Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59299

⸱

15 marca 2019

 , 
1Department of Biology, Wesleyan University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Streszczenie

Siatkówka poczwarki Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania procesów morfogenetycznych podczas rozwoju. W niniejszej pracy przedstawiono rzetelny protokół preparacji delikatnej siatkówki poczwarki Drosophila. Nasze podejście chirurgiczne wykorzystuje łatwo dostępne narzędzia do mikrodysekcji do otwierania poczwarek i precyzyjnej ekstrakcji kompleksów oko-mózg. Można je utrwalić, poddać immunohistochemii, a siatkówki następnie zamontować na szkiełkach mikroskopowych i zobrazować, jeśli celem jest wykrycie struktur komórkowych lub subkomórkowych. Alternatywnie, nieutrwalone siatkówki można wyizolować z tkanki mózgowej, poddać lizie w odpowiednich i wykorzystać do elektroforezy żelu białkowego lub ekstrakcji mRNA (odpowiednio w celu oceny ekspresji białka lub genu). Opanowanie opisanego protokołu mikrodysekcji może wymagać znacznej praktyki i cierpliwości, ale po opanowaniu protokół umożliwia stosunkowo szybką izolację głównie nieuszkodzonych siatkówk.

Wprowadzenie

Siatkówka Drosophila składa się z około 750 ommatidia otoczonych komórkami pigmentowymi ułożonymi w siatkę o strukturze plastra miodu1,2,3,4. Każde ommatidium zawiera osiem neuronów fotoreceptorowych, cztery czopki wydzielające soczewki i dwie pierwotne komórki pigmentowe. Wokół każdego ommatidium znajdują się komórki kratowe wytwarzające pigment i czuciowe grupy szczeciny. Ze względu na swoją postmitotyczną naturę i stereotypowy układ sześciokątny, siatkówka poczwarki Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania procesów morfogenetycznych, w tym adhezji komórek5,6,7,8,9,10 i apoptoza11,12,13,14,15.

Kilka opublikowanych protokołów wykorzystuje ciśnienie powietrza do ekstrakcji kompleksów oko-mózgowych z poczwarek Drosophila16,17,18. Opisany tutaj protokół wykorzystuje narzędzia do mikrodysekcji do starannego i precyzyjnego izolowania kompleksów oko-mózg w celu uzyskania nieuszkodzonej tkanki siatkówki. Ma to kluczowe znaczenie, jeśli siatkówki mają być wykorzystywane do analiz morfologicznych, białkowych lub ekspresji genów, ponieważ uszkodzenie siatkówki może powodować stres komórkowy lub śmierć, co może modyfikować fenotyp komórkowy lub ekspresję genów. Dodatkowo, po ćwiczeniach, w ciągu 10 do 15 minut można wyizolować od 6 do 10 kompleksów oko-mózg, co ułatwia zminimalizowanie zmienności wieku i etapu rozwoju wypreparowanej tkanki oka.

Opisany poniżej protokół utrwalania, barwienia immunologicznego i całościowego montażu jest odpowiedni do przygotowania oczu Drosophila do mikroskopii fluorescencyjnej. Siatkówki mogą być inkubowane z przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład, przeciwciała przeciwko składnikom połączenia adherens mogą być wykorzystane do wizualizacji obwodów wierzchołkowych komórek, dzięki czemu można ocenić cechy, w tym typ, kształt i układ komórek19. Przed fiksacją oczy mogą zostać odcięte od mózgu w celu ekstrakcji białka do analizy zachodniej lub RNA do wykorzystania w qRT-PCR lub sekwencjonowaniu RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie tkanek

  1. Ustaw krzyżówki Drosophila (jak opisano wcześniej20) lub szczepy Drosophila specyficzne dla hodowli, aby uzyskać poczwarki o pożądanym genotypie. Aby upewnić się, że duża liczba poczwarek pojawi się przypadkowo, należy założyć te kultury much w dwóch egzemplarzach na bogatych w składniki odżywcze pożywkach spożywczych lub standardowych pożywkach spożywczych obficie uzupełnionych pastą drożdżową.
  2. Utrzymuj kultury Drosophila w temperaturze 25 °C. W przypadku krzyżówek wykorzystujących system UAS-GAL4, GMR-GAL4 jest idealnym sterownikiem wyrażającym się w komórkach krążka larwalnego oka za bruzdą morfogenetyczną i przez cały okres rozwoju poczwarki21,22,23,24. Krzyżówka UAS-lacZ X GMR-GAL4 służy jako idealna krzyżówka kontrolna, ponieważ napędza ekspresję nieendogennego i obojętnego białka β-galaktozydazy.
  3. Użyj końcówki 6-calowej bambusowej szyny, która została zwilżona wodą destylowaną, aby delikatnie podnieść białe poczwarki (Rysunek 1B) z boku zdrowych fiolek hodowlanych (Rysunek 1A) i umieść w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (Rysunek 1C).
  4. Umieść probówki w plastikowym pudełku na końcówki do pipet wraz z małym kawałkiem chusteczki nasączonej wodą destylowaną, aby utrzymać komorę w wystarczającej wilgotności, aby chronić poczwarki przed wysuszeniem (Rysunek 1D). Inkubować poczwarki w temperaturze 25 °C aż do rozbiorów.
  5. Użyj suchej 6-calowej szyny bambusowej, aby delikatnie wypchnąć poczwarki z probówki mikrowirówki na czarną miskę sekcyjną. Połóż świeży kawałek taśmy dwustronnej na naczyniu preparacyjnym z dala od poczwarek.
  6. Używając kleszczy, ostrożnie umieść poczwarki grzbietową stroną do góry (tj. wieczkami skierowanymi do góry, Rysunek 1B) na taśmie (Rysunek 2A). Upewnij się, że poczwarki dobrze przylegają do taśmy.
    UWAGA: Wilgoć na opakowaniu poczwarki utrudni bezpieczne przyleganie do taśmy, w takim przypadku pozwól poczwarkom wyschnąć na powietrzu przed umieszczeniem na taśmie dwustronnej.

2. Sekcja kompleksów oko-mózg

  1. Użyj kleszczy, aby usunąć wieczko z każdej poczwarki (Rysunek 2C).
  2. Użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby pokroić lub rozciąć skrzynkę poczwarki każdej poczwarki. Otwórz klapę koperty poczwarki, aby odsłonić głowę, klatkę piersiową i przedni segment brzuszny, mocując krawędzie koperty poczwarki do taśmy dwustronnej (Rysunek 2C).
    UWAGA: Nie jest konieczne całkowite odsłanianie poczwarek.
  3. Przebij brzuch każdej poczwarki ostrymi kleszczami, aby chwycić zwierzę i wyjmij je z etui poczwarki (Rysunek 2C).
  4. Umieścić poczwarki na czarnym naczyniu preparacyjnym, z dala od taśmy, i zalać około 400 μl lodowatego roztworu buforowanego fosforanem (PBS, pH 7,4).
  5. Chwyć każdą poczwarkę za brzuch kleszczami, a nożyczkami do mikrodysekcji wykonaj czyste cięcie w przekroju poprzecznym przez całą klatkę piersiową, przecinając poczwarkę na pół (Rysunek 2D).
  6. Usunąć tylną resztkę każdej tuszy z PBS i odłożyć na bok na szalce do rozwarstwiania (nie wyrzucać, patrz krok 3.2.1).
  7. Używając dwóch par cienkich kleszczy, otwórz klatkę piersiową i głowę każdej poczwarki, aby odsłonić kompleks oko-mózg (ryc. 2E). Aby to zrobić, chwyć przecięte krawędzie nabłonka klatki piersiowej i stopniowo rozrywaj, aby otworzyć klatkę piersiową, a następnie torebkę głowy, odsłaniając kompleks oko-mózg i otaczającą tkankę tłuszczową.
  8. Nie chwytając tkanki, użyj kleszczy, aby skierować kompleks oko-mózg z dala od resztek torebki głowy lub zgarnij kompleks oko-mózg z rozerwanej torebki głowy.
    UWAGA: Kompleks oko-mózg ma kształt hantli, jest białawy i bardziej przezroczysty niż otaczający go kremowy tłuszcz (Rysunek 2B, E).
  9. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń większość tłuszczu związanego z kompleksami oko-mózg bez dotykania tkanki oka.

3. Przetwarzanie tkanek do immunofluorescencji

  1. Rozetnij co najmniej 6-10 poczwarek zgodnie z opisem (kroki 2.1-2.9).
    UWAGA: Trzy do czterech niezależnych powtórzeń każdej sekcji zwykle dostarczają wystarczających danych do przetestowania hipotezy.
  2. Mycie i utrwalanie
    1. Odetnij końcówkę końcówki pipety P20 lub P100 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~1 mm i nasmaruj, pipetując mieszaninę PBS i tłuszczu w górę iw dół. Tłuszcz ten można uzyskać z resztek tuszy usuniętych w kroku 2.6.
    2. Przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBS w 9-dołkowym szklanym naczyniu na lodzie. Do przenoszenia użyj nasmarowanej końcówki i mikropipety wyporowej P20 lub P100 do przenoszenia.
      UWAGA: Kompleksy oko-mózg przylegają do niesmarowanych końcówek podczas pipetowania i ulegają uszkodzeniu lub utracie.
    3. Usuń pozostały tłuszcz związany z tkanką oka, pipetując PBS w górę iw dół, aby delikatnie zawirować kompleksy oko-mózg. W tym i wszystkich kolejnych etapach mycia nie należy bezpośrednio pipetować kompleksów oko-mózg w górę i w dół, ponieważ spowoduje to uszkodzenie delikatnej tkanki oka.
    4. Przenieść kompleksy oko-mózg w minimalnej objętości (<20 μl) PBS do co najmniej 250 μl utrwalacza. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 35 minut na lodzie.
      UWAGA: Do tego transferu można użyć tej samej nasmarowanej końcówki przygotowanej w kroku 3.1.1.
    5. Za pomocą tej samej końcówki pipety przenieś kompleksy oko-mózg do studzienki zawierającej ~400 μL PBS. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół, a następnie inkubować przez 5-10 minut na lodzie do umycia. Powtórz krok prania co najmniej dwa razy.
      UWAGA: Kompleksy oko-mózg można utrzymywać przez kilka godzin w końcowym płukaniu PBS, na lodzie lub w temperaturze 4 °C, przed przejściem do kroku 3.3.1.
  3. Barwienie przeciwciał
    1. Aby zablokować tkankę przed ekspozycją na roztwory przeciwciał, przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT. Do transferu należy użyć nasmarowanej końcówki i mikropipety wyporowej P20 lub P100. Inkubować przez 10 do 60 minut na lodzie.
    2. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając odpowiednie przeciwciała w PBT. Ponieważ kompleksy oko-mózg inkubuje się w 10 μl podwielokrotności roztworu przeciwciała, przygotowana objętość będzie powtórzeniem 10.
    3. Porcję 10 μl roztworu przeciwciał do czystej studzienki z 72-dołkową tacą mikrodołkową (patrz dyskusja).
    4. Odetnij końcówkę końcówki pipety P10 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i nasmaruj, pipetując PBT w górę iw dół.
    5. Przenieść nie więcej niż 5 kompleksów oko-mózg w objętości <3 μl PBS do każdego 10 μl roztworu przeciwciała za pomocą mikropipety P10 wyporowej powietrza i nasmarowanej końcówki.
    6. Homogenizować roztwór przeciwciała, pipetując roztwór w górę iw dół. Nie pipetuj kompleksów oko-mózg w górę i w dół, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki.
    7. Aby zminimalizować parowanie roztworu przeciwciała, umieść mały kawałek tkanki nasączonej wodą destylowaną w tacce mikrostudzienki i zamknij tackę (np. za pomocą dostarczonej pokrywki). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    8. Przenieś kompleksy oko-mózg z tacki mikrostudzienki do ~400 μl PBT w szklanym naczyniu z 9 dołkami, w celu umycia. Użyj mikropipety P10 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT (przygotuj zgodnie z opisem w kroku 3.3.4). Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie.
    9. Powtórz etap prania co najmniej dwa razy. Użyj mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg między roztworami myjącymi.
    10. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając odpowiednie przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem w PBT, zgodnie z wymaganiami. 100 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego jest wystarczające na partię 6-10 poczwarek. Podwielokrotność roztworu przeciwciał drugorzędowych umieścić w 9-dołkowym szklanym naczyniu preparacyjnym.
    11. Przenieś kompleksy oko-mózg do wtórnego roztworu przeciwciał. Do transferu należy użyć mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT.
    12. Kompleksy oko-mózg należy inkubować w wtórnym roztworze przeciwciał przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub 3-5 godzin w temperaturze 4 °C. Aby zapobiec bieleniu fluoroforów światłem, należy przykryć preparat folią.
      UWAGA: Optymalny czas inkubacji w roztworze przeciwciał drugorzędowych może się różnić w zależności od zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
    13. Przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT w 9-dołkowym szklanym naczyniu, aby umyć. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie. Ten etap prania należy powtórzyć co najmniej dwa razy.
  4. Wtórna fiksacja
    1. W celu wtórnego utrwalenia przenieść kompleksy oko-mózg do co najmniej 200 μl utrwalacza i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 35 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wtórne mocowanie usztywnia tkankę oka, co ułatwia montaż (krok 3.5).
    2. Użyj mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, do mycia przez 5 minut.
    3. Powtórz krok prania co najmniej raz.
    4. Użyj mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBS w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, do płukania przez 1-2 minuty. Utrzymuj tkankę w ruchu, pipetując PBS, ale nie tkankę, w górę iw dół, aby zapobiec osadzaniu się kompleksów oko-mózg i przyleganiu do szklanego naczynia podczas płukania PBS.
  5. Montażu
    1. Przenieś kompleksy oko-mózg do ~200 μL podłoża montażowego. Użyj mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg. Pozwól chusteczce zrównoważyć się w podłożu montażowym przez 1-2 godziny.
    2. Umieść kroplę 5-8 μl świeżego podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym.
    3. Wytnij końcówkę P10 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i użyj jej oraz mikropipety P10 z wyporem powietrza, aby przenieść kompleksy oko-mózg w 5-8 μl podłoża montażowego do kropli podłoża montażowego na szkiełku.
    4. Użyj dwóch igieł wolframowych, aby oddzielić oczy od płatów wzrokowych. Przypnij kompleks oko-mózg do szkiełka za pomocą solidnej wolframowej igły i odetnij każde oko od powiązanego z nim płata wzrokowego za pomocą cienkiej wolframowej igły (Rysunek 2F).
    5. Za pomocą cienkiej igły wolframowej należy przesunąć każde oko do powierzchni szkiełka mikroskopowego tak, aby podstawowa powierzchnia każdego oka przylegała do szkiełka. Delikatnie opuść czysty szkiełko nakrywkowe na chusteczkę i zabezpiecz lakierem do paznokci.
      UWAGA: Ułożenie oczu na szkiełku tak, aby znajdowały się blisko siebie lub w linii, ułatwi późniejszą mikroskopię.
    6. Zobrazuj siatkówki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej.
      UWAGA: Slajdy należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast zobrazowane.

4. Przygotowanie tkanki oka do Western Blotting:

  1. Rozbior 10-16 poczwarek (kroki 2.1-2.9) z następującymi modyfikacjami: a) zbierz i rozdziel poczwarki w dwóch partiach w odstępie 10-15 minut oraz b) rozsiej w PBS uzupełnionym inhibitorami proteazy i fosfatazy (PBS+pi).
  2. Przenieść kompleksy oko-mózg za pomocą mikropipety P20 lub P100 z wypornością powietrza i nasmarowanej końcówki (przygotowanej jak w kroku 3.2.1) do ~400 μl PBS+pi w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, w celu krótkiego spłukania.
    UWAGA: Ta nasmarowana końcówka może być używana do kolejnych kroków 4.3 i 4.4.
  3. Powtórz etap płukania dwukrotnie.
  4. Przenieś wszystkie kompleksy oko-mózg do ~400 μL lodowatego PBS+pi zdekantowanego na czyste czarne naczynie preparacyjne.
  5. Usuń każde oko z płatów wzrokowych za pomocą solidnej igły wolframowej (aby ustabilizować kompleks oko-mózg) i cienkiej żyletki lub nożyczek do mikrodysekcji, aby dokładnie odciąć każde oko od płata wzrokowego.
    UWAGA: Na tym etapie oczy są "lepkie" i mogą lekko przylegać do naczynia preparacyjnego. Jest to korzystne, ponieważ może ułatwić usunięcie oczu z płatów wzrokowych (patrz dyskusja).
  6. "Zamiataj" wszystkie oczy w "stosie" w PBS+pi na naczyniu preparacyjnym, używając jednego ostrza cienkiej pary kleszczy.
  7. Wytnij końcówkę P10 czystą żyletką, aby poszerzyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i nasmaruj wnętrze końcówki, pipetując Western Tissue Lysis Buffer (WTLB) w górę iw dół.
  8. Przenieś kompleksy oko-mózg w 5 μl PBS+pi do probówki mikrowirówkowej o pojemności 500 μl. Użyj tej nasmarowanej końcówki i mikropipety P10 z wyporem powietrza, aby zakończyć przenoszenie.
  9. Umieść probówkę do mikrowirówki na lodzie. Dodać 1 objętość (5 μl) WTLB do próbki i 10 μl 2x skoncentrowanego buforu próbki białka (lub 2,5 μl 5x zagęszczonego buforu próbki białka). Wymieszaj, stukając.
  10. Krótko przemieszać probówkę mikrowirówki i odwirować próbkę za pomocą miniwirówki biurkowej.
  11. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C do czasu analizy. Analizuj przy użyciu standardowych protokołów.

5. Przygotowanie tkanki oka do ekstrakcji RNA:

  1. Noszenie rękawiczek, czystego blatu, mikroskopu, narzędzi do preparacji i czarnego naczynia preparacyjnego najpierw z 70% etanolem, a następnie odczynnikiem do odkażania RNazy. Pozostawić do wyschnięcia.
  2. Rozbioruj 30-40 poczwarek zgodnie z opisem (kroki 2.1-2.9) z następującymi modyfikacjami: a) zbierz i rozdziel od 6 do 8 poczwarek w partiach w odstępie 15-20 minut; b) przeprowadzić sekcję w PBS wolnym od nukleaz i c) wyizolować każdą partię oczu osobno, ale zgromadzić całą tkankę siatkówki w tej samej probówce do mikrowirówki (krok 5.5).
    UWAGA: Jednoczesna sekcja zwłok przez dwie osoby przyspieszy skuteczną izolację dobrej tkanki oka.
  3. Dla każdej partii wyizoluj kompleksy oko-mózg (kroki 2.1-2.9) i przenieś do ~400 μl PBS wolnego od nukleaz w 9-dołkowym szklanym naczyniu, aby krótko spłukać na lodzie za pomocą mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i nasmarowanej końcówki (przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 3.1.2).
    UWAGA: Ta nasmarowana końcówka może być używana do kolejnych kroków 5.4, 5.5 i 5.8.
  4. Powtórz etap płukania dwukrotnie.
  5. Przenieś kompleksy oko-mózg do świeżej kropli 400 μl lodowatego PBS wolnego od nukleaz na czystym czarnym naczyniu preparacyjnym.
  6. Usuń każde oko z płatków wzrokowych za pomocą mocnej igły wolframowej (aby ustabilizować kompleks oka i mózgu) oraz cienkiej żyletki lub nożyczek do mikrodysekcji, aby dokładnie odciąć każde oko od płata wzrokowego.
    UWAGA: Na tym etapie oczy są "lepkie" i mogą lekko przylegać do naczynia preparacyjnego. Jest to korzystne, ponieważ może ułatwić usunięcie oczu z płatów wzrokowych (patrz Dyskusja).
  7. "Zamiataj" wszystkie oczy w "stosie" w wolnym od nukleaz PBS na naczyniu preparacyjnym, używając jednego ostrza cienkiej pary kleszczy.
  8. Przenieś oczy do sterylnej probówki mikrowirówkowej wolnej od RNaz i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie.
  9. Powtórzyć sekcję (kroki 5.3-5.8) każdej partii poczwarek. Przenieść każdą partię oczu do tej samej probówki do mikrowirówki, która była utrzymywana w ciekłym azocie (krok 5.5), aby zgromadzić wszystkie oczy w jednej probówce.
  10. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oko poczwarki jest łatwo dostępną tkanką, która służy jako doskonały model do badania procesów rozwojowych sterujących morfogenezą. W niniejszej pracy wyizolowano siatkówki i wykorzystano immunofluorescencję do wykrycia apikalnych złączy przylegających (Rycina 3A, C) lub kaspazy Dcp-1 (Rycina 3D), która jest aktywowana podczas apoptozy (Rycina 3)25. Podejścia te pozwalają na wyraźną obserwacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda rozwarstwienia oczu poczwarki Drosophila pozwala na wyizolowanie od 6 do 10 kompleksów oko-mózg w ciągu 10 do 15 minut. Jednak cierpliwość i praktyka są niezbędne, aby opanować technikę sekcji oraz poprawić jakość i szybkość sekcji. Ten krótki czas preparacji zapewnia, że każde oko znajduje się w przybliżeniu na tym samym etapie rozwoju, co zmniejsza zmienność fenotypu lub ekspresję genów siatkówki w zestawie danych. Podczas gdy alternatywne protokoły mogą wymagać mniej praktyki do opanowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Zackowi Drumowi i naszym recenzentom za pomocne komentarze na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez R15GM114729.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adobe PhotoshopAdobeOprogramowanie do przetwarzania obrazów
Szyny bambusowe, 6" Ted Pella Inc116
Beta merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
Fosforan beta-gliceroluSigma-Aldrich50020
miskapreparcyjna Szklana szalka Petriego wypełniona po brzegi SYLG170 lub SYLG184 (w kolorze czarnym z drobno zmielonym węglem drzewnym w proszku). Pozostawić w temperaturze pokojowej na 24-48 godzin do polimeryzacji.
Uchwyt ostrzaFine Science Tools10053
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
cOmpete, wolne od EDTA tabletki koktajlowe inhibitora proteazyRoche4693132001
Mikroskop konfokalny (Zeiss LSM 501)Carl Zeisslub podobny mikroskop
Pirowęglan dietylu (DEPC)Sigma-Aldrich40718
Taśma dwustronna3M 665
Drosophila podłoża spożywcze, bogate w składniki odżywcze 7,5% sacharozy, 15% glukozy, 2,5% agaru, 20% drożdży piwnych, 5% peptonu, 0,125% MgSO4,7H2O, 0,125% CaCl2,2H20
Drosophila pożywka, standardowyprzepis na mąkę kukurydzianą Bloomington Drosophila Stock center.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichE6758
utrwalający4% formadehydu w PBS, pH 7,4.
Mikroskop fluorescencyjny (mikroskop TCS SP5 DM)Leica Microsystemslub podobny mikroskop
Kleszcze Kleszcze Fine Science Tools91150-20należy często ostrzyć.
FormaldehydeThermo Scientific28908
Szklane naczynia 9-dołkowe Corning7220-85Znany również jako naczynia 9-dołkowe 
Szkiełka nakrywkowe szklane (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542-B
Szkiełka mikroskopowe szklane (25 x 75 x 1 mm)Fisher Scientific12-550-413
Szklana szalka PetriegoCorning3160-100BO
GlicerolSigma-AldrichG5516
Image Studio wersja oprogramowania 5.2.5LI-COR BiosciencesOprogramowanie do przetwarzania obrazu do ilościowego oznaczania plam zachodnich.
Bufor do próbek LaemmliBio-Rad161-07372X skoncentrowany bufor do próbek białek, suplement z beta merkaptoetanolem zgodnie z instrukcjami producenta.
Bufor próbki redukujący znacznik pasa ruchu ThermoFisher Scientific390005X skoncentrowany bufor do próbek białek.
Probówki mikrowirówkowe AxygenMCT-175-C
 Fine Science Tools15000-03
Tace do mikrodołków (72 x 10 &mikro; L-studzienkiNunc438733
Media0,5% N-galalan N-propylu i 80% glicerol w PBS
N-galalan propyluSigma-AldrichP3130
PBS bez nukleaz (PBS w 0,1% DEPC, pH 7,4)Dodaj odpowiednią objętość DEPC do PBS, dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. W autoklawie przez co najmniej 20 minut. Przechowywać w 4° C
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4)Sigma-AldrichP5368Przygotować zgodnie z instrukcjami producenta
PBS+pi (PBS plus inhibitory proteazy i fosfatazy)10mM NaF, 1mM fosforan beta-glicerolu i 1mM Na3VO4 w PBS, pH 7,4.   
PBT0,15% TritonX i 0,5% albumina surowicy bydlęcej w PBS, pH 7,4
Uchwyt na przypinkęFine Science Tools26016-12
Przeciwciało pierwszorzędowe: kozia anty-GAPDHImgenexIMG-3073Do Western blot. Używany w 1:3000
Przeciwciało pierwszorzędowe: królicze przeciwciało przeciw rozszczepieniu Dcp-1Sygnalizacja komórkowa9578S Doimmunofluorescencji. Używany w 1:100
Przeciwciało pierwszorzędowe: szczur anty-DEcadBadania rozwojowe Hybridoma BankDCAD2Do immunofluorescencji. Używane w 1:20
Przeciwciało pierwszorzędowe: szczur anty-DEcadDOI: 10.1006/dbio.1994.1287DCAD1  Prezent od Tadashi Uemura. Używany w 1:100.
Zestaw do ekstrakcji RNA: Zestaw do miniprzygotowania tkanki RNA Relia Prep PromegaZ6110
Odczynnik do odkażania rnazy (RNase Away)Molecular BioProducts7002
Ostrza skalpelaFine Science Tools10050Odłam mały kawałek ostrza i zabezpiecz w uchwycie ostrza.
Przeciwciało drugorzędowe: 488-sprzężone  osło anty-szczurze IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-545-153Do immunofluorescencji. Używany w 1:200
Przeciwciało drugorzędowe: cy3-sprzężone kozie anty-królicze IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch111-165-144Do immunofluorescencji. Używany w 1:100
Przeciwciało wtórne: IgG (H+L) przeciw szczurom kozom sprzężonym z HRP Technologiasygnalizacji komórkowej7077Do Western blotting. Używany w 1:3000
Przeciwciało drugorzędowe: IgG (H+L) królika sprzężonego z HRP)ImmunoResearch305-035-003Do Western blotting. Używany w 1:3000
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Fluorek soduSigma-Aldrich215309
wanadanu soduSigma-Aldrich50860
(NanoDrop)ThermoFisher Scientific2000c 
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny (M60 lub M80)Leica Microsystemslub podobny mikroskop
Sylgard ()Dow CorningSYLG170
Sylgard (przezroczysty)Dow CorningSYLG184Kolor z drobno zmielonym proszkiem charcol
Tkanka: KimwipesKIMTECH34120
TritonXSigma-AldrichT8787
Chlorowodorek Trizma pH7,5Sigma-AldrichT5941
Igła wolframowa, cienkaFine Science Tools10130-10Włóż do uchwytu na szpilki
Igła wolframowa, solidnaFine Science Tools10130-20Włóż do uchwytu szpilki
WTLB (zachodni bufor do lizy tkanek)150mM NaCl, 1,5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glicerol, 10mM NaF, 1mM fosforan beta-glicerolu i 1mM Na3VO4 w 50mM Tris-HCl (pH 7,5). Uzupełnij jednym stolikiem koktajlowym z proteazą cOmplete na 10 ml roztworu.
Pasta drożdżowa(lokalny supermarket)Około 2 łyżki drożdży Fleischmann's ActiveDry (lub podobnych) rozpuszczonych w ~20 ml destylowanego H2O
Roztwór Nożyczki do mikrodysekcji ) montażowe Jackson Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647(2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796(2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).
  20. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Kompleks oko-mózgprotokół mikrodyssekcjianaliza immunohistochemicznaanaliza Western blotmetoda izolacji RNAdyssekcja oka poczwarkiprotokół fiksacji tkanekinkubacja z przeciwciałamimontowanie preparatów na szkiełkach mikroskopowych
Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.