Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59308

⸱

25 czerwca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione są tutaj protokoły immunohistochemicznej charakterystyki i lokalizacji peptydu oreksyny, receptorów oreksyny i receptorów endokannabinoidowych w jelitach i mózgach dorosłych dorosłych ryb pręgowanych z normalną i indukowaną dietą (DIO) przy użyciu metod immunoperyxidazy i podwójnej immunofluorescencji.

Streszczenie

Immunohistochemia (IHC) to bardzo czuła i specyficzna technika związana z wykrywaniem docelowych antygenów w skrawkach tkanek z oznakowanymi przeciwciałami. Jest to wieloetapowy proces, w którym optymalizacja każdego kroku jest kluczowa dla uzyskania optymalnego sygnału specyficznego. Dzięki IHC można wykryć rozmieszczenie i lokalizację określonych biomarkerów, co ujawnia informacje na temat ochrony ewolucyjnej. Co więcej, IHC pozwala zrozumieć zmiany ekspresji i dystrybucji biomarkerów w stanach patologicznych, takich jak otyłość. IHC, głównie technika immunofluorescencji, może być stosowana u dorosłych danio pręgowanego do wykrywania organizacji i dystrybucji filogenetycznie zachowanych cząsteczek, ale standardowy protokół IHC nie jest ustalony. Oreksyna i endokannabinoid to dwa wysoce konserwatywne systemy zaangażowane w kontrolę spożycia pokarmu i patologii otyłości. Przedstawiono tutaj protokoły stosowane w celu uzyskania informacji na temat lokalizacji i dystrybucji peptydu oreksyny (OXA), receptora oreksyny (OX-2R) i receptora kannabinoidowego (CB1R) w jelitach i mózgu normalnych i indukowanych dietą otyłych (DIO) modeli dorosłych danio pręgowanego. Opisano również metody immunoperoksydazy i podwójnej immunofluorescencji, a także przygotowania odczynników, utrwalania, zatapiania parafiny i krioprotekcji tkanki danio pręgowanego oraz przygotowania do endogennego etapu blokowania aktywności i przeciwbarwienia tła. Pełny zestaw parametrów uzyskano z poprzednich eksperymentów IHC, dzięki którym pokazaliśmy, w jaki sposób immunofluorescencja może pomóc w zrozumieniu rozmieszczenia, lokalizacji i zachowania ekspresji OXs, OX-2R i CB1R w tkankach dorosłego danio pręgowanego. Uzyskane obrazy o bardzo specyficznej intensywności sygnału doprowadziły do potwierdzenia, że danio pręgowany jest odpowiednim modelem zwierzęcym do badań immunohistochemicznych nad rozmieszczeniem, lokalizacją i ewolucyjną ochroną określonych biomarkerów w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Przedstawione tutaj protokoły są zalecane do eksperymentów IHC na dorosłych danio pręgowanym.

Wprowadzenie

Immunohistochemia (IHC) jest dobrze znaną klasyczną techniką używaną do identyfikacji składników komórkowych lub tkankowych (antygenów) poprzez interakcję antygen-przeciwciało1,2. Może być używany do identyfikacji lokalizacji i rozmieszczenia docelowych biomolekuł w tkance. IHC wykorzystuje reakcje immunologiczne i chemiczne do wykrywania antygenów w skrawkach tkanki3. Głównymi markerami używanymi do wizualizacji interakcji antygen-przeciwciało są barwniki fluorescencyjne (immunofluorescencja) i reakcje barwne enzyma-substrat (immunoperoksydaza), oba sprzężone z przeciwciałami4. Za pomocą obserwacji mikroskopowej możliwe jest określenie lokalizacji znakowanej tkanki, która w przybliżeniu odpowiada lokalizacji docelowego antygenu w tkance.

Istnieją dwie metody wykrywania białek w reakcjach fluorescencyjnych lub chromogenicznych: metoda bezpośredniego wykrywania, w której specyficzne przeciwciało pierwszorzędowe jest bezpośrednio znakowane; oraz metoda wykrywania pośredniego, w której przeciwciało pierwszorzędowe jest niesprzężone, podczas gdy przeciwciało drugorzędowe nosi etykietę5,6,7. Metoda pośrednia ma pewne zalety, którymi jest przede wszystkim wzmocnienie sygnału. Ponadto, w przeciwieństwie do innych technik molekularnych i komórkowych, dzięki immunofluorescencji możliwe jest uwidocznienie dystrybucji, lokalizacji i koekspresji dwóch lub więcej białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach i tkankach7. Wybór zastosowanej metody wykrywania zależy od szczegółów eksperymentalnych.

Do tej pory IHC jest szeroko stosowany w badaniach podstawowych jako potężne i niezbędne narzędzie do zrozumienia dystrybucji i lokalizacji biomarkerów oraz ogólnego profilowania różnych białek w tkance biologicznej od człowieka do bezkręgowców8,9,10,11. Technika ta pomaga wyświetlić mapę ekspresji białek w dużej liczbie normalnych i zmienionych narządów zwierzęcych oraz różnych typów tkanek, pokazując możliwą regulację ekspresji w dół lub w górę wywołaną zmianami fizjologicznymi i patologicznymi. IHC to bardzo czuła technika, która wymaga dokładności i właściwego doboru metod w celu uzyskania optymalnych wyników12. Po pierwsze, wiele różnych czynników, takich jak fiksacja, reaktywność krzyżowa, pobieranie antygenu i wrażliwość przeciwciał, może prowadzić do fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych sygnałów13. Selekcja przeciwciał jest jednym z najważniejszych etapów IHC i zależy od swoistości antygenu oraz jego powinowactwa do badanego białka i gatunków7.

Ostatnio zoptymalizowaliśmy technikę IHC do wykrywania elementów systemów oreksyny/hipokretyny i endokannabinoidów w tkance dorosłego danio pręgowanego. Skupiliśmy się głównie na fiksacji, osadzaniu tkanek przy użyciu dwóch różnych podejść, sekcji i montażu (co może wpływać na rozdzielczość i szczegółowość podczas analizy mikroskopowej) oraz blokowaniu (aby zapobiec fałszywym alarmom i zmniejszyć tło)14. Inne ważne cechy to swoistość i selektywność przeciwciał oraz odtwarzalność poszczególnych protokołów IHC. Kluczem do zapewnienia swoistości przeciwciał jest zastosowanie kontroli ujemnych (w tym braku pierwszorzędowych przeciwciał lub tkanki, o której wiadomo, że nie wykazuje ekspresji białek docelowych), a także kontroli pozytywnych (w tym tkanki, o której wiadomo, że wyraża białka docelowe)15. Wybór przeciwciał do IHC jest dokonywany na podstawie ich specyficzności gatunkowej (prawdopodobieństwa, z jakim reagują z interesującym antygenem) oraz stosowanych systemów wykrywania wiązania antygen-przeciwciało4,5,6,7. W przypadku immunoperoksydazy o barwie reakcji decyduje dobór chromogenu wytrącającego się, zwykle diaminobenzydyny (brązowej)16. Z drugiej strony, i mmunofluorescencja wykorzystuje przeciwciała sprzężone z fluoroforem do wizualizacji ekspresji białek w zamrożonych skrawkach tkanek i pozwala na łatwą analizę wielu białek w odniesieniu do chromogennego systemu detekcji5,7.

W technice immunoperoksydazy, przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z biotyną, cząsteczką łącznikową zdolną do rekrutacji chromogennej cząsteczki reporterowej [kompleks awidyna-biotyna (ABC)], co prowadzi do wzmocnienia sygnału barwienia. W przypadku metody reporterowej ABC enzym peroksydaza reaguje z 3,3'-diaminobenzydyną (DAB), wytwarzając intensywnie brązowe zabarwienie, w którym enzym wiąże się z przeciwciałem drugorzędowym, które można następnie przeanalizować za pomocą zwykłego mikroskopu świetlnego. Barwienie ABC, ze względu na wysokie powinowactwo awidyny do biotyny, daje szybką i optymalną reakcję, z niewielką liczbą przeciwciał drugorzędowych przyłączonych do miejsca reaktywności przeciwciała pierwotnego. Ta metoda detekcji chromogennej pozwala na analizę densytometryczną sygnału, dostarczając danych półilościowych opartych na korelacji poziomów sygnału brązowego z poziomami ekspresji białek18.

Dzięki technikom immunofluorescencji, jednoczesne wykrywanie wielu białek jest możliwe dzięki zdolności różnych fluorochromów do emitowania światła na unikalnych długościach fal, ale ważne jest, aby wybierać fluorochromy ostrożnie, aby zminimalizować nakładanie się widm5. Co więcej, zastosowanie przeciwciał pierwszorzędowych u różnych gatunków gospodarzy minimalizuje trudności związane z reaktywnością krzyżową. W tym przypadku każde przeciwciało drugorzędowe specyficzne dla gatunku rozpoznaje tylko jeden typ przeciwciała pierwszorzędowego. Reportery fluorescencyjne to małe cząsteczki organiczne, w tym komercyjne pochodne, takie jak barwniki Alexa Fluor.

Wiele modeli zwierzęcych służy do zrozumienia szczególnych warunków fizjologicznych i patologicznych. Do tej pory ustalono, że wiele szlaków metabolicznych jest zachowanych w trakcie ewolucji. W związku z tym badania IHC na organizmach modelowych, takich jak danio pręgowany, mogą dostarczyć informacji na temat genezy i utrzymywania się stanów patologicznych i niepatologicznych17. Celem tego raportu jest zilustrowanie protokołów IHC, które można wykonać na tkance dorosłego zebry pręgowanego i wykorzystać do uzyskania szczegółowych obrazów rozmieszczenia i lokalizacji OXA, OX-2R i CB1R na poziomie peryferyjnym i centralnym. Opracowano również protokoły dotyczące stosowania dwóch głównych metod pośrednich IHC w tkankach obwodowych i centralnych dorosłych ryb danio pręgowanego. Opisano metodę pośrednią, która pozwala na amplifikację sygnału w przypadkach, gdy przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym (metoda immunofluorescencyjna) lub reporterem enzymu (metoda immunoperoksydazy). Zarówno metody detekcji chromogenicznej, jak i fluorescencyjnej mają swoje wady i zalety. W tym protokole opisano zastosowanie IHC, głównie immunofluorescencji, u dorosłego danio pręgowanego, modelu zwierzęcego szeroko stosowanego do badania systemów, które są ewolucyjnie konserwatywne w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Protokół immunoperoksydazy

UWAGA: Danio pręgowany został pozyskany przez Prof. Omida Safari (Wydział Rybołówstwa, Wydział Zasobów Naturalnych i Środowiska, Uniwersytet Ferdowsi w Meszhedzie, Meszhed, Iran)10.

  1. Sekcja tkanek
    1. Danio pręgowanego należy złożyć w ofierze przez zanurzenie w lodowatej wodzie (5 części lodu / 1 część wody, 4 °C); pozostawić je do momentu ustania wszelkich ruchów, aby zapewnić śmierć przez niedotlenienie.
    2. Szybko usuń jelito i mózg za pomocą następującej metody sekcji:
      1. Osusz rybę na ręczniku papierowym i połóż ją strzałkowo na macie preparucyjnej, blokując brzuszną część oczodołu i mięsistą część ogona.
      2. Na jelito: przeciąć skórę i ostrożnie usunąć skórę i leżące pod nią mięśnie z boku ryby, aż narządy wewnętrzne będą widoczne. Usuń jelito z jamy ciała, rozciągając je.
      3. Dla mózgu: usuń głowę żyletką. Usuń tkankę miękką z brzusznej strony czaszki za pomocą kleszczy. Otwórz czaszkę i usuń kość z brzusznej strony mózgu. Usuń skórę i kości czaszki z grzbietowej strony mózgu. Usuń mózg.
  2. Utrwalanie tkanek
    1. Utrwalić wycinkowe tkanki przez zanurzenie w świeżym 4% paraformaldeydzie (PFA) w buforze fosforanowym (PB, pH 7,4, 4 °C) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
      1. Przygotować 0,1 M PB rozpuszczając 1,755 g NaH2PO4H2O i 4,575 g Na2HPO4 w 450 ml wody destylowanej (dH2O) i dostosować do pH 7,4 z niezbędną ilością NaOH 1N.
      2. Przygotować 4% PFA, rozpuszczając 4 g PFA w 100 ml 0,1 M PB (pH 7,4) przez mieszanie na płycie grzewczej. Po osiągnięciu temperatury 60 °C dodać 2-4 krople NaOH 1N do uzyskania klarownego roztworu. Pozostawione PFA 4% w RT i kontroluj pH. Dostosuj pH do 7.4.
        UWAGA: Utrwalanie tkanek przez ponad 4–6 godzin może prowadzić do nadmiernej fiksacji, która maskuje antygeny, ograniczając wiązanie przeciwciało-epitop. Czas utrwalenia zależy od wielkości tkanki.
  3. Osadzanie tkanek
    1. Płukać chusteczki 5x przez 5 minut każda, zanurzając je w 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Odwodnić tkanki, a następnie zanurzyć je w alkoholu 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min) i 100% (1 min).
    3. Sklarować tkanki przez zanurzenie w 100% alkoholu:ksylenie (1:1) przez 10 min, a następnie 2x w ksylenie po 5 min każda.
    4. Naciekać tkanki woskiem parafinowym (56 °C) dwa razy przez 1 godzinę każde, bezpośrednio zanurzając je w parafinie.
    5. Osadź tkanki w blokach parafinowych w temperaturze pokojowej (RT) i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu cięcia.
  4. Cięcie tkanek
    1. Pociąć tkanki na odcinki czołowe lub strzałkowe o grubości 8 μm za pomocą mikrotomu i zebrać skrawki w naprzemiennych seriach na samoprzylepnych szkiełkach podstawowych na wodzie i ogrzane w temperaturze 38 °C.
    2. Wysuszyć szkiełka z sekcjami w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Deparafinizacja i rehydratacja skrawków tkanek
    1. Odwoskować skrawki przez zanurzenie w ksylenie na 5 minut, a następnie zanurzenie w ksylenie na 3 minuty.
    2. Ponownie nawodnić skrawki poprzez kolejne szkiełka zanurzając je w alkoholu 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), a następnie umieścić szkiełka w dH2O (5 min).
      UWAGA: Całkowicie odparafinować skrawki przed rozpoczęciem reakcji. Jeśli skrawki nadal mają ślady parafiny, wykonaj dodatkowe zanurzenie w ksylenie na 5 minut lub dłużej.
  6. Pobieranie antygenu
    1. Potraktuj skrawki buforem cytrynianowym (0,01 M, pH 6,0), zanurzając szkiełka w roztworze i podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 5 minut z maksymalną mocą.
    2. Niech sekcje ostygną.
    3. Powtórz cykl 5 minut w kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą, aby zakończyć pobieranie antygenu.
      1. Przygotować bufor cytrynianowy (0,01 M, pH 6,0) rozpuszczając 2,10 g kwasu cytrynowego w 100 mldH2O i 5,882 g cytrynianu sodu w 200 mldH2O. Zmieszać cytrynian sodu (0,01 M) z kwasem cytrynowym (0,01 M) w stosunku 1:4 objętościowo i dostosować pH do 6 za pomocą HCl 0,1N.
  7. Blokowanie endogennej peroksydazy
    1. Odznaczyć obszar tkanki na szkiełkach za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki.
    2. Przepłukać skrawki 3 razy po 5 minut każda, roztworem soli fizjologicznej z tris-buforem (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Przygotować 0,1 M TBS, rozpuszczając 12,1 g zasady trizma i 9 g NaCl w 950 mldH2O i dostosować do pH 7,3 za pomocą HCl 0,1N.
    3. Zablokować endogenną aktywność peroksydazy przez zanurzenie szkiełek w roztworze 0,75% H2O2 na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Przygotować 0,75% roztwór H2O2 rozpuszczając 5 ml 30% H2O2 w 195 ml dH2O.
        UWAGA: enzymy ndogenne mogą reagować z odczynnikami IHC i dawać fałszywie dodatnie wyniki. Co więcej, wysoce unaczynione tkanki wyrażają wiele endogennych peroksydaz, co może prowadzić do intensywnego niespecyficznego barwienia i poziomów tła. Leczenie 0,75%H2O2 wygasza endogenną peroksydazę i znacznie zmniejsza niespecyficzne tło.
  8. Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązaniai przepuszczalność tkanek
    1. Inkubować skrawki tkanki z buforem blokującym TBS/0,4% Triton (TBS-T), zawierającym pierwotną surowicę odpornościową (NRS), przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.
      1. Przygotować 0,4% Triton, rozpuszczając 0,4 ml Triton X-100 w 100 ml TBS.
      2. Przygotować bufor blokujący TBS-T, rozpuszczając 1% normalnej surowicy w TBS zawierającym 0,4% Triton X-100 (1 ml normalnej surowicy + 8,2 ml TBS + 0,8 ml 0,48 Triton X-100).
        UWAGA: Należy wybrać gatunek surowicy zwierzęcej w zależności od gospodarza przeciwciała drugorzędowego (np. w przypadku stosowania koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi należy użyć normalnej surowicy koziej).
  9. Inkubacja tkanek z przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Skrawki inkubować przez noc w wilgotnym pudełku w temperaturze pokojowej z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w TBS-T. Wybarwić skrawki następującym przeciwciałem pierwszorzędowym:
      1. Kozie przeciwciało przeciwko OX-2R rozcieńczone w stosunku 1:200, które rozpoznaje C-koniec białka.
      2. Przeciwciało kozie przeciwko OX-A rozcieńczone w stosunku 1:200 [oreksyna-A (C-19)], które rozpoznaje C-koniec białka.
        UWAGA: Upewnij się, że przeciwciało pierwszorzędowe reaguje z biomolekułą będącą przedmiotem zainteresowania. Określ, z którym epitopem biomolekuły reaguje przeciwciało pierwszorzędowe, używając dopasowania genu. Na przykład epitop OX-A został zmapowany między aa 50-100 ludzkiego OX-A (O43612), podczas gdy epitop OX-2R został zmapowany w pobliżu ostatnich 50 aa na C-końcu człowieka.
  10. Inkubacja tkanek z przeciwciałem drugorzędowym
    1. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut za pomocą 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Inkubować skrawki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym i króliczą immunoglobuliną antykozią (H+L) sprzężoną z biotyną, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:100 w TBS-T.
      UWAGA: Przetestuj i znajdź różne rozcieńczenia zarówno przeciwciał pierwszorzędowych, jak i drugorzędowych, aby znaleźć optymalne rozcieńczenie, które pozwoli na redukcję tła.
  11. Reakcja peroksydazy
    1. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut za pomocą 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Inkubować skrawki z kompleksem awidyna-biotyna (ABC) przez 1 godzinę.
      1. Przygotować roztwór ABC, dodając dwie krople składnika A, a następnie dwie krople składnika B w 5 ml TBS.
    3. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut za pomocą 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Potraktuj skrawki substratem chromogenowym 3,3'-diaminobenzydyna-4 (DAB).
      1. Przygotować roztwór DAB, dodając jedną kroplę (około 30 μl) koncentratu chromogenu DAB do 1 ml rozcieńczalnika DAB i dobrze wymieszać przed użyciem.
        UWAGA: Przygotować roztwór ABC co najmniej 30 minut przed użyciem i utrzymywać kompleks w temperaturze 4 °C do momentu użycia, aby umożliwić stabilne wiązanie awidyny z biotyną. Przygotuj świeży roztwór roboczy DAB, nałóż na skrawki tkanek i rozwijaj, aż kolor będzie odpowiedni. Gdy reakcja chromogenna przekształci miejsca epitopów w brązowy kolor, a intensywność sygnału jest odpowiednia do obrazowania, przejdź do następnego kroku. Czas wywołania DAB może wynosić od kilku sekund do 10 minut. W przypadku OX-A i OX-2R 1 wystarczą 2 minuty. Z DAB należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest rakotwórczy.
  12. Odwodnienie i montaż tkanek
    1. Przepłukać wszystkie sekcje 3x przez 5 minut każda, 0,1 M TBS (pH 7,3), aby zatrzymać reakcję DAB.
    2. Odwodnić skrawki poprzez kolejne szkiełka zanurzone w alkoholu 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Sklaruj plastry przez zanurzenie 2x w ksylenie po 10 minut każdy.
    4. Zamontuj skrawki za pomocą mocownika DPX (ksylan ftalanu dibutylu) do histologii, dodając dwie krople podłoża montażowego do szkiełek i powoli pokrywając szkiełkami nakrywkowymi.
      UWAGA: Ponieważ zanurzenie tkanki w rosnących stężeniach alkoholu podczas odwodnienia powoduje przenikanie alkoholu do tkanek i zastąpienie wody alkoholem, należy określić dokładny czas odwodnienia i nie należy nadmiernie odwadniać tkanek. Po odwodnieniu zanurz się w ksylenie, aby sklarować tkankę i usunąć nadmiar lub pozostały alkohol.
  13. Formantów
    1. Powtórzyć sekcje 1.1–1.12, pomijając przeciwciało pierwszorzędowe i/lub zastępując przeciwciało pierwszorzędowe lub przeciwciało drugorzędowe IgG TBS (kontrole ujemne).
    2. Powtórzyć sekcje 1.1–1.12, wstępnie wchłaniając każde przeciwciało pierwszorzędowe z nadmiarem odpowiedniego peptydu (100 mg peptydu/1 ml rozcieńczonej surowicy).
    3. Powtórzyć sekcje 1.1–1.12, używając różnych tkanek jako kontroli dodatniej (np. tkanki myszy).
      UWAGA: Przygotuj wszystkie na świeżo, na krótko przed rozpoczęciem. Ostrożnie usuwaj nadmiar płynu na każdym etapie za pomocą pipety lub bibuły filtracyjnej wokół sekcji, zawsze utrzymując sekcje mokre.
  14. Akwizycja i analiza obrazu
    1. Uzyskuj obrazy cyfrowe przy stałym oświetleniu światłem i przy tym samym powiększeniu za pomocą mikroskopu wyposażonego w kamerę cyfrową.
    2. Przeprowadzić półilościową analizę intensywności barwienia za pomocą oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela materiałów).
      1. Otwórz przechwycone obrazy w formacie .lif lub .tiff pliku, aby ocenić wskaźniki pozytywności OX-A lub OX2-R.
      2. Wybierz przycisk w obszarze Measure (Miara) i kliknij Manual Counting (Liczenie ręczne). Policz liczbę barwionych profili komórek bezpośrednio z ekranu, umieszczając znacznik na komórkach dodatnich, klikając myszą.
      3. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) (3 x 103 μm2), aby określić ilościowo gęstość immunosygnałów (gęstość optyczną, OD).
      4. Określ piksel o największej intensywności (wysoki pozytyw) i najmniejszej intensywności (negatyw) wewnątrz analizowanego obrazu, aby przypisać zero jako wartość tła (tj. część tkanki pozbawioną poplamionych komórek).
      5. Oceń OD, pracując na logarytmicznej skali absorbancji. W cyfrowej analizie obrazu intensywność pikseli DAB waha się od najciemniejszego (wartość 0) do najjaśniejszego (wartość 255) odcienia.
      6. Określ OD, wykreślając histogram następujących elementów: log10 (255 / I), gdzie "I" jest wartością intensywności pikseli podaną przez program i określoną przez odjęcie tła.
        UWAGA: Trwała i stabilna reakcja immunoperoksydazy może być analizowana pod mikroskopem jasnego pola w dowolnym momencie. Wykonaj zliczanie oznaczonych komórek w sekcji alternatywnej, aby uniknąć podwójnego zliczania tej samej komórki z sąsiednich sekcji.

2. Protokół immunofluorescencji

  1. Sekcja tkanek
    1. Złożyć zwierzęta w ofierze i przeprowadzić sekcję zwłok zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
  2. Utrwalanie tkanek
    1. Utrwalić jelita i mózg przez zanurzenie na 3 godziny w 4% PFA w temperaturze 4 °C.
      1. Przygotować PB i 4% PFA jak w sekcji 1.2.1.
        UWAGA: Czas utrwalenia zależy od wielkości tkanki. Utrwalanie tkanek dłużej niż 4–6 godzin może prowadzić do nadmiernej fiksacji, która maskuje antygeny i ogranicza wiązanie przeciwciało-epitop.
  3. Osadzanie tkanek
    1. Płukać chusteczki 3x po 5 minut w 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. W celu krioprotekcji należy przenieść tkanki do 20% sacharozy w PB (0,1 M, pH 7,4) i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść tkanki do 30% sacharozy w 0,1 M PB (pH 7,4) i przechowywać przez dodatkową noc w temperaturze 4 °C.
    3. Osadź tkanki w bloku związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Aby to zrobić, przygotuj mały dewar ciekłego azotu, weź folię aluminiową i przekrój ją na pół, aby utworzyć patelnię. Miskę zawierającą tkanki wypełnione związkiem OCT należy zanurzyć w ciekłym azocie do czasu schłodzenia związku OCT. Zamrożone tkanki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pokrojenia.
  4. Cięcie tkanek
    1. Przenieść zamrożone bloki tkanek do kriostatu w temperaturze -20 °C i przeciąć na odcinki czołowe lub strzałkowe o wielkości 10 μm.
    2. Zebrać tkanki w naprzemiennych odcinkach szeregowych na samoprzylepnych szkiełkach podstawowych odpowiednich do celów immunohistochemicznych i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Przechowuj szkiełka w temperaturze od -20 °C do 4 °C w ciemnym pudełku na slajdy lub skoroszycie slajdów.
  5. Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania i przepuszczalność tkanek
    1. Odznaczyć obszar tkanki na szkiełku za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki.
    2. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Inkubować skrawki z 1% normalną surowicą osła rozpuszczoną w buforze permeabilizacyjnym PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu przeniknięcia przez błonę komórkową i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.
      1. Przygotować Triton X-100 0,3%, rozpuszczając 0,3 ml Triton X-100 w 100 ml 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Przygotować roztwór blokujący, rozpuszczając 1% normalnej surowicy osła w PB zawierającej 0,3% TritonX-100.
        UWAGA: Gatunki zwierząt, z których wykonana jest surowica stosowana w permeabilizacyjnych i blokujących, są zależne od gospodarza przeciwciała drugorzędowego.
  6. Inkubacja z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych
    1. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Inkubować skrawki przez noc w wilgotnym pudełku w temperaturze pokojowej z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych w PB-T. Można stosować następujące mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych: przeciwciało kozie przeciwko OX-2R rozcieńczone 1:100 / przeciwciało królika przeciwko CB1R rozcieńczone 1:100 lub przeciwciało kozie przeciwko OX-A rozcieńczone 1:100 / przeciwciało królika przeciwko CB1R rozcieńczone 1:100.
  7. Inkubacja z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych
    1. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Inkubować skrawki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z 1) mieszanką przeciwciała drugorzędowego skoniugowanego przeciwko królikowi Alexa Fluor 488 i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z kozłem przeciwko ośle Alexa Fluor 594, rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PB-T; lub 2) mieszanina przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z kozłem Alexa Fluor 488 i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z kozłem przeciwko oślikowi Alexa Fluor 594 rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PB-T.
      UWAGA: Należy użyć przeciwciał drugorzędowych wytworzonych u tego samego gospodarza zwierzęcego. Surowica prawidłowa musi należeć do tego samego gatunku przeciwciała drugorzędowego (np. należy użyć przeciwciał drugorzędowych wytworzonych u osła i normalnej surowicy osła). Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe buforem blokującym zawierającym detergent, aby zwiększyć przepuszczalność komórek i zmniejszyć tło.
  8. Montaż tkanek
    1. Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Wybarwić skrawki barwnikiem jądrowym DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol) przygotowanym rozpuszczeniem 1,5 μl DAPI (1 mg/ml) w 3 ml PB.
    3. Szkiełka nakrywkowe z medium montażowym (patrz Tabela materiałów). To wodne podłoże montażowe stabilizuje próbkę tkanki i plami do długotrwałego użytkowania. Próbki fluorescencyjne mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C. Aby przedłużyć żywotność fluorofores, należy użyć pożywki montażowej z odwadniaczem.
      UWAGA: Wybierz dobry nośnik montażowy. Jednym z najważniejszych parametrów środków montażowych jest współczynnik załamania światła (nD), który powinien wynosić około 1,5, czyli współczynnik załamania światła szkła. Zastosowana tutaj pożywka montażowa może być stosowana szczególnie w przypadku próbki przygotowanej do oznaczania enzymów i lipidów (tj. próbki, która nie może być odwodniona wstępującą serią alkoholu).
  9. Formantów
    1. Powtórzyć sekcje 2.1–2.8, pomijając przeciwciało pierwszorzędowe lub drugorzędowe lub podstawiając w określonym kroku pierwszorzędowe lub drugorzędowe surowice odpornościowe PB (kontrola ujemna).
    2. Powtórzyć sekcje 2.1–2.8, wstępnie wchłaniając każde przeciwciało pierwszorzędowe z nadmiarem względnego peptydu (100 mg peptydu/1 ml rozcieńczonej surowicy odpornościowej).
    3. Powtórzyć sekcje 2.1–2.8 na wycinkach mózgu myszy (kontrola pozytywna).
      UWAGA: Przygotuj wszystkie na świeżo, na krótko przed rozpoczęciem. Na każdym etapie ostrożnie usuwaj nadmiar płynu za pomocą pipety lub bibuły filtracyjnej wokół sekcji, zawsze utrzymując sekcję wilgotną.
  10. Akwizycja obrazu
    1. Użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik x-y-z, kamerę cyfrową oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu, takie jak NIS-Elements C, aby obserwować i analizować wybarwione immunologicznie odcinki. Uzyskuj obrazy cyfrowe za pomocą obiektywów 5-20-40x.
    2. Zrób zdjęcia każdej sekcji przy małym powiększeniu (obiektyw 10x lub 20x) w każdym z dostępnych kanałów, aby skomponować montaż o niskim powiększeniu, zapewniając przegląd całego regionu, aby ułatwić lokalizację i dokumentację anatomicznej koekspresji OX-2R/CB1R. Znormalizuj obrazy fluorescencyjne do maksymalnego kontrastu i nałóż je przed analizą.
    3. Zbieraj szeregowe stosy obrazów Z w całym obszarze zainteresowania. Uzyskaj obrazy przez sześć płaszczyzn ogniskowych (krok Z) z krokami ogniskowymi 1–1,8 μm, aby pokryć objętość tkanki, w której koekspresja OX-2R/CB1R jest wizualizowana jako żółta puncta. Aby wykonać tę kolekcję dla każdego kanału (czerwony, zielony, niebieski) osobno, za pomocą mikroskopu z silnikiem Z.
    4. Użyj oprogramowania do dekonwolucji obrazowania, aby zdekonwoluować obrazy za pomocą dziesięciu iteracji i zwinąć obrazy szeregowych płaszczyzn Z w jeden obraz projekcji maksymalnej.
    5. Dostosuj mikrografie pod kątem światła i kontrastu za pomocą programu Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      UWAGA: Wykonaj krok dekonwolucji podczas obserwacji, aby jeszcze bardziej zmniejszyć tło. Ogranicz ekspozycję szkiełka na światło, aby zapobiec fotowybielaniu.
  11. Analiza obrazu
    1. Przeprowadzić analizę ilościową koekspresji OX-2R/CB1R na naprzemiennych odcinkach o grubości 10 μm (n = 5 zwierząt na grupę), obejmując cały obszar zainteresowania każdego zwierzęcia.
    2. Określić ilościowo koekspresję OX-2R/CB1R jako liczbę żółtych dodatnich punktów za pomocą półautomatycznego systemu analizy obrazu. Oprogramowanie Imagins może zapewnić wyższy poziom szczegółowości, z danymi ilościowymi dotyczącymi obszarów nakładania się różnych sond fluorescencyjnych.
    3. Określ ilościowo puncta za pomocą narzędzi progowych dla intensywności sygnału w dwóch kanałach. Otwórz plik obrazów .liff, .tiff lub .jpg i wybierz opcję Obraz–Próg. Wybierz Ustawienie automatyczne lub Metoda ręczna i reguluj próg, aż wszystkie poplamione puncta zostaną wybrane. Przeanalizuj rozkład intensywności pikseli w obszarze obrazu, który nie zawiera żadnych obiektów znakowanych immunologicznie, aby uzyskać próg tła. Określ to tło indywidualnie dla każdego obrazu. Następnie program usuwa próg tła, ustawiając linię bazową intensywności pikseli na wartość tła.
    4. Wybierz opcję Analizuj–Pomiar i wybierz parametry, które mają być mierzone (intensywność puncta – wartości minimalne, maksymalne i średnie; liczba/gęstość punktowej znakowanej immunologicznie).
    5. Policz żółte punkty wzdłuż objętości tkanki w 4 stosach Z dla każdej sekcji, używając stosów bezpośrednio powyżej lub poniżej do najlepszej płaszczyzny ostrości. Wyklucz z analizy obszary, na których nie ma ostrości.
      UWAGA: Wykonaj zliczanie oznaczonych komórek w alternatywnej sekcji, aby uniknąć podwójnego liczenia tych samych komórek z sąsiednich sekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne dane dla barwienia immunoperoksydazy są pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2. Analiza immunohistochemiczna rozmieszczenia OX-A i OX-2R w jelicie dorosłego danio pręgowanego wykazała różne miejsca lokalizacji OX-A i OX-2R oraz ich wzrost ekspresji w komórkach jelitowych danio pręgowanego DIE. Intensywne brązowe zabarwienie dla OX-A zaobserwowano w komórkach jelita przyśrodkowego i przedniego (Ryc. 1A, A1). Immunoekspresj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przygotowanie próbki

Przygotowanie próbki jest pierwszym krytycznym krokiem w IHC. Niezawodny protokół pozwala na utrzymanie morfologii komórek, architektury tkanek i antygenowości. Ten etap wymaga prawidłowego pobrania, utrwalenia i przekroju tkanek22,23. Celem utrwalenia jest zachowanie tkanki i zmniejszenie działania enzymów tkankowych lub mikroorganizmów. W szczególności etap utrwalania zachowuje składniki k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, University of Sannio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anti CB1Abcamab23703
Anti OX-2RSanta Cruzsc-8074
Anti-OXASanta Cruzsc8070
AquatexMerck1,085,620,050
Biotynylowany królik anty-koziVector LabBA-5000
kwas cytrynowySigma Aldrich251275
Mikroskop konfokalnyNikonNikon Eclipse Ti2
KriostatLeica BiosystemCM3050S
DAPISigma Aldrich32670
Aparat cyfrowyLeica BiosystemDFC320
do mikroskopu konfokalnegoNikonDS-Qi2
Osioł anty koza Alexa fluor 488-sprzężony wtórny przeciwciałaThermo FisherA11055
Przeciwciała drugorzędowe przeciw kozom osła Alexa fluor 594 sprzężoneThermo FisherA11058
Przeciwciała drugorzędowe przeciw ośłowi królikowi Alexa fluor 488Thermo FisherA21206
Osioł anty królik Alexa fluor 594-sprzężone przeciwciała drugorzędoweThermo FisherA21207
Etanol absolutnyVWR20,821,330
Mieszanka do sekcji mrożonychLeica BiosystemFSC 22 Sekcja mrożona Media
H2O2Sigma Aldrich31642
HClVWR20,252,290
ImmPACTDAB Vector labSK4105
MikroskopLeica BiosystemDMI6000
MikrotomLeica BiosystemRM2125RT
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS7653
NaH2PO4H2OSigma AldrichS9638
NaOHSigma AldrichS8045
Normalne serum osłaSigma AldrichD9663
Normalne serum królikaVector labS-5000
wosk parafinowyCarlo Erba46793801
ParaphormaldeydeSigma AldrichP6148
cytrynian sodu dwuwodnySigma AldrichW302600
Triton X-100Fluka Analytical93420
TrizmaSigma AldrichT1503
VectaStain Elite ABC KitVector labPK6100
Ksylen CzystyCarlo Erba392603

Bibliografia

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62(2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780(2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28(2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304(2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunohistochemiareceptor oreksynyreceptor endokannabinoidowymikroskopia konfokalnaTriton X 100barwienie DAPIzatopienie w parafinie
Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.