Artykuł metodologiczny

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

DOI:

10.3791/59282

⸱

18 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwestie bioetyczne związane z manipulacją embrionalnymi komórkami macierzystymi hamują postęp w dziedzinie badań medycznych. Z tego powodu bardzo ważne jest pozyskiwanie dorosłych komórek macierzystych z różnych tkanek, takich jak tkanka tłuszczowa, pępowina, szpik kostny i krew. Wśród możliwych źródeł szczególnie interesująca jest miazga zęba, ponieważ jest łatwa do uzyskania ze względów bioetycznych. Rzeczywiście, ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej (hDPSC) są rodzajem dorosłych komórek macierzystych zdolnych do różnicowania się w komórkach podobnych do neuronów i można je uzyskać z trzeciego zęba trzonowego u zdrowych pacjentów (13-19 lat). W szczególności miazgę zębową usunięto za pomocą koparki, pocięto na małe plasterki, potraktowano kolagenazą IV i wyhodowano w kolbie. Aby indukować różnicowanie neuronów, hDPSC stymulowano EGF/bFGF przez 2 tygodnie. Wcześniej wykazaliśmy, że podczas procesu różnicowania zawartość komórkowego białka prionowego (PrPC) w hDPSC wzrosła. Analiza cytofluorymetryczna wykazała wczesną ekspresję PrPC, która wzrastała po procesie różnicowania neuronów. Ablacja PrPC przez siRNA PrP zapobiegała różnicowaniu neuronów indukowanemu przez EGF/bFGF. W tym artykule pokazujemy, że w miarę ulepszania metod izolacji, separacji i hodowli in vitro hDPSC za pomocą kilku prostych procedur, uzyskano bardziej wydajne klony komórek i zaobserwowano ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na dużą skalę. Pokazujemy również, w jaki sposób hDPSC, uzyskane metodami szczegółowo opisanymi w protokole, są doskonałym modelem eksperymentalnym do badania procesu różnicowania neuronalnego MSCs oraz późniejszych procesów komórkowych i molekularnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste zostały wyizolowane z kilku tkanek, w tym szpiku kostnego, krwi pępowinowej, ludzkiej miazgi zębowej, tkanki tłuszczowej i krwi1,2,3,4,5,6. Jak donosi kilku autorów, hDPSC wykazują przyleganie do plastiku, typową morfologię podobną do fibroblastów. Reprezentują one wysoce heterogeniczną populację z odrębnymi klonami i różnicami w zdolności proliferacyjnej i różnicowej7,8. hDPSC wyrażają specyficzne markery dla mezenchymalnych komórek macierzystych (tj. CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), są ujemne dla niektórych markerów hematopoetycznych (takich jak CD14 i CD19) i są zdolne do różnicowania wieloliniowego in vitro9,10,11.

Kilku autorów wykazało, że te komórki są w stanie różnicować się w komórki podobne do neuronów za pomocą różnych protokołów, które obejmują dodawanie NGF, bFGF, EGF w połączeniu z określonymi pożywkami i suplementami7,12. Ponadto wiele białek bierze udział w procesie różnicowania neuronów, a wśród nich kilka prac wykazuje istotną rolę i znaczącą ekspresję komórkowego białka prionowego (PrPC), zarówno w embrionalnych, jak i dorosłych komórkach macierzystych13,14. PrPC reprezentuje plejotropową cząsteczkę zdolną do pełnienia różnych funkcji wewnątrz komórek, takich jak metabolizm miedzi, apoptoza i odporność na stres oksydacyjny15,16,17,18,19,20,21,22.

W naszym poprzednim artykule23, badaliśmy rolę PrPC w procesie różnicowania neuronów hDPSCs. W rzeczywistości hDPSC wyrażają przedwcześnie PrPC, a po różnicowaniu neuronalnym można było zaobserwować dodatkowy wzrost. Inni autorzy wysunęli hipotezę o możliwej roli PrPC w procesach różnicowania neuronów komórek macierzystych. Rzeczywiście, PrPC napędza różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony, oligodendrocyty i astrocyty24. Celem pracy było zwrócenie uwagi na metodykę pozyskiwania komórek macierzystych z miazgi zęba, proces jej różnicowania oraz rolę PrPC podczas różnicowania neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzecie zęby trzonowe użyte w badaniu zostały wycięte od pacjentów (13-19 lat) bez wcześniejszej historii spożywania narkotyków lub alkoholu, wszyscy niepalący i z odpowiednią higieną jamy ustnej. W dniu wyjaśnienia na Wydziale Nauk Stomatologicznych i Szczękowo-Twarzowych Uniwersytetu "Sapienza" w Rzymie uzyskano świadomą zgodę pacjentów lub rodziców. Świadoma zgoda została uzyskana w oparciu o względy etyczne i zgodę komisji etycznej.

1. Ekstrakcja zęba i miazgi zębowej

  1. Przygotowanie odpowiedniego podłoża do konserwacji lub transportu.
    1. Przygotuj średnio niskie stężenie glukozy (DMEM-L) firmy Dulbecco's Modified Eagle z L-glutaminą (494,5 ml).
    2. Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (1%) i 0,5 ml amfoterycyny (0,1%).
  2. Pobrać trzeci ząb trzonowy od pacjenta, szybko spłukać go PBS, włożyć do probówki o pojemności 15 ml z pożywką i przenieść do laboratorium w czasie krótszym niż 2 godziny.
  3. Pod kapturem zagrożenia biologicznego otwórz ząb za pomocą noża, przechodząc przez cięcie koronalne równolegle i stycznie przez dach komory miazgi.
  4. Delikatnie usuń miazgę za pomocą małej koparki i umieść ją w probówce.
  5. Przemyć trzykrotnie PBS i odwirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

2. Przetwarzanie pulpy zębowej i uwalnianie komórek macierzystych

  1. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w roztworze Hanka i umieścić go na szalce Petriego. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  2. Przygotowanie roztworu kolagenazy typu IV.
    1. Przygotować 0,8 ml DMEM-L.
    2. Rozpuść 1 mg kolagenazy typu IV w 0,8 ml DMEM-L i wiruj przez kilka minut.
    3. Dodaj DMEM-L do 1 ml, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg / mL.
    4. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μM.
  3. Usunąć roztwór Hanka przez odwirowanie przy 2,500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i podzielić miazgę na małe plasterki około 1 mm każdy za pomocą jednorazowego skalpela.
  4. Umieścić plastry miazgi na szalce Petriego i inkubować z 1 ml kolagenazy typu IV przez 15 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  5. Pożywka (500 ml).
    1. Do 445 ml DMEM-L z L-glutaminą.
    2. Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (10%).
    3. Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (1%).
  6. Odwirować próbkę o stężeniu 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w pożywce (etap 2.5) i wyhodować w kolbie T25 przeznaczonej dla komórek macierzystych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .

3. Hodowla i rozmnażanie komórek macierzystych

  1. Codziennie sprawdzaj kulturę, a po 3 dniach wzrostu obserwuj różne klony przylegających komórek w kolbie.
  2. Co 3 dni zmieniaj pożywkę hodowlaną.
  3. Między 7 a 12 dniem, gdy przylegające komórki osiągną zbieżność, odłącz je, traktując komórki 1 ml trypsyny-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie używając skrobaka do komórek.
  4. Dodać 4 ml (w stosunku 1:5) pożywki hodowlanej (krok 2.5), aby zatrzymać działanie trypsyny.
  5. Odwirować zawiesinę komórek przez 6 minut przy 259 x g, usunąć supernatant i umieścić komórki w kolbie T25 do rozmnażania.
    nuta: Co 3 dni komórki osiągają zbieg
    6. .
  6. Rozmnażaj komórki do 21 lub 28 dni (około 6-8 pasaży), aby uniknąć obecności komórek innych niż komórki macierzyste w hodowli.
  7. Odłączyć komórki za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie zeskrobując. Odwirować zawiesinę komórek przez 6 minut przy 259 x g.
  8. Usunąć supernatant i przebadać komórki do analizy cytofluorymetrycznej (krok 6).

4. Przejściowe wyciszanie PrPC przez siRNA

  1. Hoduj hDPSCss na płytkach 6-dołkowych (2 x 105 komórek/ml) z 2 ml pożywki hodowlanej (krok 2.5) przez 24 godziny.
  2. Następnego dnia przygotuj pożywkę siRNA PrP (400 μL).
    1. Do sterylnej probówki dodać 384 μl DMEM-L.
    2. Dodaj 1 μl dla każdego rodzaju siRNA PrP do DMEM-L, aby uzyskać końcowe stężenie 5 nM (4 siRNA PrP zostały użyte i zweryfikowane przez dostawcę, aby zagwarantować skuteczność knockdown ≥70%).
    3. Dodać 12 μl odczynnika do transfekcji do DMEM-L.
    4. Mieszaninę należy wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcyjnych.
  3. Dodać 400 μl pożywki siRNA PrP do każdej próbki i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Nie odrzucając pożywki siRNA PrP, dodać 1,6 ml (stosunek 1 do 5) pożywki hodowlanej (krok 2.5).
  5. Pozostawić komórki na 72 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Usunąć supernatant i przemyć 3 razy 2 ml PBS w temperaturze pokojowej uwagi.
  7. Dodać 2 ml pożywki do hodowli neuronów przez 7 i/lub 14 dni (krok 5.1).
  8. Zmieniaj pożywkę do hodowli neuronów co 3 dni.
    nuta: Roztwór siRNA PrP należy wymieniać za każdym razem, gdy wymienia się pożywkę do hodowli neuronów.
  9. Pod koniec czasu przemyć 3 razy 2 ml PBS w RT i przetestować antygeny powierzchniowe neuronów za pomocą analizy Western Blot.

5. Proces indukcji neuronalnej hDPSC

  1. Preparat pożywki do hodowli neuronów (500 ml).
    1. Przygotuj 444,7 ml podłoża podstawowego opracowanego dla komórek nerwowych.
    2. Do pożywki dodaj 50 ml suplementu bez surowicy, stosowanego w celu wspierania długoterminowej żywotności embrionalnych i dorosłych neuronalnych komórek macierzystych (10%).
    3. Dodać 200 μl zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) (stężenie końcowe 40 ng/ml) i 100 μl naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) do pożywki (stężenie końcowe 20 ng/ml).
    4. Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (1%) do pożywki.
  2. Hoduj hDPSC na płytkach 6-dołkowych (2 x 105 komórek/ml) do 28 dni od oddzielenia miazgi i stymuluj je 2 ml pożywki do hodowli neuronów.
  3. Co 3 dni wyrzucić supernatant, przemyć 3 razy 2 ml PBS w temperaturze pokojowej i zastąpić 2 ml pożywki do hodowli neuronalnej.
  4. Po 7 i/lub 14 dniach odłączyć komórki za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie za pomocą skrobaka.
  5. Dodać 4 ml (w stosunku 1:5) pożywki hodowlanej (krok 2.5), aby zatrzymać działanie trypsyny.
  6. Przeprowadzić test na obecność antygenów powierzchniowych neuronów (etap 6) lub ekspresji białka prionowego (etap 7) za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

6. Charakterystyka hDPSC za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Wybierz antygeny specyficzne dla zrębu mezenchymalnego (MSC) lub neuronalne antygeny powierzchniowe.
  2. Hodować hDPSC na płytkach 6-dołkowych (2 x 105 komórek/ml) z 2 ml pożywki hodowlanej (etap 2.5).
  3. Odłączyć hDPSC po 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej lub po 14 dniach pożywki do hodowli neuronów (krok 5.1) z 1 ml trypsyny-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie skrobać.
  4. Dodać 4 ml (w stosunku 1:5) pożywki hodowlanej (krok 2.5), aby zatrzymać działanie trypsyny i odwirować przy 259 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć kolejne 2 razy 2 ml PBS w temperaturze pokojowej.
  5. Utrwalić niepoddane działaniu lub poddane działaniu substancji hDPSC z 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przepuszczalność hDPSCS z 0,1% (v/v) niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wykonać blokowanie z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w 1 ml PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyj 3 razy 1 ml PBS i inkubuj komórki z anty-CD105 (1:100/5 x 105 komórek), anty-CD44 (1:100/5 x 105 komórek), anty-STRO-1 (1:100/5 x 105 komórek), anty-CD90 (1:100/5 x 105 komórek), anty-CD73 (1:100/5 x 105 komórek), anty β3-tubuliną (1:100/5 x 105 komórek), anty-NFH (1:100/5 x 105 komórek) i anty-GAP43 (1:100/5 x 105 komórek) mAb przez 1 godzinę w RT.
  9. Przemyć komórki 3 razy 1 ml PBS i inkubować z anty-mysim PE (1:50/5 x 105 komórek) lub anty-króliczym CY5 (1:50/5 x 105 komórek) mAb przez dodatkowe 1 godzinę w RT.
  10. Użyj przeciwciał drugorzędowych do bramkowania komórek immunopozytywnych (anty-mysi PE lub anty-królik CY5 mAb) i przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj co najmniej 20 000 zdarzeń.

7. Ocena ekspresji PrPC w hDPSC za pomocą analizy cytometrii przepływowej

  1. Hodować hDPSCss na 6-dołkowych płytkach (2 x 105 komórek/ml) z 2 ml pożywki hodowlanej (etap 2.5).
  2. Odłączyć hDPSC po 21 i 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej i po 7 i/lub 14 dniach za pomocą pożywki do hodowli neuronów (krok 5.1) z 1 ml trypsyny-EDTA i zatrzymać działanie trypsyny, jak opisano w kroku 6.4. Utrwalić próbki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przepuszczalność 0,1% (v/v) niejonowego surfaktantyny PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i zabarwić komórki króliczym anty-PrP mAb EP1802Y (1:50/5 x 105 komórek) mAb przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować z anty-króliczym CY5 (1:50/5 x 105 komórek) mAb przez dodatkowe 1 godzinę w RT.
  4. Przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj co najmniej 20 000 zdarzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury izolacji i separacji hDPSC od miazgi zębowej, uzyskanej z trzeciego zęba trzonowego, są złożonymi procesami, w których małe zmiany mogą prowadzić do zgubnych rezultatów. W tym artykule korzystamy z protokołu Arthura i wsp.12 z kilkoma ulepszeniami. Reprezentatywny schemat procedur jest pokazany w Rysunek 1.

hDPSCs reprezentuje heterogeniczną populację komórek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy skupiliśmy się na metodologii izolacji i różnicowania neuronalnego hDPSC; ponadto oceniliśmy rolę PrPC w tym procesie. Istnieje kilka metod izolowania i różnicowania hDPSC w komórkach podobnych do neuronów i krytycznych etapach tego procesu. hDPSC są zdolne do różnicowania w kilku liniach, takich jak chondroblasty, adipocyty, osteoblasty i neurony. W naszej pracy zbadaliśmy mechanizmy różnicowania neuronów i obecności PrPC. Jak omówiono powyżej, komórki te wyrażają typowe mezenchymalne a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez "Fondazione Varrone" i Rieti University Hub "Sabina Universitas" dla Vincenzo Mattei.

Rysunek 5 (A, B) przedrukowany za zgodą wydawcy Taylor & Francis Ltd z: Rola wielocząsteczkowego kompleksu białka prionowego-EGFR podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych pochodzących z miazgi zębowej. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018 4 marca. Taylor & Francis Sp. z o.o.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór amfoterycyny BSigma-AldrichA2942Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych, jest to polienowy antybiotyk przeciwgrzybiczy firmy Streptomyce
Anti-B3tubulinaCell Signaling Technology #4466Jedna z sześciu izoform B-tubuliny, ulega wysokiej ekspresji podczas rozwoju płodowego i pourodzeniowego, pozostając wysoko w obwodowym układzie nerwowym
Anty-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), główna glikoproteina ludzkiego śródbłonka naczyniowego, jest integralnym białkiem błonowym typu I z dużym obszarem zewnątrzkomórkowym, hydrofobowym regionem transbłonowym i krótkim cytoplazmatycznym ogonem
Przeciwciała anty-CD44MilliporeCBL154-20ulDodatnie markery komórkowe skierowane przeciwko mezenchymalnym komórkom macierzystym
Anty-CD73 Technologia sygnalizacji komórkowej 13160CD73 to glikoproteina o mocy 70 kDa zakotwiczona w glikozylofosfatydyloinozytolu, związana z błoną, która katalizuje hydrolizę zewnątrzkomórkowych monofosforanów nukleozydów do bioaktywnych nukleozydów
Anty-CD90MilliporeCBL415-20ulDodatnie markery komórkowe przeciwciała skierowane przeciwko mezenchymalnym komórkom macierzystym
Anty-GAP43 Technologia sygnalizacji komórkowej #8945Jest specyficznym dla układu nerwowego, związanym ze wzrostem białkiem w stożkach wzrostu i obszarach o wysokiej plastyczności
Anty-mysie PE Abcamab7003Jest przeciwciałem stosowanym w cytometrii przepływowej lub analizie FACS
Anty-NFH Technologia sygnalizacji komórkowej #2836Jest przeciwciałem, które wykrywa endogenne poziomy całkowitego białka Neurofilament-H
Anty-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Monoklonalny królik [EP 1802Y] do białka prionowego PrP
Anty-królik CY5 Abcamab6564Jest przeciwciałem stosowanym w cytometrii przepływowej lub analizie FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulDodatnie markery komórkowe przeciwciała skierowane przeciwko mezenchymalnym komórkom macierzystym
B27 Supp XF CTSGibco firmy life technologiesA14867-01B-27  może być stosowany do wspomagania indukcji ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSC) z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), ekspansji hNSC, różnicowanie hNSC i utrzymanie dojrzałych zróżnicowanych neuronów w hodowli
cytometru przepływowego BD Accuri C6 BD BiosciencesAC6531180187Cytometr przepływowy wyposażony w laser niebieski (488 nm) i laser czerwony (640 nm)
Oprogramowanie BD Accuri C6 BD BiosciencesKontroluje system cytometru przepływowego BD Accuri C6 w celu pozyskiwania danych, generowania statystyk i analizowania wyników
bFGFPeproThec, DBA100-18Bpodstawowy czynnik wzrostu fibroblastów 
Wirówka CL30RTermo fisher Scientific11210908jest to urządzenie, które służy do separacji płynów, gazów lub cieczy, na podstawie gęstości
Inkubator CO2 3541Termo fisher Scientific317527-185zapewnia optymalne i powtarzalne warunki wzrostu dla kultur komórkowych
Kolagenaza typu IV Life Technologies17104019Kolagenaza to proteaza, która rozszczepia wiązanie między neutralnym aminokwasem (X) a glicyną w sekwencji Pro-X-Glyc-Pro, która występuje z dużą częstotliwością w kolagenie
Skalpel jednorazowy Swann-Morton501Służy do cięcia tkanek
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyroctan
EGF PeproThec, DBAAF-100-15Epidermalny czynnik wzrostu 
Surowica bydlęcapłodu Gibco firmy life technologies10270-106FBS jest popularnym suplementem pożywki, ponieważ zapewnia szeroki wachlarz funkcji w hodowli komórkowej. FBS dostarcza składniki odżywcze, czynniki wzrostu i przyłączania oraz chroni komórki przed uszkodzeniem oksydacyjnym i apoptozą przez mechanizmy, które są trudne do odtworzenia w systemach pożywek bezsurowicowych (SFM)
Filtropur BT50 0,2 500 ml Filtr butelkowySarstedt831,823,101jest to urządzenie, które służy do filtracji roztworów
Flexitube GeneSolution dla PRNPQiagenGS56214 siRNA dla genu Entrez 5621. Sekwencja docelowa nr 1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Rozwiązanie Hanka 1xGibco firmy life technologies240200083Podstawowa funkcja Hanks′ Zrównoważony roztwór soli ma na celu utrzymanie pH, a także równowagi osmotycznej. Dostarcza również wodę i niezbędne jony nieorganiczne do komórek
Odczynnik do transfekcji HiPerFect Odczynnik dotransfekcji Qiagen 301705 HiPerFect to unikalna mieszanka kationowych i obojętnych lipidów, która umożliwia efektywny wychwyt siRNA i efektywne uwalnianie siRNA wewnątrz komórek, co skutkuje wysokim knockdownem genu nawet przy użyciu niskich stężeń siRNA
Neurobasal A Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium to podstawowa pożywka przeznaczona do długotrwałego utrzymania i dojrzewania czystych neuronów mózgowych po urodzeniu i u dorosłych 
ParaformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyd jest stosowany do mocowania komórek i skrawków tkanek podczas zabiegów barwienia
Penicylina/Streptomycyna EurocloneECB3001D Stosuje się go do uzupełniania pożywek do hodowli komórkowych w celu kontroli zanieczyszczenia bakteryjnego
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami  (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS jest zrównoważonym roztworem soli stosowanym do obróbki i hodowli komórek ssaków. PBS służy do nawadniania, mycia i rozcieńczania komórek ssaków. Bufor fosforanowy utrzymuje pH w zakresie fizjologicznym
TC-Platte 6 studzienka, Komórka+,FSarstedt833,920,300Jest to powierzchnia wzrostu dla komórek adherentnych
Kolba do hodowli tkankowych T-25,Komórka +, Nasadka wentylowanaSarstedt833,910,302Kolba do hodowli tkankowych T-25, polistyren, Powierzchnia wzrostu Cell+ dla wrażliwych komórek przylegających, np. komórki pierwotne, szyja skośna, nasadka wentylacyjna, żółta, sterylna, Wolne od pirogenów, niecytotoksyczne, 10 szt./worek
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Szeroko stosowany niejonowy środek powierzchniowo czynny do odzysku składników membrany w łagodnych warunkach niedenaturacyjnych
Trypsyna-EDTA EurocloneECB3052D Trypsyna rozszczepia peptydy po stronie C-końcowej reszt aminokwasowych lizyny i argininy. Trypsyna służy do usuwania przylegających komórek z powierzchni hodowli
ProbówkaSarstedt62,554,502Probówka 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Zapewnia pełną ochronę środowiska i pracownika
ZEISS Axio Vert.A1 – Odwrócony  MikroskopZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 zapewnia wyjątkową cenę podstawową i może zapewnić wszystkie techniki kontrastu, w tym jasne pole, kontrast fazowy, PlasDIC, VAREL, ulepszony kontrast modulacyjny Hoffmana (iHMC), DIC i fluorescencję. Wyposażone w oświetlenie LED zapewnia delikatne obrazowanie komórek znakowanych fluorescencyjnie. Axio Vert.A1 jest ergonomicznie zaprojektowany do rutynowej pracy i wystarczająco kompaktowy, aby można go było umieścić w kapturach do hodowli tkankowych.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr bka kolagenaz IVanaliza cytometrycznaanaliza Western blotodrywanie trypsyn z EDTAstymulacja EGF i bFGFwyciszanie genu PrP za pomoc siRNApasa hodowli kom rkowych

Powiązane artykuły