Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus

Podsumowanie

W tym manuskrypcie ustaliliśmy metodę wysokoprzepustową do ilościowego oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej w hodowli biofilmu S. aureus z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej

Streszczenie

Fosfataza alkaliczna (ALP) jest powszechnym enzymem wyrażanym zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Katalizuje hydrolizę monoestrów fosforanowych z wielu cząsteczek o zasadowym pH i odgrywa nieodzowną rolę w metabolizmie fosforanów. U ludzi eukariotyczny ALP jest jednym z najczęściej wykorzystywanych sygnałów enzymatycznych w diagnozowaniu różnych chorób, takich jak cholestaza i krzywica. U S. aureus ALP jest wykrywany wyłącznie na błonie komórkowej; Jest również wyrażany jako forma wydzielnicza. Jednak niewiele wiadomo na temat jego funkcji w tworzeniu biofilmu.

Celem tego manuskryptu jest opracowanie szybkiego i wiarygodnego testu do pomiaru aktywności ALP w biofilmie S. aureus, który nie wymaga izolacji białka. Używając fosforanu p-nitrofenylu (pNPP) jako substratu, zmierzyliśmy aktywność ALP w biofilmie S. aureus utworzonym na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Aktywność opierała się na tworzeniu rozpuszczalnego produktu reakcji mierzonego absorbancją 405 nm. Wysoka przepustowość metody 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zapewnia czułą i powtarzalną metodę oznaczania aktywności ALP. Ten sam zestaw eksperymentalny można również rozszerzyć w celu pomiaru innych zewnątrzkomórkowych markerów molekularnych związanych z tworzeniem biofilmu.

Wprowadzenie

Fosfataza alkaliczna (ALP) jest powszechnie wyrażana zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych¹. Może katalizować hydrolizę monofosforanu z różnych cząsteczek, takich jak nukleotydy, białka, alkaloidy, estry fosforanowe i bezwodniki kwasu fosforowego. U ludzi eukariotyczny ALP jest obecny w wielu tkankach, w tym w wątrobie, kościach, jelitach i łożysku². Odgrywa ważną rolę w fosforylacji białek, wzroście komórek, apoptozie, procesach komórek macierzystych, a także w prawidłowej mineralizacji szkieletu. Eukariotyczny ALP jest również kluczowym wskaźnikiem w surowicy pod kątem obecności chorób w kościach, wątrobie i innych tkankach/narządach na podwyższonym poziomie^3,4.

Prokariotyczny ALP został wykryty w różnych komórkach bakteryjnych, w tym E. coli⁵, S. aureus^6,7 i niektórych powszechnych bakteriach żwacza w glebach⁸. Bakteryjna aktywność ALP została wykorzystana jako bioczujnik w wykrywaniu pestycydów, metali ciężkich⁹ i zanieczyszczenia bakteryjnego¹⁰. Wyrażenie konstytutywne ALP zostało użyte do identyfikacji Staphylococci¹¹ oraz do odróżnienia Serratia od Enterobacter¹². Ponadto sugeruje się, że konstytutywna produkcja ALP jest skorelowana z chorobotwórczością u gronkowców¹³. Chociaż ALP był badany w różnych warunkach^3,4, niewiele jest doniesień na temat jego aktywności i funkcji w kulturach biofilmów.

Udokumentowano, że biofilm ma inaczej funkcjonujące życie bakteryjne w porównaniu z jego wolno żyjącym odpowiednikiem w komórkach bakteryjnych¹⁴. U S. aureus tworzenie się biofilmu zostało zidentyfikowane w różnych stanach klinicznych i odpowiada za oporność na antybiotyki i przewlekły stan zapalny^15,16. Doniesiono, że w matrycy biofilmu znajduje się wiele cząsteczek, takich jak polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe i lipidy, ale mechanizm tworzenia biofilmu nie jest w pełni zrozumiały¹⁴. Aby zrozumieć rolę ALP w tworzeniu biofilmu, przeprowadziliśmy hodowlę biofilmów S. aureus na 96 dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i zmierzyliśmy aktywność ALP za pomocą para-nitrofenylofosforanu (pNPP).

Cząsteczka pNPP jest gotowym do użycia substratem dla ALP i jest szeroko stosowana do pomiaru aktywności ALP^6,17,18. Ten test kolorymetryczny opiera się na konwersji fosforanu para-nitrofenylu (pNPP) do para-nitrofenolu, w wyniku czego uzyskuje się kolorowy produkt o długości fali 405 nm. W porównaniu z innymi konwencjonalnymi testami ALP, takimi jak elektroforeza w żelu agarozowym¹⁹, wytrącanie aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) i WGA-HPLC²⁰, ten test jest wysoce specyficzny, czuły, łatwy do odtworzenia, a co najważniejsze, pozwala na wysoką przepustowość.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża

1. Przygotuj 1 l bulionu sojowego tryptycznego (TSB): Do 1 l wody destylowanej dodaj 15 g kazeiny trawionej przez trzustkę, 5 g papaicznego trawienia śruty sojowej, 3 g chlorku sodu, 2,5 g dekstrozy i 2,5 g fosforanu dipotasowego. Sterylizuj przed użyciem.
2. W przypadku agaru sojowego tryptycznego (TSA) dodaj 15 g agaru do 1 litra TSB, autoklawu. Następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie wlać w proporcji 20 ml na szalkę Petriego (100 mm x 15 mm).
3. Pożywka do hodowli biofilmu: Dodać 10 g glukozy do 1 l autoklawizowanego TSB. Sterylizować przez filtrację przy użyciu filtra 0,2 μm.

2. Tworzenie biofilmu S. aureus w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej

UWAGA: Biofilm S. aureus jest hodowany zgodnie z wcześniejszym opisem^6,21.

1. Zaszczepić jedną pojedynczą kolonię S. aureus z TSA w 10 ml TSB i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Rozcieńczyć nocną hodowlę w 10 ml TSB/glukozy (10 g/l) w stosunku 1:100 (v/v). Delikatnie wymieszaj, aby uzyskać stałe stężenie.
3. Przenieś 200 μl rozcieńczonej kultury do łącznie 18 dołków (więcej dla grup eksperymentalnych, taka kontrola bez biofilmu, aby zasugerować związek z aktywnością ALP⁶) z jednej płytki 96-dołkowej. Użyj trojaczków dla każdego punktu czasowego: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min i 75 min. Patrz krok 3.2.
4. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu wytworzenia biofilmu^6,21.
5. Zdekantować supernatant przez aspirację.
6. Przemyć każdą studzienkę 1x roztworem buforowym fosforanu (PBS, pH 7,4), odwirować przez 5 minut przy 15 000 x g i zdekantować supernatant przez aspirację.

3. Pomiar aktywności ALP w biofilmie S. aureus

UWAGA: Aktywność ALP została zmierzona zgodnie z opisem^6,18.

1. Dodać 75 μl buforowanego substratu ALP składającego się z dostępnego w handlu pNPP do każdej studzienki z kroku 2.6 i rozpocząć rejestrację czasu. Zapisz każdy punkt czasowy w trzech egzemplarzach.
2. Po inkubacji przez zróżnicowany czas: 0 min (kontrola), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min i 75 min odpowiednio, dodać 75 μl 5 M NaOH, aby zatrzymać reakcję.
3. Odwirować płytkę przez 5 minut przy 15 000 x g.
4. Przenieść 100 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej w celu pomiaru kolorymetrycznego.
5. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 405 nm za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Użyj studzienek punktu czasowego 0 min, aby kontrolować szum tła 405 nm.
6. Powtórz cały eksperyment na trzech pojedynczych płytkach 96-dołkowych.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje reprezentatywny wynik aktywności ALP z kultur biofilmu S. aureus na 96 dołkach do kultur tkankowych. Do każdej studzienki dodano 75 μl dostępnego na rynku roztworu pNPP i inkubowano w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przez różne czasy (odpowiednio 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min i 75 min) dodano 75 μl 5 M NaOH w celu zatrzymania reakcji. Produkt został następnie zmierzony w 96-dołkowym czytniku płytek przy długości fali 4...

Dyskusja

W naszym teście użyliśmy pNPP jako substratu ALP. Jest to roztwór roboczy przeznaczony do testu ELISA i nie jest wymagane rozcieńczanie. Po hydrolizie przez ALP powstaje żółty produkt, który można zmierzyć przy 405 nm. Pod koniec reakcji enzymatycznej na krótko odwirowaliśmy 96-dołkową płytkę i przenieśliśmy supernatant na świeżą 96-dołkową płytkę w celu zmierzenia absorbancji za pomocą czytnika płytek. Odkryliśmy, że ten dodatkowy etap wirowania ma kluczowe znaczenie, ponieważ zwiększa spójność absorbancji przy 405 nm, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	VWR	9002-18-0
Wirówka Eppendorf	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
Granulki NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrofenylofosforan (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typowe stężenia płynnych substratów pNPP, często stosowanych w testach immunoenzymatycznych (ELISA), wahają się od 10 do 50 mM. Podobnie jak w przypadku większości gotowych do użycia płynnych substratów pNPP, takich jak ten zastosowany tutaj, dokładne stężenie pNPP nie jest ujawniane ze względu na jego zastrzeżony charakter.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Czytnik płytek	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Agar sojowy tryptyczny            15 g/l TSB	VWR	9002-18-0
Tryptyczny bulion sojowy:          g/L Trawienie kazeiny przez trzustkę............ 15.0 Papaic Digest z mączki sojowej......... 5.00 Chlorek sodu.............................. 3.00 Dekstroza........................................   2,50 Fosforan dipotasowy.................. 2.50	VWR	90006-098
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	BD	6902D09	Dno w kształcie litery U