Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ta praca demonstruje nową metodę pomiaru stabilności aktywności enzymu za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Szczytowa szybkość ogrzewania obserwowana po pojedynczym wstrzyknięciu roztworu substratu do roztworu enzymatycznego jest skorelowana z aktywnością enzymu. Wielokrotne wstrzyknięcia substratu do tego samego roztworu enzymatycznego w czasie wykazują utratę aktywności enzymu. Test jest autonomiczny, wymaga bardzo mało czasu personelu i ma zastosowanie do większości pożywek i enzymów.
Wprowadzenie
Enzymy to białka zdolne do katalizowania szerokiego wachlarza reakcji organicznych. Większość enzymów działa w roztworze wodnym o pH zbliżonym do neutralnego, unikając w ten sposób stosowania ostrych rozpuszczalników. Ze względu na ich wysoką selektywność, reakcje katalizowane enzymatycznie wytwarzają mniej produktów ubocznych (w niektórych przypadkach nie wytwarzają żadnych produktów ubocznych) niż katalizatory nieselektywne, takie jak kwasy i zasady1. Jest to szczególnie istotne w produkcji żywności, gdzie wszystkie reakcje chemiczne muszą być przeprowadzane, aby produkt końcowy był bezpieczny do spożycia przez ludzi. Obecnie enzymy są wykorzystywane do produkcji syropu kukurydzianego o wysokiej zawartości fruktozy2, cheese3, beer4, mleko bez laktozy5 i inne ważne produkty spożywcze. Chociaż niniejszy artykuł koncentruje się na wykorzystaniu enzymów w przemyśle spożywczym, istnieje wiele innych zastosowań enzymów, w tym w zielonej chemii i syntezie leków.
Użyteczność enzymów jest ograniczona przez stabilność aktywności enzymu, która zależy od utrzymania trójwymiarowej struktury enzymu. Strukturę enzymu można ustabilizować poprzez modyfikacje, takie jak PEGylacja6, unieruchomienie na solidnym podłożu7, modyfikacje genetyczne8 i preparaty. Obecnie stabilność enzymu jest zwykle mierzona za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) i testów aktywności enzymów w punkcie końcowym9. DSC mierzy temperaturę, w której rozwija się enzym; Im wyższa temperatura, tym bardziej stabilna konstrukcja. Jednak utrata aktywności często występuje w niższej temperaturze niż wymagana do rozwinięcia enzymu lub domen w enzymie10. W związku z tym DSC nie jest wystarczające do określenia, czy modyfikacja enzymu zwiększa stabilność aktywności enzymu. Testy enzymatyczne w punkcie końcowym są zwykle czasochłonne, wymagają wielu próbek i często obejmują sprzężoną reakcję kolorymetryczną, która nie ma zastosowania do wysoce zabarwionych lub nieprzezroczystych roztworów lub zawiesin.
Ta praca demonstruje metodę bezpośredniego pomiaru stabilności aktywności enzymu za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). ITC mierzy szybkość ciepła uwalnianego lub pochłanianego w trakcie reakcji. Ponieważ prawie wszystkie reakcje wytwarzają lub pochłaniają ciepło, ITC może być stosowany w większości reakcji katalizowanych enzymami, w tym w reakcjach, które nie mają reakcji sprzężonej lub zachodzą w nieprzezroczystych podłożach, takich jak mleko. ITC jest używany od wielu dziesięcioleci do pomiaru chemicznych parametrów kinetycznych dla wielu rodzajów reakcji, ale przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na wykorzystaniu ITC do pomiaru szczytowej szybkości ciepła reakcji katalizowanych enzymami i pokazuje, że aktywność enzymu jest liniowo skorelowana ze szczytową szybkością ciepła. Pomiary ITC szczytowych szybkości ciepła są w większości autonomiczne i wymagają bardzo mało czasu personelu na konfigurację i analizę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- 1 000 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,6
- Odmierzyć 800 ml wody destylowanej w zlewce miarowej o pojemności 1 000 ml.
- Odważyć 8,2 g bezwodnego octanu sodu i dodać go do zlewki.
- Umieść zlewkę na talerzu do mieszania, umieść w niej mieszadło, włącz płytkę mieszającą i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Gdy bezwodny octan sodu całkowicie się rozpuści, zmierzyć pH roztworu za pomocą skalibrowanego pH-metru.
- Dodać odpowiednio 1 M HCl lub NaOH, aby uzyskać pożądane pH 4,6.
- Dodaj wodę destylowaną, aż całkowita objętość wyniesie 1,000 ml.
- Przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
- Roztwór enzymatyczny
- Przygotować 10 ml roztworu enzymatycznego w zakresie 10-30 mg/ml, najpierw mierząc 8 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,6 w cylindrze miarowym o pojemności 15 ml.
- Dodać roztwór buforowy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z enzymem i energicznie wstrząsać, aż enzym się rozpuści.
- Dodaj więcej roztworu buforowego, aż całkowita objętość wyniesie 10 ml.
- Roztwór enzymu przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Roztwór podłoża
- Aby przygotować roztwór substratu w zakresie 300-600 mM, należy obliczyć ilość substratu potrzebną w gramach, aby uzyskać pożądane stężenie.
- Odważyć podłoże i umieścić w szklanej zlewce o pojemności 100 ml
- Odmierzyć 20 ml roztworu buforowego za pomocą cylindra miarowego o pojemności 25 ml, a następnie dodać go do szklanej zlewki.
- Umieścić zlewkę na płytce mieszającej i umieścić w niej mieszadło magnetyczne. Włącz ogień i odpowiednio dostosuj prędkość mieszania.
- Pozostaw mieszanie do momentu, aż podłoże się rozpuści.
- Wlać roztwór substratu do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,6, aż całkowita objętość wyniesie 45 ml. Wymieszać przez potrząsanie.
- Roztwór substratu należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
2. Przeprowadzanie eksperymentu
- Przygotowanie instrumentu ITC
- Upewnij się, że komórka referencyjna jest załadowana 350 μl wody destylowanej. Przed załadowaniem enzymu do celi próbki sprawdź, czy cela próbki została oczyszczona.
- Protokół czyszczenia- Napełnij strzykawkę ładującą 500 μl 2% roztworu czyszczącego (tabela materiałów), ostrożnie włóż igłę do komórki próbki, napełnij kuwetę i powoli usuń płyn za pomocą tej samej strzykawki. Płyn przelać do zlewki. Powtórz ten krok dwa razy z 2% roztworem czyszczącym (tabela materiałów), trzy razy z 70% etanolem, a następnie przemyj dziesięć razy wodą destylowaną.
- Napełnij strzykawkę ładującą 450 μl roztworu enzymu, ostrożnie włóż igłę do samego dna celi próbki i powoli dociskaj tłok do linii 100 μl, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
- Umyć strzykawkę do miareczkowania o pojemności 50 μl wodą destylowaną trzykrotnie, umieszczając końcówkę igły w wodzie, następnie powoli nabierając wody do strzykawki, a następnie dozując wodę do pojemnika na odpady.
- Usunąć resztki wody, trzykrotnie spłukując je roztworem substratu.
- Napełnić strzykawkę do miareczkowania roztworem substratu, wciągając roztwór do momentu, aż strzykawka będzie pełna i nie będzie zawierał pęcherzyków powietrza.
- Trzymając strzykawkę nadal w roztworze substratu, zdjąć tłok i pozwolić, aby około 2 μl powietrza dostało się do górnej części strzykawki i ponownie włożyć tłok.
- Zdjąć uchwyt biurety ITC, umieścić strzykawkę w uchwycie biurety i przykręcić do oporu.
- Przetrzyj końcówkę mieszadła niestrzępiącą się chusteczką, a następnie ostrożnie umieść uchwyt biurety w instrumencie ITC i zablokuj go na miejscu.
3. Konfiguracja ITCrun
- Na komputerze otwórz ITCrun i kliknij przycisk Konfiguruj.
- Kliknij Szybkość mieszania i ustaw na 350 obr./min. Sprawdzić rozmiar strzykawki (μl) i upewnić się, że wynosi 50 μl.
- Ustaw temperaturę i naciśnij Aktualizuj. Zaleca się, aby ten krok został wykonany co najmniej 1 godzinę przed przygotowaniem ITC. Daje to wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie lub ostygnięcie instrumentu w razie potrzeby.
- Jako konfigurację eksperymentu wybierz miareczkowanie przyrostowe.
- Kliknij przycisk Wstaw, aby skonfigurować wtryski. Ustawić odstęp między wstrzyknięciami na 5 400 s, objętość wstrzyknięcia (μL) na 4, a liczbę wstrzyknięć na 4. Naciśnij OK, aby potwierdzić ustawienia.
- W polu Equilibration (Równoważenie) wybierz opcję Auto-equilibrate (Automatyczne równoważenie) i Large expected heats (Duże oczekiwane biegi). (Jeśli oczekiwane ruje są małe, można wybrać małe poniżej oczekiwanych upałów, jednak wydłuży to czas równowagi).
- Ustaw początkową linię bazową na 300 s.
- Aby rozpocząć uruchamianie, kliknij symbol Start obok opcji Szybkość mieszania, a następnie kliknij przycisk Start, który znajduje się obok symbolu klucza.
- Zapisz plik i pozwól instrumentowi na uruchomienie.
4. Analizowanie danych
- Otwórz plik w programie NanoAnalyze. Kliknij Dane i wybierz Kolumny danych.
- Zaznacz wszystkie dane, skopiuj, a następnie wklej je do programu Microsoft Excel.
- Dostosuj linię bazową do zera, dodając wartość wymaganą w 300 s, aby wyzerować ją. Zastosuj tę poprawkę do całej kolumny wartości szybkości cieplnej.
- Znajdź minimalną lub maksymalną wartość szybkości ogrzewania dla każdego wstrzyknięcia, korzystając z równania: =MIN(komórka:komórka) lub MAX(komórka:komórka). Każdy punkt danych reprezentuje szczytową aktywność enzymatyczną enzymu przy każdym wstrzyknięciu.
- Wykresy wartości MIN lub MAX w odniesieniu do czasu, w którym wartość wystąpiła podczas miareczkowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 1 oraz Rysunku 5 ukazują dane dotyczące dwóch enzymów: laktazy i inwertazy. Laktaza i inwertaza katalizują hydrolizę disacharydu do dwóch monosacharydów, odpowiednio endotermicznie i egzotermicznie. Obie reakcje enzymatyczne przeprowadzono przy stężeniach, które wykluczały nasycenie enzymu.
Dane dla laktazy demonstrują, w jaki sposób dane z ITC mogą być wykorzystane do oceny stabilności ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Główną zaletą opisanego tutaj testu stabilności enzymatycznej ITC jest automatyzacja. Po wykonaniu wszystkich odpowiednich i roztworów, czas przygotowania dla każdego testu wynosi około 15 minut dla osoby wykonującej test. W przeciwieństwie do tego, konwencjonalne testy aktywności inwertazy i laktazy wymagają około 2 godzin przy ciągłym zaangażowaniu osoby wykonującej test, a wiele testów aktywności enzymatycznej zajmuje znacznie więcej roboczogodzin. W poprzedniej publikacji wykazaliśmy, jak dane z metody ITC wypadają w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| a-Laktoza | Fisher Scientific | nieznany (zbyt stary) | 500g |
| Octan sodu, bezwodny 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Laktaza | MP Bio | 100780 | 5g |
| Roztwór kwasu hydrocholowego, 1N | Fisher Naukowy | SA48-500 | 500 ml |
| - pH | VWR | 89231-622 | |
| Etanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1 galon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (roztwór czyszczący) |
Bibliografia
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
