienki A i H jako studzienki tła i przypisz pozostałe 6 dołków do odpowiednich grup zgodnie z planem eksperymentalnym.
  3. Naciśnij strzałkę w prawym dolnym rogu, aby przejść do strony Protokół. Na stronie Protocol (Protokół) upewnij się, że wybrano przyciski Equilibrate, Basal (Podstawowy) i Injections 1 (Wstrzyknięcia) 1 i 2. Na tej stronie dostosuj liczbę odczytów podstawowego OCR, a także maksymalnego OCR (po wstrzyknięciu 1 z FCCP) i niemitochondrialnego OCR (po wstrzyknięciu 2 z azydkiem sodu).
    UWAGA: Każdy pomiar jest poprzedzony etapem mieszania i oczekiwania, a ramy czasowe dla tych parametrów przedstawiono w Tabeli 2.
  4. Wybierz strzałkę w prawym dolnym rogu, a pojawi się monit o załadowanie płytki wkładu czujnika. Upewnij się, że płytka wkładu czujnika jest załadowana we właściwej orientacji, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie przypomnienia. Respirymetr będzie teraz równoważył nabój.
    UWAGA: Ta równowaga zapewnia wystarczająco dużo czasu na umieszczenie zwierząt do badania w odpowiednich dołkach płytki komórkowej.

4. Przygotowanie płytki ślimakowej i przebiegu testu

  1. Dodać 200 μl buforu M9 do każdego z 8 dołków płytki komórkowej oraz do zbiorników otaczających studzienki.
  2. Zbierz ~100 robaków z każdego szczepu na nieobsiane płytki NGM i odstaw na 2-3 minuty. Zwilż koniec platynowego kilofa buforem M9 i wybierz 20 zwierząt zsynchronizowanych pod względem wieku do studzienek B-G, pozostawiając puste studzienki A i H w tle.
    UWAGA: Po załadowaniu każdej studni odczekaj około 2 minut, aby zwierzęta mogły osiedlić się na dnie studni. Zaleca się również przeprowadzenie krzywej liczby ślimaków w celu optymalizacji liczby ślimaków na studzienkę dla każdego instrumentu i ustawień laboratoryjnych.
  3. Do tej pory respirometr powinien być skalibrowany i klikając OK na ekranie, płytka zawierająca bufor kalibracyjny zostaje wysunięta i można ją wyjąć z respirometru, podczas gdy wkład czujnika pozostaje wewnątrz przyrządu. Zastąp tabliczkę kalibru tabliczką zawierającą zwierzęta. Załaduj tabliczkę i zamknij drzwi, naciskając Kontynuuj i pozwól testowi działać.

5. Analiza danych po eksperymencie

  1. Po zakończeniu testu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie i wyjmij płytkę ogniwa oraz wkład czujnika, a następnie włóż dysk flash do portu USB, aby zapisać dane przebiegu w formacie .war. Wyjmij wkład czujnika i pozwól zwierzętom osiąść na dnie studzienek przez około 2 minuty. Umieść płytki komórkowe pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym i policz liczbę zwierząt w studzience.
  2. Otwórz oprogramowanie analityczne na komputerze i otwórz kartę normalizacja, aby znormalizować OCR do liczby zwierząt. Zastosuj odpowiednie etykiety dla różnych grup na karcie modyfikacji i wyeksportuj plik jako plik Prism do dalszej analizy.
    UWAGA: Średnia z pierwszych pięciu pomiarów przed dodaniem FCCP to podstawowy OCR, podczas gdy średnia z pięciu pomiarów po dodaniu FCCP to maksymalny OCR, a średnia z ostatnich pięciu pomiarów (należy wykonać co najmniej dwa pomiary) po dodaniu azydku sodu to częstość oddychania niemitochondrialnego. Test należy powtórzyć trzy razy, aby zapewnić odtwarzalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie opisanego w niniejszym dokumencie protokołu pozwoliło na oznaczenie OCR zwierząt typu dzikiego oraz trzech różnych szczepów mutantów sel-12. Gen sel-12 koduje ortolog preseniliny u C. elegans17. Mutacje w ludzkiej presenilinie są najczęstszym zaburzeniem genetycznym związanym z rozwojem rodzinnej postaci choroby Alzheimera18. Nasze badania wykazały podwyższone poziomy wapnia mitochondrialnego u zwierzą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oddychanie mitochondrialne jest wnikliwym wskaźnikiem funkcji mitochondriów; Dlatego możliwość pomiaru wskaźników zużycia tlenu w systemie biologicznym, zarówno in vitro, jak i in vivo, jest bardzo cenna. Respirometry wykrywają poziom tlenu za pomocą luminoforów na bazie porfiryny, które są gaszone przez tlen lub za pomocą amperometrycznych czujników tlenu, które polegają na wytwarzaniu prądu elektrycznego proporcjonalnego do ciśnienia tlenu. Elektroda Clarka należy do tej drugiej kategorii i była szeroko stosowana w lit...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Kevinowi Bittmanowi za jego wskazówki w ustanowieniu Seahorse XFp w laboratorium. Prace te zostały GM088213 wsparte przez National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki Petriego 100 mm, 60 mmKord-Valmark Labware Products2900, 2901
Probówki wirówkowe 1,5 mlGlobe Scientific6285
15 ml probówki stożkoweCorning430791
22 & razy; 22 mm Szkiełko nakrywkoweGlobe Scientific1404-10
50 mlCorning430829
AgarFisher ScientificBP1423-2
Bacto peptonBD, Bacto211677
Bacto tryptonBD, Bacto211705
Ekstrakt drożdżowy BactoBD, Bacto212705
BleachGeneric
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Fisher ScientificC79-500
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP)Abcamab120081
CholesterolFisher ScientificC314-500
Woda dejonizowana (dH2O)
Dimetylosulfotlenek dimetylu (DMSO)Thomas ScientificC987Y85
Szklane pipety PasteuraKrackeler Scientific6-72050-900
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4· 7H2O)Fisher ScientificBP213-1
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-1
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
Chlorek soduFisher ScientificBP358-10
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher ScientificBP359-500
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-1
Analizator Seahorse XFpAgilent
Seahorse XFp FluxPakAgilent103022-100
Azydek soduSigma-AldrichS2002

Bibliografia

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940(2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
  7. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
  9. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
  10. Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
  12. Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
  13. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
  14. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
  15. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
  16. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  17. Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
  18. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
  19. Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
  20. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Współczynnik zużycia tlenuC. elegansoddychanie mitochondrialnesynchronizacja nicienianaliza respirometrycznawstrzykiwanie lekunormalizacja danychpodstawowy OCRmaksymalny OCRpozamitochondrialny OCR
Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.