Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59297

⸱

18 kwietnia 2019

 , 
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

W tym artykule

Podsumowanie

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Streszczenie

Skóra jest największym organem ciała i pełni wiele funkcji. Skóra działa jako fizyczna bariera i obrońca organizmu oraz reguluje funkcje organizmu. Biomimetyka to imitacja modeli, systemów i elementów natury w celu rozwiązywania złożonych problemów ludzkich1. Biomimetyka skóry jest użytecznym narzędziem w badaniach nad chorobami in vitro i medycynie regeneracyjnej in vivo. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) charakteryzują się nieograniczoną proliferacją i zdolnością różnicowania do trzech listków rozrodczych. Ludzkie iPSC są generowane z różnych komórek pierwotnych, takich jak komórki krwi, keratynocyty, fibroblasty i inne. Wśród nich komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej (CBMC) pojawiły się jako alternatywne źródło komórek z perspektywy allogenicznej medycyny regeneracyjnej. CBMC są przydatne w medycynie regeneracyjnej, ponieważ typowanie ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) jest niezbędne dla systemu bankowania komórek. Udostępniamy metodę różnicowania CBMC-iPSC w keratynocyty i fibroblasty oraz do generowania organoidu 3D skóry. Keratynocyty i fibroblasty pochodzące z CBMC-iPSC mają cechy podobne do pierwotnej linii komórkowej. Organoidy skóry 3D są generowane przez nałożenie warstwy naskórka na warstwę skóry właściwej. Poprzez przeszczepienie tego organoidu skórnego 3D generowany jest humanizowany model myszy. Badanie to pokazuje, że 3D ludzki organoid skóry pochodzący z iPSC może być nowym, alternatywnym narzędziem do badań dermatologicznych in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Skóra pokrywa najbardziej zewnętrzną powierzchnię ciała i chroni organy wewnętrzne. Skóra pełni różne funkcje, w tym ochronę przed patogenami, wchłanianie i magazynowanie wody, regulowanie temperatury ciała i wydalanie produktów przemiany materii2. Przeszczepy skóry można sklasyfikować w zależności od źródła skóry; Przeszczepy z użyciem skóry od innego dawcy nazywane są przeszczepami allogenicznymi, a przeszczepy z użyciem własnej skóry pacjenta są autoprzeszczepami. Chociaż autoprzeszczep jest preferowanym sposobem leczenia ze względu na niskie ryzyko odrzucenia, biopsje skóry są trudne do wykonania u pacjentów z ciężkimi zmianami chorobowymi lub niewystarczającą liczbą komórek skóry. U pacjentów z ciężkimi oparzeniami do pokrycia dużych obszarów potrzeba trzykrotnie większej liczby komórek skóry. Ograniczona dostępność komórek skóry z organizmu pacjenta prowadzi do sytuacji, w których konieczny jest przeszczep allogeniczny. Przeszczep allogeniczny jest tymczasowo stosowany do czasu przeprowadzenia przeszczepu autologicznego, ponieważ zwykle jest odrzucany przez układ odpornościowy gospodarza po około 1 tygodniu3. Aby przezwyciężyć odrzucenie przez układ odpornościowy pacjenta, przeszczepy muszą pochodzić ze źródła o tej samej tożsamości immunologicznej co pacjent4.

Ludzkie iPSC są nowym źródłem komórek do terapii komórkami macierzystymi5. Ludzkie iPSC są generowane z komórek somatycznych przy użyciu czynników przeprogramowujących, takich jak OCT4, SOX2, Klf4 i c-Myc6. Wykorzystanie ludzkich komórek iPS pozwala przezwyciężyć etyczne i immunologiczne problemy związane z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC)7,8. Ludzkie iPSC mają pluripotencję i mogą różnicować się w trzy warstwy zarodkowe9. Obecność HLA, kluczowego czynnika w medycynie regeneracyjnej, determinuje odpowiedź immunologiczną i możliwość odrzucenia10. Zastosowanie iPSC pochodzących od pacjentów rozwiązuje problemy związane z ograniczeniem źródeł komórkowych i odrzuceniem przez układ odpornościowy. CBMC pojawiły się również jako alternatywne źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej11. Obowiązkowe typowanie HLA, które ma miejsce podczas bankowania CBMC, może być łatwo wykorzystane do badań i transplantacji. Co więcej, homozygotyczne iPSC typu HLA mogą mieć szerokie zastosowanie u różnych pacjentów12. Bank CBMC-iPSC to nowatorska i skuteczna strategia terapii komórkowej i allogennej medycyny regeneracyjnej12,13,14. W tym badaniu wykorzystujemy CBMC-iPSC, zróżnicowane na keratynocyty i fibroblasty, i generujemy warstwowe warstwy skóry 3D. Wyniki tego badania sugerują, że organoid skóry 3D pochodzący z CBMC-iPSC jest nowym narzędziem do badań dermatologicznych in vitro i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt Laboratoryjnych, Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych oraz Wytycznymi i Zasadami Eksperymentów z Gryzoniami dostarczonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Katolickiego Uniwersytetu Korei. Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board Katolickiego Uniwersytetu Korei (CUMC-2018-0191-01). W 2017 r. IACUC i Wydział Zwierząt Laboratoryjnych (DOLA) Katolickiego Uniwersytetu Korei, Kampus Songeui akredytowały laboratorium Korea Excellence Animal Koreańskiej Agencji ds. Żywności i Leków, a w 2018 r. uzyskały pełną akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).

1. Różnicowanie komórek skóry od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Średni preparat
    UWAGA: Przechowuj całe podłoże w temperaturze 4 °C w ciemnym otoczeniu przez okres do 3 miesięcy. Przefiltruj całe medium za pomocą systemu filtrów polieterosulfonowych 0,22 μm przed użyciem do sterylizacji. Wszystkie podłoża były dostępne w łącznej objętości 500 ml.
    1. Przygotować KDM1 (pożywkę do różnicowania keratynocytów 1). Wymieszaj Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/F12 (3:1) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,3 mmol/l kwasu L-askorbinowego, 5 μg/ml insuliny i 24 μg/ml adeniny.
    2. Przygotuj KDM2 (pożywkę do różnicowania keratynocytów 2). Zmieszaj zdefiniowaną pożywkę bez keratynocytów bez surowicy (patrz tabela materiałów) z 0,3 mmol/l kwasu L-askorbinowego, 5 μg/ml insuliny i 10 μg/ml adeniny.
      UWAGA: Zdefiniowana pożywka wolna od keratynocytów w surowicy jest zoptymalizowana pod kątem wspomagania wzrostu i ekspansji keratynocytów.
    3. Przygotować KDM3 (pożywkę do różnicowania keratynocytów 3). Zmieszanie zdefiniowanej pożywki bez keratynocytów z pożywką bez surowicy keratynocytów (1:1) Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
      UWAGA: Pożywka wolna od keratynocytów w surowicy jest zoptymalizowana pod kątem wzrostu i utrzymania keratynocytów.
    4. Przygotować FDM1 (pożywkę do różnicowania fibroblastów 1). Wymieszaj pożywkę DMEM/F12 (3:1) z 5% FBS, 5 μg/ml insuliny, 0,18 mM adeniny i 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
    5. Przygotować FDM2 (pożywkę do różnicowania fibroblastów 2). Wymieszaj pożywkę DMEM/F12 (1:1) z 5% FBS i 1% aminokwasów endogennych.
    6. Przygotować EP1 (podłoże nabłonkowe 1). Wymieszaj DMEM/F12 (3:1) z 4 mM L-glutaminy, 40 μM adeniny, 10 μg/ml transferyny, 10 μg/ml insuliny i 0,1% FBS.
    7. Przygotuj EP2 (podłoże nabłonkowe 2). Wymieszaj EP1 i 1,8 mM chlorku wapnia.
    8. Przygotować EP3 (podłoże nabłonkowe 3, podłoże rogowaciowe). Wymieszaj pożywkę F12 z 4 mM L-glutaminy, 40 μM adeniny, 10 μg/ml transferyny, 10 μg/ml insuliny, 2% FBS i 1,8 mM chlorku wapnia.
  2. Wytwarzanie ciała embrionalnego
    1. Wygeneruj CBMC-iPSC przy użyciu protokołu pokazanego w poprzednim badaniu12.
    2. Pokryj naczynia hodowlane, używając witronektyny. Przygotuj 5 ml do pokrycia naczynia o średnicy 100 mm.
      1. Rozmrozić i ponownie zawiesić 50 μl 0,5 mg/ml witronektyny (końcowe stężenie: 5 μg/ml) z 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodaj roztwór do naczyń i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Zassać materiał powłokowy przed użyciem (nie wyschnąć).
    3. Utrzymywać iPSC pochodzące z CBMC na pokrytej witronektyną płytce o średnicy 100 mm i codziennie zmieniać pożywkę iPSC (E8) w temperaturze 37 °C z 10% CO2 .
    4. Generuj ciała embrionalne (EB) przy użyciu protokołu pokazanego w poprzednim badaniu15 (opisanego krótko w następujący sposób). Rozpręż iPSC, zmieniając pożywkę, aż komórki osiągną 80% konfluencji. Przy 80% konfluencji usuń podłoże i przemyj PBS.
    5. Potraktuj komórki 1 ml 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty i zebrać komórki przy użyciu 3 ml pożywki E8. Odwirować komórki przy 250 x g przez 2 min.
    6. Odessać supernatant i nałożyć 5 ml pożywki E8 na komórki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 1 x 106 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g przez 2 min.
    7. Ponownie zawiesić przeniesione komórki za pomocą 2,5 ml pożywki do tworzenia EB z inhibitorem 10 μM kinazy związanej z Rho (ROCK). Upuść 1 x 104 komórki (25 μl/kroplę) na niepowlekaną pokrywkę płytki hodowlanej za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 10–100 μl. Utwórz 100 EB z 1 x 106 komórek (1 x 104 komórki/1 EB). Odwróć naczynie i zawieś na kropli na pokrywce.
      UWAGA: Inhibitor ROCK jest potrzebny na etapie przyłączania w procesie konserwacji i różnicowania. Inhibitor ROCK należy dodać tylko na etapie agregacji EB.
    8. Kropelki inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 dzień.
    9. Następnego dnia zbierz 100 EB i użyj ich do różnicowania. Umyć pokrywkę płytki pożywką iPSC (pożywka E8) lub PBS i zebrać jej zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj EB na poziomie RT przez 1 minutę, aby je uspokoić. Odessać supernatant, ponownie zawiesić EB pożywką E8 i utrzymywać je na szalce Petriego o średnicy 90 mm aż do różnicowania.
  3. Różnicowanie CBMC-iPSC w keratynocyty
    UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem różnicowania keratynocytów od CBMC-iPSC, zobacz Rysunek 1A.
    1. Zbierz 100 EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pożywką iPSC lub PBS. Utrzymuj na poziomie RT przez 1 minutę, aby ustabilizować EB. Upewnij się, że osiadają na dnie stożkowej rurki. Odessać supernatant i ponownie zawiesić EB pożywką E8 z 1 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4). Przenieść EB na płytkę Petriego o średnicy 90 mm i utrzymywać je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 dzień.
    2. Pokryj naczynia hodowlane, używając kolagenu typu IV. Przygotuj 5 ml kolagenu typu IV, aby pokryć naczynie o średnicy 100 mm.
      1. Rozmrozić i ponownie zawiesić roztwór kolagenu typu IV (końcowe stężenie: 50 μg/ml) z 0,05 N HCl. Dodać roztwór do szalek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przed użyciem odessać materiał powlekający (nie wyschnąć).
        UWAGA: Przed użyciem talerzy umyj naczynia 3x PBS, aby usunąć kwas.
    3. Zebrać EB (krok 1.3.1) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i utrzymywać je w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby je ustabilizować. Upewnij się, że osiądą na dnie stożkowej probówki, odessaj supernatant i ponownie zawieś EB w 6 ml KDM1 z 10 μM inhibitorem ROCK. Przenieś EBs do pokrytej kolagenem płytki 100 mm typu IV.
      UWAGA: Inhibitor ROCK należy dodawać tylko na etapie przyłączania EB.
    4. Między 0 a 8 dniami zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM1 z 3 μM kwasem retinowym (RA) i 25 ng/ml BMP4 i EGF. Utrzymuj EB na poziomie 37 °C przy 5% CO2 .
    5. Między 9 a 12 dniem zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM2 z 3 μM RA, 25 ng/ml BMP4 i 20 ng/ml EGF.
    6. Między 13 a 30 dniem zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM3 z 10 ng/ml BMP4 i 20 ng/ml EGF.
  4. Różnicowanie CBMC-iPSC w fibroblasty
    UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem różnicowania fibroblastów od CBMC-iPSC, zobacz Rysunek 2A.
    1. Pokryj naczynia hodowlane, używając macierzy błony podstawnej. Przygotuj 5 ml do pokrycia naczynia o średnicy 100 mm.
      1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej (stężenie końcowe: 600 ng/ml) i rozcieńczyć ją podłożem DMEM/F12. Dodać roztwór do szalek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zassać materiał powłokowy przed użyciem (nie wyschnąć).
    2. Zebrać 100 EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety z pożywką iPSC lub PBS. Utrzymuj na poziomie RT przez 1 minutę, aby ustabilizować EB. Upewnij się, że osiadają na dnie stożkowej rurki. Usunąć supernatant.
    3. Ponownie zawiesić EB za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl w 6 ml FDM1 z inhibitorem 10 μM ROCK. Przenieść EBs (z pożywką) na naczynie o średnicy 100 mm pokrytej matrycą z membraną podstawną i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Odświeżaj FDM1 co drugi dzień przez 3 dni.
      UWAGA: Inhibitor ROCK należy dodawać tylko na etapie przyłączania EB.
    4. Dodać 0,5 nM białka morfogenetycznego kości 4 (BMP 4) do FDM1 między 4 a 6 dniem.
    5. W 7 dniu zmieniaj pożywkę na FDM2 co drugi dzień przez 1 tydzień.
    6. W dniu 14 dodać 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 min. Zebrać komórki za pomocą 3 ml FDM2 i odwirować przy 250 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml FDM1.
    7. Policz komórki za pomocą hemocytometru, ponownie zawieś 2 x 106 komórek za pomocą pożywki FDM1 i przenieś komórki do niepowlekanego naczynia. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.
    8. Pokryj naczynia kulturowe, używając kolagenu typu I. Przygotuj 5 ml do pokrycia naczynia o średnicy 100 mm. Rozcieńczyć roztwór kolagenu typu I (końcowe stężenie: 50 μg/ml) w 0,02 N kwasie octowym. Dodać roztwór do szalek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Odessać materiał powlekający przed użyciem (nie wyschnąć).
      UWAGA: Przed użyciem talerzy umyj naczynia 3x PBS, aby usunąć kwas.
    9. W 21 dniu dodać 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zebrać komórki z 3 ml FDM1 i odwirować przy 250 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml FDM1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 2 x 106 komórek do pokrytej kolagenem płytki 100 mm typu I z pożywką FDM1. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.
    10. W dniu 28 dodać 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zebrać komórki za pomocą 3 ml FDM1 i odwirować przy 250 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml FDM1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 2 x 106 komórek do niepowlekanego naczynia z pożywką FDM1. Utrzymuj komórkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.
      UWAGA: fibroblasty pochodzące z iPSC proliferują jak pierwotna linia komórkowa fibroblastów i przechodzą do 10 pasaży. W tym badaniu do dalszej analizy wykorzystaliśmy fibroblasty pochodzące z iPSC o dwóch do pięciu pasażach.

2. Zastosowanie zróżnicowanych komórek pochodzących z hiPSC

  1. Generowanie organoidu 3D skóry
    1. Zneutralizowany kolagen typu I przygotuj na lodzie, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Jako stężenie końcowe użyj 3 mg / ml dla kolagenu typu I (stężenie podstawowe kolagenu typu I wynosi 3,47 mg / ml) i upewnij się, że końcowa objętość mieszaniny wynosi 5 ml. Oblicz objętość 10x PBS (objętość końcowa/10 = 0,5 ml). Oblicz objętość kolagenu typu I, który ma być użyty (objętość końcowa x końcowe stężenie kolagenu / stężenie kolagenu podstawowego = 5 ml x 3 mg / ml / 3,47 mg / ml = 4,32 ml). Obliczyć objętość 1 N NaOH (objętość kolagenu do użycia x 0,023 ml = 0,1 ml). Obliczyć objętość dH2O (objętość końcowa - objętość kolagenu - objętość 10x PBS - objętość 1 N NaOH = 5 ml - 4,32 ml - 0,5 ml - 0,1 ml = 0,08 ml). Wymieszaj zawartość tubki i trzymaj ją na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.
    2. Dodać 1 ml EDTA do fibroblastów pochodzących z iPSC z kroku 1.4.10 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zebrać oderwane komórki, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść 2 x 105 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki fibroblastów pochodzących z iPSC w 1,5 ml FDM1 i zneutralizować roztwór kolagenu typu I (1:1).
      UWAGA: Delikatnie wymieszaj roztwór, aby uniknąć pęcherzyków.
    3. Umieścić wkładkę membranową na mikropłytce 6-dołkowej, przenieść mieszaninę do wkładki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Nie przesuwaj płyt.
    4. Po potwierdzeniu żelowania dodaj 2 ml pożywki na górę wkładki i 3 ml na dno studzienki. Inkubować macierz fibroblastów i kolagenu w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5-7 dni, aż żelowanie zostanie zakończone i nie będzie się kurczyć.
    5. Po całkowitym żelowaniu odłącz keratynocyty pochodzące z iPSC (z kroku 1.3.6) za pomocą EDTA. Dodać 1 ml EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zbierz oderwane komórki, policz je za pomocą hemocytometru i przenieś 1 x 106 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 2 min.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 50-100 μl podłoża nabłonkowego o niskiej zawartości wapnia 1 (EP1).
    7. Odessać całe podłoże w matrycy (patrz krok 2.1.5) i zasiać 1 x 106 komórek keratynocytów pochodzących z iPSC na każdej warstwie fibroblastów. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 30 min.
      UWAGA: Nie przesuwaj płytki i nie dodawaj żadnego podłoża do przyłączenia keratynocytów.
    8. Dodaj 2 ml EP1 na górę wkładki i 3 ml EP1 na dno studzienki.
    9. Po 2 dniach odessać całą pożywkę z płytki wkładanej do membrany i zmieniać pożywkę na normalny wapń EP2 przez 2 dni.
    10. Po 2 dniach odessać całą pożywkę i dodać 3 ml pożywki rogowacowej tylko na dno, aby wytworzyć granicę faz powietrze-ciecz.
    11. Utrzymuj organoid skórny 3D przez okres do 14 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj podłoże co drugi dzień. Zbierz organoid skóry 3D, przecinając krawędź wkładki i użyj go do dalszych badań nad barwieniem i przeszczepem skóry.
  2. Przeszczep skóry
    1. Przeprowadzić znieczulenie wziewne na myszach NOD/scid (samce, 6 tygodni), przy użyciu standardowej, instytucjonalnie zatwierdzonej metody. Aby uzyskać przeszczep skóry, ogol futro na grzbiecie skóry każdej myszy.
    2. Usuń fragment skóry myszy o wymiarach 1 cm x 2 cm za pomocą zakrzywionych nożyczek z kleszczami.
    3. Umieść organoid skórny 3D pochodzący z CBMC-iPSC w miejscu ubytku i zszyj metodą opatrunku wiązanego z jedwabnymi szwami.
    4. Obserwuj myszy przez 2 tygodnie i poświęć je do analizy histologicznej. Protokół barwienia został zweryfikowany w poprzednich badaniach16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skóra składa się w znacznej mierze z naskórka i skóry właściwej. Głównym typem komórek naskórka są keratynocyty, natomiast głównym typem komórek skóry właściwej są fibroblasty. Schemat różnicowania keratynocytów przedstawiono na Rycina 1AKomórki CBMC-iPSC były hodowane w naczyniu powlekanym witronektyną (Rysunek 1B). W niniejszym badaniu zróżnicowaliśmy CBMC-iPSC w keratynocyty i fibroblasty z wykorzystaniem tworzenia ciałek zar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ludzkie iPSC zostały zasugerowane jako nowa alternatywa dla spersonalizowanej medycyny regeneracyjnej17. Spersonalizowane iPSC pochodzące od pacjenta odzwierciedlają charakterystykę pacjenta, którą można wykorzystać do modelowania choroby, badań przesiewowych leków i przeszczepu autologicznego18,19. Zastosowanie iPSC pochodzących od pacjenta może również przezwyciężyć problemy związane z komórkami pierwotnymi, brakiem odpowiedniej liczby k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Opieki Zdrowotnej, Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Spraw Rodzinnych, Republika Korei (H16C2177, H18C1178).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdeninaSigmaA2786Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów
AggreWell Medium (pożywka do tworzenia EB)STEMCELL05893Tworzenie
EB Przeciwciało anty-fibronektynoweabcamab23750Marker fibroblastów
Przeciwciało anty-KRT14abcamab7800Marker keratynocytów
Przeciwciało anty-Loricrinabcamab85679Marker warstwy rogowej naskórka
Przeciwciało anty-p63abcamab124762Marker keratynocytów
Przeciwciało anty-wimentynySanta cruzsc-7558Marker fibroblastów
TAŚMA WSPOMAGAJĄCA ELASTYCZNĄ TKANINĘJohnson & Johnson-Bandage
Macierz błony podstawnej (Matrigel)BD354277Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów
JEDWABszew AILEEESK617Przeszczep skóry
CaCl2SigmaC5670Składnik podłoża nabłonkowego do organoidu skóry 3D
Kolagen typu IBD354236organoid
skóry 3DKolagen typu IVSanta-cruzsc-29010Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów
Zdefiniowane keratynocyty-Pożywka wolna surowicyGibco10744-019Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów
DMEM, wysoka glukozaGibco11995065Składnik pożywki
różnicującej DMEM/F12 PodłożeGibco11330-032Składnik pożywka różnicująca
Essential 8 pożywkaGibcoA1517001pożywka iPSC
FBS, KwalifikowanyCorning35-015-CVSkładnik pożywki różnicującej dla fibroblastów i keratynocytów
Suplement Glutamax Gibco35050061Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów
InsulinaInvtrogen12585-014Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów i keratynocytów
Standardowe zakrzywione nożyczki IrisProfessionalPC-02.10Instrument chirurgiczny
Podłoże wolne od keratynocytówGibco17005-042Składnik podłoża różnicującego do keratynocyt
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydratSigmaA8960Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów
MEM Aminokwas endogennyGibco1140050Składnik pożywki różnicującej do fibroblastów
Meriam Kleszcze Kciuk 16 cmHIROSEHC 2265-1Narzędzie chirurgiczne
NOD. CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Szczep myszy do przeszczepu skóry
szalka Petriego 90 mmHyundai MicroH10090Wyroby z tworzywa sztucznego
Rekombinowany człowiek BMP-4R& D314-BPSkładnik pożywki różnicującej dla keratynocytów
Rekombinowane ludzkie białko EGFR& D236-EGSkładnik pożywki różnicującej dla keratynocytów
Kwas retinowySigmaR2625Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Wyroby z tworzyw sztucznych
TransferynaSigmaT3705Składnik podłoża nabłonkowego dla organoidu 3D skóry
Wkładki membranowe pokryte kolagenem Transwell-COL& nbsp;CorningCLS3492Wyroby z tworzywa sztucznego do organoidów skórnych 3D 
VitronectinLife technologiesA14700Kultura iPSC
Y-27632 Hodowla dichlorowodorkupeprotechu1293823iPSC

Bibliografia

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49(2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008).
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988(2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mononuklearne komórki krwi pępowinowejtrójwymiarowy organoid skóryróżnicowanie keratynocytówróżnicowanie fibroblastówtworzenie ciał embrionalnychkolagen typu Ikolagen typu IVinhibitor ROCKbiałko morfogenetyczne kości 4
Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.