Artykuł metodologiczny

Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59313

⸱

3 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Griffith Institute for Drug Discovery, Griffith University, 2Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, 3Discipline of Anatomy and Histology, School of Medical Science, University of Sydney, 4Bosch Institute, University of Sydney, 5Applied Neurosciences Program, Peter Duncan Neurosciences Research Unit, St. Vincent's Centre for Applied Medical Research, 6School of Medical Sciences, The University of New South Wales (UNSW) Medicine, Sydney, New South Wales, 7School of Environment and Science, Griffith University, Brisbane, Queensland, 8Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zapewniając czułość pojedynczej komórki, cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym jest wyjątkowo odpowiednia do ilościowego określania funkcji receptorów multimodalnych w żywych kulturach. Wykorzystując dorosłe nerwowe komórki progenitorowe, funkcję receptora P2X7 oceniano poprzez napływ wapnia wykrywany przez barwnik wskaźnikowy wapnia, tworzenie porów transbłonowych przez wychwyt bromku etydyny i fagocytozę za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych.

Streszczenie

Cytometria przepływowa żywych komórek jest coraz częściej używana wśród biologów komórkowych do ilościowego określania procesów biologicznych w żywej hodowli komórkowej. Protokół ten opisuje metodę, dzięki której cytometria przepływowa żywych komórek jest rozszerzana w celu analizy wielu funkcji aktywacji receptora P2X7 w czasie rzeczywistym. Korzystając z modułu czasowego zainstalowanego na cytometrze przepływowym, można ocenić i wykreślić funkcjonalność żywych komórek w danym okresie czasu, aby zbadać kinetykę napływu wapnia, tworzenia się porów transbłonowych i fagocytozy. Ta prosta metoda jest korzystna, ponieważ wszystkie trzy kanoniczne funkcje receptora P2X7 można ocenić za pomocą jednej maszyny, a zebrane dane wykreślone w czasie dostarczają informacji o całej populacji żywych komórek, a nie zapisów pojedynczych komórek, często uzyskiwanych przy użyciu technicznie trudnych metod patch-clamp. W eksperymentach z napływem wapnia wykorzystuje się barwnik wskaźnikowy wapnia, podczas gdy testy tworzenia porów P2X7 polegają na przepuszczeniu bromku etydyny przez pory transbłonowe utworzone przy wysokich stężeniach agonistycznych. Żółto-zielone (YG) kulki lateksowe są wykorzystywane do pomiaru fagocytozy. Specyficzni agoniści i antagoniści są stosowani do badania skutków aktywności receptora P2X7. Pojedynczo metody te mogą być modyfikowane w celu uzyskania danych ilościowych na temat dowolnej liczby kanałów wapniowych oraz receptorów purynergicznych i zmiatających. Podsumowując, podkreślają, że zastosowanie cytometrii przepływowej żywych komórek w czasie rzeczywistym jest szybką, opłacalną, powtarzalną i wymierną metodą badania funkcji receptora P2X7.

Wprowadzenie

Badanie sygnalizacji purynergicznej jest szerokie i wieloaspektowe, obejmując fizjologię komórkową, biochemię i farmakologię. Sygnalizacja purynergiczna bierze udział w nieskończonej liczbie procesów komórkowych i molekularnych, od raka i regulacji cyklu komórkowego po komunikację komórka-komórka i biologię komórek macierzystych; W związku z tym często istnieje potencjał do modulowania sygnalizacji purynergicznej w celu uzyskania korzyści terapeutycznych. Spośród receptorów purynergicznych, receptor P2X7 zyskał w ostatnich latach znaczną uwagę ze względu na jego potencjał jako celu terapeutycznego w wielu stanach zapalnych1. Metody badania receptora ewoluowały i były dostosowywane na przestrzeni lat, aby ułatwić te badania2,3,4,5. W tym miejscu opisujemy metodę cytometrii przepływowej żywych komórek w celu zbadania wielu funkcji receptorów P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych pochodzących ze strefy podkomorowej (SVZ) i zakrętu zębatego hipokampa.

Receptor P2X7 został po raz pierwszy opisany jako receptor P2Z, lub receptor 'śmierci komórkowej', ponieważ jego aktywacja przy wysokich stężeniach trifosforanu adenozyny (ATP) powoduje powstanie dużego transbłonowego poru przepuszczalnego dla cząsteczek do 900 Da6. Prowadzi to do rearanżacji cytoszkieletu, tworzenia się porów transbłonowych i, potencjalnie, apoptozy i/lub martwicy7. Tradycyjnie, ta funkcja P2X7 jest określana ilościowo przez wychwyt barwników o dużej masie cząsteczkowej, takich jak YO-PRO-1 lub bromek etydyny, które fluoryzują po interkalacji z DNA3,8. Metody czytnika płytek, które są szybkie i pozwalają na skalowanie, na ogół nie pozwalają na obserwację kinetyki. Opisana tutaj metoda opiera się na wychwytywaniu etydyny i pozwala na obserwację wzrostu fluorescencji w czasie, zapewniając większą głębię informacji w odniesieniu do szybkości tworzenia porów. Od tego czasu wykazano, że receptory P2X7 ułatwiają szereg funkcji nieimmunologicznych, z różnymi odpowiedziami w zależności od czasu ekspozycji i stężenia agonisty9,10. Krótka aktywacja przez niższe stężenia ATP powoduje napływ kationów w celu transdukcji neuroprzekaźnika i sygnału11. Wykorzystanie cytometrii przepływowej do pomiaru napływu wapnia pozwala przezwyciężyć problemy związane z kłopotliwymi i technicznie trudnymi metodami - w szczególności zaciskaniem łat do pomiaru prądów wewnętrznych, które dostarczają bezcennych szczegółów na temat zmiany potencjału przez błonę komórkową, ale nie pozwalają na analizę populacji2. Trzecia funkcja receptorów P2X7 występuje przy braku ATP, gdzie wykazano, że receptory P2X7 ułatwiają fagocytozę zarówno w układzie odpornościowym, jak i nerwowym9,12,13. Postępy w technikach mikroskopowych umożliwiły wizualizację przegrupowań cytoszkieletu podczas procesu absorpcji, chociaż kwantyfikacja i analiza populacji nadal mogą stanowić wyzwanie.

Opisana tutaj metoda cytometrii przepływowej żywych komórek pozwala na badanie wszystkich trzech głównych funkcji receptorów P2X7 w czasie rzeczywistym. Włączenie modułu czasowego do cytometru przepływowego umożliwia kontrolę temperatury i ciągłe mieszanie komórek w zawiesinie. Bodźce agonistyczne i antagonistyczne mogą być dostarczane w ciągu sekundy, co pozwala na niemal nieprzerwany pomiar odpowiedzi komórkowej. Jest to szybka i prosta metoda powtarzalnego określania ilościowego funkcji przy jednoczesnym unikaniu stosowania wielu systemów testowych. Ważne jest, aby pamiętać, że protokół ten można łatwo dostosować do dowolnego typu komórki i można go wykorzystać do badania innych podtypów receptorów, biorąc pod uwagę włączenie określonych agonistów lub inhibitorów, w zależności od ich właściwości.

Protokół

Zwierzęta były traktowane zgodnie z Australijskim Kodeksem Postępowania w Opiece i Wykorzystywaniu Zwierząt do Celów Naukowych i zatwierdzone do użytku przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Griffith.

1. Kultura neurosfery neuronalnych komórek progenitorowych z dorosłego SVZ i Hipokampa

UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół sekcji jest oparty na pracy Walkera i Kempermanna, a szczegółowy protokół sekcji nerwowych komórek progenitorowych od dorosłych myszy jest dostępny gdzie indziej14. Warunki hodowli zostały zmodyfikowane z Babu i współpracowników15. Wykorzystano dorosłe samice myszy C57BL/6 w wieku 8–12 tygodni.

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj pożywkę hodowlaną (podstawową pożywkę neuronalną) uzupełnioną suplementem proliferacji nerwowych komórek macierzystych, 2 mM glutaminy, 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 2 μg/ml heparyny.
  2. Poddaj eutanazji dwie myszy przez wdychanie CO2 . Alternatywnie, znieczulij myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i natychmiast poddaj je eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj ich głowy 70% etanolem i odetnij im głowy. Przenieś każdą głowę do sterylnej probówki zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) z 1x roztworem penicyliny/streptomycyny (P/S).
  3. Wykonaj sekcje w okapie z przepływem laminarnym pod mikroskopem preparacyjnym.
  4. Za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń tkankę i kość, aby odsłonić mózg, a następnie przenieś je do sterylnego naczynia zawierającego HBSS z P/S.
  5. Ustaw brzuszną stronę mózgu do góry i użyj ostrza skalpela, aby wykonać pełne nacięcie koronalne w poprzek skrzyżowania wzrokowego. Trzymaj mózg stabilnie kleszczami i użyj jednego szybkiego, czystego ruchu w dół. Unikaj piłowania, aby zminimalizować śmierć komórek i pomóc w utrzymaniu struktury tkanki.
    nuta: Jeśli nie jest trzymany bezpiecznie, mózg może przechylić się do przodu podczas cięcia, zmniejszając liczbę komórek progenitorowych uzyskanych z SVZ.
  6. Odizoluj SVZ od rostralnej połowy mózgu.
    1. Zlokalizuj obie komory, oddzielone przegrodą, z ciałem modzelowatym tworzącym nad nimi biały most.
    2. Użyj kleszczy, aby usunąć przegrodę oddzielającą dwie komory i odizolować boczne ściany przednich komór bocznych. Zrób to, odcinając powyżej, poniżej, na boki i z przodu drobnymi nożyczkami do preparowania. Pozostanie tylko mały kształt przypominający miseczkę.
    3. Przygotuj czystą pokrywkę szalki Petriego z kilkoma kroplami HBSS w środku i przenieś SVZ do płynu. Nie pozwól, aby chusteczka wyschła lub dotknęła suchej powierzchni. Stań z boku podczas preparowania hipokampów.
  7. Odizoluj hipokampy od ogonowej połowy mózgu.
    1. Wykonaj cięcie linii środkowej między półkulami, aby przeciąć ciało modzelowate. Użyj komór bocznych jako przewodnika i delikatnie rozłóż korę, aby odsłonić hipokamp. Po rozwinięciu kory mózgowej hipokamp może być postrzegany jako gęsta, biała, zakrzywiona struktura.
    2. Użyj drobnych nożyczek preparacyjnych lub kleszczy, aby odizolować hipokamp od sąsiedniej tkanki.
    3. Za pomocą kleszczy usuń nadmiar istoty białej, naczynia krwionośne i wszelką błoniastą tkankę pokrywającą hipokamp.
    4. Przygotuj czystą pokrywkę szalki Petriego przygotowaną z kilkoma kroplami HBSS i przenieś hipokamp do płynu. Powtórz dla drugiej półkuli.
  8. Po wyizolowaniu hipokampa i SVZ od dwóch myszy i przeniesieniu ich na odpowiednie pokrywki szalki Petriego, mechanicznie pokrój tkankę w kostkę za pomocą ostrza skalpela. Posiekaj tkankę pod jedną pokrywką szalki Petriego przez około 1 minutę, obracając co 10 sekund, aż tkanka stanie się gładka i pozostaną tylko drobne kawałki. Weź czyste ostrze skalpela i powtórz dla drugiego naczynia, krojąc tkankę w kostkę przez 1 minutę.
  9. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś całą tkankę z każdej pokrywki szalki Petriego do oddzielnych probówek zawierających 1 ml 0,25% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Użyj jednej rurki do SVZ i jednej rurki do hipokampa.
    1. W tym celu należy najpierw odpipetować około połowy trypsyny-EDTA do tkanki w naczyniu, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza i zapobiec kontaktowi tkanki z suchą końcówką pipety podczas przenoszenia do probówki. Opłucz naczynie i ostrze skalpela resztą trypsyny-EDTA, aby zebrać jak najwięcej tkanki i dodać ją do probówki.
  10. Inkubować tkankę z trypsyną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut, mieszając probówkę co 10 minut, aby prawidłowo zdysocjować tkankę.
  11. Rozcierać tkankę za pomocą pipety Pasteura z polerowanego ogniowo, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Uważaj, aby nie przesadzić z rozlaniem, ponieważ spowoduje to nadmierną lizę komórek. Jest to kluczowy krok dla optymalnej dysocjacji tkanek.
  12. Obserwuj zawartość probówki podczas procesu rozcierania i zatrzymuj się przy najwcześniejszych oznakach, że większość grudek tkanek została usunięta. Roztwór trypsyny powinien stać się lekko mętny, gdy komórki przejdą w zawiesinę jednokomórkową, chociaż mogą pozostać pewne grudki.
    nuta: Jako wskazówkę, przechodzenie zawieszenia w górę iw dół 10x–15x jest wystarczające.
  13. Dodaj pożywkę hodowlaną do 5 ml, aby zneutralizować trypsynę i wiruj w 300 x g przez 3 minuty. Przemyj kolejne 2x HBSS i przepuść pożywkę przez sitko do komórek 70 μm, aby usunąć wszelkie grudki tkanki.
  14. Przenieść wszystkie komórki z 15 ml pożywki do kolby do hodowli komórek T75.
    nuta: Kule powinny powstać w pasażu zero (P0) kulturze SVZ po 7–10 dniach i po 15–20 dniach w kulturze hipokampa. W tym czasie powstrzymaj się od mycia lub karmienia komórek, aby zmaksymalizować liczbę nerwowych komórek progenitorowych w hodowli. Jeśli wymagana jest większa liczba komórek progenitorowych lub skrócenie czasu inkubacji P0, możliwe jest zwiększenie liczby uśmiercanych myszy.
  15. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i po początkowej fazie hodowli P0 przechodzić przez nie co 7–10 dni, jeśli to konieczne, przy użyciu komory bezpieczeństwa biologicznego i standardowych praktyk hodowli tkankowych.
    nuta: Kultura hipokampa P0 powinna wytworzyć wystarczającą ilość kulek, aby przejść do kolby T25; kultura SVZ wygeneruje o wiele więcej sfer i może zostać przeniesiona do T75. Jeśli kulki hipokampa P0 przylegają, użyj pipety o pojemności 200 μl, aby delikatnie podnieść kulkę.
  16. Przejdź przez kule, gdy osiągną średnicę od 150 do 200 μm. Zebrać kulki i pożywkę w probówce o pojemności 15 ml i pozostawić kulki do osiadania pod wpływem grawitacji przez około 5 minut. Alternatywnie wiruj na niskich obrotach (100 x g) przez 2 minuty.
  17. Usuń pożywkę i zdysocjuj komórki odczynnikiem dysocjacyjnym przez 7–10 minut, w zależności od wielkości kulek.
    nuta: Zastosowany odczynnik dysocjacyjny będzie miał znaczący wpływ na wynik hodowli, dlatego szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli Materiałów.
  18. Umyć komórki, dodając 5 ml HBSS do roztworu komórkowego i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej i wysiać na około 150 000 komórek w 5 ml pożywki w kolbie do hodowli komórek T25 lub równoważnej. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  19. Potwierdź status neuronalnych komórek progenitorowych, identyfikując ekspresję markerów komórek macierzystych, takich jak Sox2 i ASCL1, przed przejściem do dowolnego dalszego protokołu9.
    nuta: Można to zrobić za pomocą preferowanej przez badacza metody (np. immunochemia za pomocą mikroskopii, cytometrii przepływowej lub western blot lub za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR)).

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej do analizy metodą cytometrii przepływowej

  1. Przygotuj wymagany nośnik. Należą do nich następujące elementy.
    1. Przygotować pożywkę Na+ zawierającą 145 mM NaCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukozy, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1 mM CaCl2. Pożywka ta jest również stosowana w postaci bezwapniowej, z pominięciem 0,1 mM CaCl2.
    2. Przygotować pożywkę K+ zawierającą 145 mM KCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukozy i 0,1% BSA.
      nuta: Media te zostały gruntownie zoptymalizowane i zostały szczegółowo opisane w poprzednich publikacjach4,5.
    3. Przygotuj zapas ATP, ważąc wystarczającą ilość proszku ATP na około 20 ml 100 mM zapasu. Rozpuścić proszek w 17 ml buforu KCl (145 mM KCl, 5 mM KOH i 10 mM HEPES, pH 7,5) i powoli, mieszając, dodać 2 ml 18% (w/v) wodorotlenku tetrametyloamonu (TMA) do roztworu, aby doprowadzić pH do 6,8–7,0.
    4. Dostosuj końcową objętość do 20 ml. Nie przekraczaj pH powyżej 7,0. Przechowywać wywar w temperaturze -80 °C; należy zauważyć, że podwielokrotności ATP są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.
      nuta: Wolna masa cząsteczkowa bezwodnego ATP wynosi 551,14 g/mol i nie obejmuje masy cząsteczkowej cząsteczki wody i disodu, która może się różnić w zależności od partii i powinna być brana pod uwagę w obliczeniach. TMA jest toksyczny i należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nim. Przeczytaj kartę charakterystyki i przygotuj zapasy w dygestorium.
    5. Przygotować BzATP przez rozpuszczenie BzATP w ultraczystymH2Odo końcowego stężenia podstawowego 10 mM.
  2. Utwórz zawiesinę jednokomórkową zgodnie z opisem w krokach 1.16 i 1.17. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Ponownie zawiesić komórki w wymaganym podłożu (np. pożywce Na+, pożywce hodowlanej) na czas przeprowadzanego eksperymentu (jak opisano poniżej) i w międzyczasie umieścić komórki na lodzie.
  3. Dla każdego eksperymentu upewnij się, że jest wystarczająca ilość próbki, aby uwzględnić kontrole dla rozproszenia do przodu i bocznego, a także do kalibracji napięcia i ustawień kompensacji. Proszę zauważyć, jako wskazówkę, że kulki hodowane w kolbie T75 zwykle dają około 8 x 106 komórek na kolbę.
  4. Ustawić ustawienia cytometru przepływowego za pomocą próbek kontrolnych.
    1. Użyj rozpraszania do przodu i z boku, aby selektywnie zabramować żywe komórki.
      UWAGA: Rozproszenie do przodu dostarcza informacji o rozmiarze komórki na podstawie dyfrakcji światła, podczas gdy rozproszenie boczne zapewnia miarę wewnętrznej złożoności lub ziarnistości. Zdarzenia przepływu z małym rozproszeniem do przodu i z boku mogą być uważane za martwe komórki.
    2. Dostosuj napięcie i wzmocnienie cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom próbkę próbną, aby zapewnić uchwycenie danych przy maksymalnej intensywności fluorescencji. W przypadku przejęć jednokanałowych nie jest wymagana żadna rekompensata.

3. Pomiar dopływu wapnia za pomocą cytometrii przepływu żywych komórek

  1. Po przygotowaniu zawiesiny jednokomórkowej należy ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki bezwapniowej Na+ i obciążyć je 2 ng/ml barwnika wskaźnikowego wapnia zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów) z 10 μl 5% kwasu pluronowego. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Umyj komórki, dodając 3–5 ml bezwapniowej pożywki Na+ i delikatnie odwiruj (200 x g przez 4 min). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce bezwapniowej Na+, przemłukując je po raz drugi.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml bezwapniowej pożywki Na+, umieścić je na lodzie i pozostawić do deestryfikacji na 30 minut.
  4. Przemyć 1x więcej, dodając 3–5 ml pożywki K+ i odwirowując (200 x g przez 4 min); następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce K+ i podzielić je na porcje do probówek do sortowania komórek wspomaganych fluorescencją (FACS) w stężeniu 1 x 106 komórek na 500 μL na probówkę FACS.
    nuta: Liczba probówek FACS na próbkę będzie zależeć od liczby zabiegów i powtórzeń, które są uwzględnione.
  5. Umieść probówki FACS na lodzie, aż komórki będą gotowe do analizy. Nie pozostawiaj komórek na lodzie przez dłuższy czas, ale rozpocznij test tak szybko, jak to możliwe.
  6. W przypadku niektórych próbek przed analizą należy wstępnie inkubować komórki z inhibitorem specyficznym dla receptora P2X7 AZ10606120 (1 μM przez 10–15 min) lub A438079 (10 μM przez 30 min) w temperaturze 37 °C.
  7. Na kilka minut przed uruchomieniem pierwszej próbki dodać CaCl2 (do końcowego stężenia 1 mM w probówce FACS) i umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu odzyskania sprawności.
  8. Wrzuć czyste, małe mieszadło magnetyczne do probówki FACS i umieść rurkę w module czasu połączonym z krążącą łaźnią wodną o temperaturze 37 °C, aby kontrolować temperaturę próbki. Wybierz niską prędkość mieszania, aby zapewnić ruch próbki bez wprowadzania efektu wiru. Umieść adapter rurki z płaszczem wodnym na platformie próbki i zamknij ramię dźwigni maszyny FACS.
  9. Zainicjuj pobieranie próbki i uruchom ją przez 3 minuty z prędkością około 1 000 zdarzeń na sekundę.
  10. Po upływie 40 s szybko wyjmij probówkę i dodaj agonistę P2X7, 1 mM ATP lub 300 μM BzATP, a następnie wymień probówkę, aby kontynuować akwizycję.
  11. Podczas rejestracji pierwszej próbki należy przygotować drugą próbkę z CaCl2 i umieścić ją w temperaturze 37 °C, aby dać wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie komórek przed analizą. Po zakończeniu pracy nad pierwszą próbką oczyść wlot, uruchamiając próbkę wody, a następnie można rozpocząć pobieranie drugiej próbki zgodnie z opisem w krokach 3.8 i 3.9. Zawsze czyść wlot między próbkami.

4. Pomiar powstawania porów za pomocą cytometrii przepływowej żywych komórek

  1. Utwórz zawiesinę jednokomórkową zgodnie z opisem w krokach 1.16 i 1.17. Zaoszczędź kilka mililitrów starego podłoża, użyj go do ponownego zawieszenia komórek w stężeniu 1 x 106 komórek na 100 μl na probówkę FACS i umieść go na lodzie, aż będzie gotowy.
  2. Przed przeprowadzeniem testu dodać 900 μl pożywki K+ na końcową objętość 1 ml i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby odzyskać sprawność.
  3. W stosownych przypadkach należy wstępnie inkubować komórki z zabiegami, w tym inhibitorami specyficznymi dla P2X7 AZ10606120 (1 μM przez 10–15 min) lub A438079 (10 μM przez 30 min).
  4. Bezpośrednio przed uruchomieniem testu dodaj 25 μM bromku etydyny do probówki FACS; następnie dodaj mieszadło magnetyczne, umieść je na maszynie FACS zgodnie z krokiem 3.7 i rozpocznij akwizycję.
    nuta: Bromek etydyny jest toksyczny i należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nim. Zużyte probówki FACS należy zutylizować w odpowiedni sposób.
  5. Aby indukować tworzenie się porów w błonie komórkowej, dodaj 1 mM ATP lub 100 μM BzATP 40 s po rozpoczęciu akwizycji.
  6. Uruchom próbki z częstotliwością około 1 000 zdarzeń na sekundę przez 6 minut.
  7. Podczas pracy pierwszej próbki należy pobrać drugą próbkę z lodu i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby dać komórkom wystarczająco dużo czasu na regenerację przed analizą. Po zakończeniu pobierania pierwszej próbki należy oczyścić wlot, uruchamiając próbkę wody; Następnie drugą próbkę można umieścić na urządzeniu, aby rozpocząć nagrywanie zgodnie z opisem w krokach 3.8 i 3.9.

5. Pomiar fagocytozy za pomocą cytometrii przepływowej żywych komórek

  1. Utwórz zawiesinę jednokomórkową zgodnie z opisem w krokach 1.16 i 1.17. Ponownie zawiesić komórki w kondycjonowanym podłożu i podzielić je na probówki FACS o stężeniu co najmniej 1 x 106 komórek na 100 μl na probówkę FACS. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml pożywką Na+ (np. dodać 900 μl pożywki Na+) i umieścić komórki na lodzie do czasu przeprowadzenia analizy.
  2. Użyj 1 μm kulek lateksowych YG (mikrosfer) jako celów fagocytarnych do testów fagocytozy w czasie rzeczywistym.
    nuta: Inne kolory mogą być również podstawione, ale koraliki o różnych rozmiarach okazały się nieodpowiednimi celami fagocytozy4.
  3. Przed badaniem pierwszej próbki należy przenieść komórki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować je przez około 7–10 minut, aby umożliwić komórkom regenerację.
  4. Dodaj wszelkie zabiegi wymagające preinkubacji do odpowiednich probówek, w tym 1 mM ATP przez 15 minut, 300 μM utlenionego ATP (oxATP) przez 40 minut, 20 μM cytochalazyny D przez 20 minut i 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut.
    1. W przypadku 5% surowicy ludzkiej nie jest wymagana preinkubacja. Jeżeli zabiegi są dodawane mniej więcej w tym samym czasie, próbki można badać w odwrotnej kolejności, podczas gdy pozostałe kontynuują inkubację. Na przykład najpierw uruchom kontrolę i surowicę, następnie próbkę potraktowaną ATP, następnie cytochalazynę D i PFA, a na końcu oksATP.
  5. Umieścić próbkę na cytometrze za pomocą mieszadła magnetycznego zgodnie z opisem w krokach 3.8 i 3.9, a następnie rozpocząć pobieranie próbki.
  6. Wyjąć probówkę z próbką z urządzenia 15–20 s po rozpoczęciu pobierania i dodać 5 μl nierozcieńczonych kulek YG. Zwróć probówkę FACS próbki i kontynuuj akwizycję. Próbki należy badać przez 7–8 minut z prędkością około 1 000 zdarzeń/s.
  7. Podczas pracy pierwszej próbki należy pobrać drugą próbkę z lodu i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby dać komórkom wystarczająco dużo czasu na regenerację przed analizą. Po zakończeniu pierwszej próbki należy oczyścić wlot, uruchamiając próbkę wody, a następnie rozpocząć pobieranie drugiej próbki zgodnie z opisem w krokach 3.8 i 3.9.

6. Analiza danych

  1. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Analiza danych będzie zależała od pytania eksperymentalnego.
    nuta: Należy pamiętać, że różne serie mogą mieć różną intensywność wyjściową, dlatego ważne jest, aby przeprowadzić test przez wyznaczony czas na początku (około 40 s) przed dodaniem jakichkolwiek agonistów i znormalizować dane poprzez obliczenie zmiany fluorescencji (fluorescencja w dowolnym punkcie czasowym [F] podzielona przez fluorescencję w punkcie czasowym zero [F0], lub F/F0).
  2. Aby określić ilościowo szybkość lub kinetykę danej funkcji P2X7, oblicz pole pod krzywą lub sumę trapezów utworzonych pod krzywą dla każdego 10-sekundowego okresu czasu16.
  3. Aby określić efekty zabiegów, uśrednij intensywność fluorescencji w ciągu ostatnich 10–20 sekund rejestracji i porównaj zabiegi. Określ istotność za pomocą testu t lub analizy wariancji.

Wyniki

Kultury komórek progenitorowych neuronów

Kultury sfer progenitorowych neuronów otrzymane tą metodą powinny być jasne w kontraście fazowym i mieć gładki, okrągły brzeg (Rycina 1A,B). W zdrowych kulturach na brzegach można zaobserwować małe mikrokolce (Rycina 1C). W późnych pasażach lub w przypadku niewłaściwego odżywiania sfery mogą przybierać kształt pustej w środku czary (Rycina 1D) lub duże, wydłużone kształty (Rycina 1E, wskazane strzałką). Takich kultur nie należy stosować do cytometrii przepływowej ani żadnych innych dalszych zastosowań, ponieważ cechy te mogą wskazywać na różnicowanie. Aby potwierdzić status progenitorów neuronowych, komórki wysiano na szklane nakrywki pokryte poli-L-ornityną i lamininą do immunocytochemii (Rycina 1F oraz, przy większym stopniu konfluencji, Rycina 1G). Komórki wybarwiono przeciwciałami przeciwko GFAP, nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 i DCX, aby zidentyfikować je jako komórki progenitorowe typu 2 (hipokamp) lub komórki progenitorowe typu C (SVZ)9. Komórki powinny posiadać wyraźnie zarysowane jądro oraz wydłużone wypustki.

Morfologia komórkowa w mikroskopii w polu jasnym; wzrost organoidów, komórki macierzyste; badania naukowe.
Rycina 1: Reprezentatywna hodowla neuronalnych komórek progenitorowych hipokampa. (A) Neuronalne komórki progenitorowe hipokampa są izolowane z dorosłych myszy i hodowane jako neurosfery do momentu osiągnięcia średnicy około 100 do 150 µm. (B) Neurosfery powinny mieć gładki obwód, (C) a na ich powierzchni mogą być widoczne niewielkie mikrokolece. Gdy sfery pozostają w hodowli zbyt długo, mogą przybrać kształty (D) miseczkowate lub (E) wydłużone. Tych hodowli nie należy wykorzystywać do eksperymentów. Aby potwierdzić status progenitorowy komórek, należy wysiać je w formie zawiesiny pojedynczych komórek na szkiełka podstawowe pokryte poli-L-ornityną (PLO) i lamininą do badań immunochemicznych. Komórki powinny mieć małe ciało komórkowe i rozgałęzione wypustki, (F) przy niskim stopniu konfluencji i (G) być przygotowane do immunochemii. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pomiar napływu jonów wapnia metodą cytometrii przepływowej żywych komórek

Niniejszy protokół umożliwia analizę funkcji receptora P2X7 jako kanału wapniowego w czasie rzeczywistym. Można również ocenić kinetykę funkcji receptora, a także efekty działania różnych agonistów i antagonistów. Na wykresach czasowych napływ wapnia w komórkach progenitorowych neuronów hipokampa i SVZ był ogólnie podobny (odpowiednio Rysunek 2A i Rysunek 2B). Agoniści (ATP lub BzATP) zostali dodani w 40 s, co zaznaczono czerwoną strzałką. Na krótką chwilę probówka zostaje odsunięta od punktu pomiarowego w celu dodania agonisty, co skutkuje pojawieniem się punktów danych o wartości zero. Pozwala to na zidentyfikowanie momentu dodania agonisty. BzATP szybko aktywuje receptory P2X7, otwierając kanał jonowy i umożliwiając napływ wapnia, który wiąże się z Fluo-8 i fluorescuje. Aplikacja ATP zazwyczaj skutkuje bardziej stopniowym napływem wapnia. Wykazuje ono niższe powinowactwo do P2X7 w porównaniu do BzATP i powoduje również aktywację receptorów sprzężonych z białkiem G, co jest wolniejszą ścieżką sygnalizacji uwalniającą wapń z retikulum endoplazmatycznego. Zastosowanie antagonistów P2X7 A438079 i AZ10606120 (dane niepokazane) zredukowało napływ wapnia w odpowiedzi na aplikację agonistów.

Napływ wapnia w NPC; wykres przedstawia F/F0 w czasie dla BzATP, ATP, ATP+A438079, warunków bazowych.
Rycina 2: Napływ wapnia w żywych komórkach progenitorowych neuronów z hipokampa i SVZ. Funkcję kanału wapniowego receptora P2X7 wykazano w (A) komórkach progenitorowych hipokampa i (B) komórkach progenitorowych pochodzących z SVZ poprzez zmiany fluorescencji Fluo-8. Zastosowanie ogólnego agonisty P2X, ATP, oraz agonisty P2X7, BzATP, skutkuje otwarciem kanałów jonowych P2X7, umożliwiając napływ wapnia. Napływ ten został zablokowany za pomocą specyficznych inhibitorów P2X7 A438079 lub AZ10606120 (dane nie pokazano). F = fluorescencja; F0 = fluorescencja w punkcie czasowym zero. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tworzenie porów za pomocą cytometrii przepływowej żywych komórek

Tworzenie porów transbłonowych jest kanoniczną cechą receptorów P2X7, skutkuje wymianą makrocząsteczek i może prowadzić do śmierci komórki. Etydium+ jest dużą cząsteczką (314 Da), która nie przenika do zdrowych komórek; jego pobranie i następująca po nim interkalacja z DNA skutkuje emisją fluorescencji i może być wykorzystane do oceny zdolności receptorów P2X7 do tworzenia porów transbłonowych. Po zastosowaniu agonistów ATP (1 mM ATP) i BzATP (100 μM) w 40 s (oznaczonych strzałką), cytometria przepływowa z rozdzielczością czasową rejestruje w czasie rzeczywistym wnikanie bromku etydium do komórek (Rycina 3A). Efekt ten został osłabiony przez specyficzny inhibitor P2X7 AZ10606120. Test pobierania bromku etydium wykazuje funkcjonalność końca C receptora P2X717 i stanowi dowód na ekspresję pełnej długości receptora P2X7. Testy odpowiedzi na stężenie ATP obrazują wpływ stężenia agonisty na tworzenie porów P2X7, wykorzystując zmianę fluorescencji bromku etydium w czasie (Rycina 3B). Krzywe zależności odpowiedzi od dawki agonisty wraz ze specyficznymi inhibitorami receptora stanowią silny dowód na aktywację receptora.

Wykresy pobierania bromku etydium i odpowiedzi na dawkę; efekt stężenia ATP; wzrost fluorescencji.
Rysunek 3: Tworzenie porów transbłonowych P2X7 mierzone poprzez pobieranie etydium. Dodanie bromku etydium chwilę przed rozpoczęciem akwizycji służy do pomiaru tworzenia się transbłonowych porów P2X7. Wysokie stężenia ATP i BzATP prowadzą do (A) tworzenia porów w receptorach P2X7, co umożliwia wniknięcie bromku etydium do komórki. Inhibitor P2X7 AZ10606120 osłabia to zjawisko i stanowi dowód na obecność funkcjonalnych receptorów P2X7. (B) Testy zależności odpowiedzi od stężenia ATP wykazały znaczące tworzenie porów przy 500 μM i 1 mM, ale nie przy niższych stężeniach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Fagocytoza w analizie przepływowej żywych komórek

Nasza grupa wykazała wcześniej, że zewnątrzkomórkowy ATP hamuje fagocytozę pośredniczoną przez P2X7 poprzez dysocjację końca C-końcowego P2X7 od cytoszkieletu, a konkretnie od nie mięśniowej miozyny IIA18,19. Niniejsza metoda rozwija te odkrycia, aby w czasie rzeczywistym zademonstrować udział receptora P2X7 w fagocytozie prowadzonej przez komórki progenitorowe neuronów hipokampa i strefy podkomorowej (SVZ) (Rycina 4, przykład fagocytozy w hipokampie). Poziomy niehamowanej fagocytozy (kontrola) kulek lateksowych YG o rozmiarze 1 µm ustanowiono jako kontrolę pozytywną. ATP hamowało fagocytozę kulek YG w takim samym stopniu jak inhibitory nieswoiste, mianowicie fiksacja PFA i inhibitor polimeryzacji aktyny cytochalazyna D, natomiast 5% surowicy zniosła całą wrodzoną fagocytozę20.

Wykres fagocytozy kulek YG; pobieranie kulek w różnych warunkach; Kontrola, PFA, ATP, Surowica, CytD.
Rysunek 4: Pobieranie kulek YG wykazujące zdolność fagocytarną progenitorów neuronów za pośrednictwem receptorów P2X7. Pobieranie kulek YG przez komórki progenitorowe neuronów można obserwować w czasie rzeczywistym za pomocą cytometrii przepływowej żywych komórek. Poziomy kontrolne fagocytozy są ustalane na początku, a jeśli liczba komórek na to pozwala, potwierdzane na koniec pomiaru. O udziale receptorów P2X7 świadczy hamowanie fagocytozy w obecności ATP, ponieważ powoduje ono dysocjację końca C od cytoszkieletu błonowego, co zapobiega zależnym od P2X7 reorganizacjom cytoszkieletu. Zastosowanie ATP zablokowało fagocytozę w tym samym stopniu, co użycie niespecyficznych inhibitorów fagocytozy, w tym paraformaldehydu (PFA) i cytochalazyny D (CytD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W pracy przedstawiono szczegółowy protokół analizy funkcji receptora P2X7 w kulturach neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z dorosłych nisz neurogennych. Potencjalne zastosowania dorosłych nerwowych komórek progenitorowych obejmują zarówno cele badawcze, jak i terapeutyczne, dlatego metoda hodowli musi być solidna i powtarzalna. Istnieje wiele kluczowych aspektów tego protokołu, które mogą mieć wpływ na jakość kultury punktów końcowych. Po wyjęciu z czaszki mózg nie powinien być dopuszczony do wyschnięcia, a sekcja powinna zostać przeprowadzona tak szybko, jak to możliwe. Szczególnie w przypadku hipokampa, dodatkowa ostrożność podjęta w celu usunięcia wszelkich naczyń krwionośnych lub tkanki błoniastej zaowocuje lepszą wydajnością komórek progenitorowych. Proces dysocjacji i trituracji może mieć duży wpływ na liczbę sfer uzyskanych w kulturze; mieszanie tkanki podczas inkubacji z trypsyną-EDTA spowoduje uzyskanie bardziej jednorodnego roztworu. Zdecydowanie zaleca się stosowanie pipety pastwiskowej z polerowanego ogniowo szkła zamiast plastikowej końcówki pipety P1000 w celu zmniejszenia śmierci komórek i poprawy uzyskanej hodowli. Unikaj nadmiernego trytuowania. Pomimo tych środków ostrożności procedura może spowodować powstanie wielu zanieczyszczeń w kulturze P0 i aby uniknąć utraty komórek progenitorowych, należy unikać mycia lub karmienia kultury, dopóki nie uformują się kule.

Szereg różnic między kulturami hipokampa i SVZ będzie oczywistych w P0. Kultury hipokampa dają mniej sfer, a te na ogół przylegają. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie oderwać kulki do początkowego przejścia. W kolejnych przejściach nie zaobserwowano przylegających do siebie kul. Różne marki kolb do hodowli tkankowych mogą powodować, że kulki, szczególnie sfery hipokampa, przylegają i rosną jako kolonie na dnie naczynia. Nie stwierdzono, aby wpłynęło to na jakiekolwiek dalsze wyniki dla tego protokołu, ale powinno być monitorowane, a spójność powinna być utrzymana tam, gdzie to możliwe.

Poprzednie metody stosowane do pomiaru funkcji receptora P2X7, takie jak zaciskanie plastrów w celu zarejestrowania napływu wapnia, są czasochłonne i pracochłonne i mogą dostarczać informacji tylko na temat pojedynczej komórki. Protokół ten przedstawia szybką i powtarzalną metodę analizy wszystkich trzech głównych funkcji receptorów P2X7 przy użyciu jednej maszyny. Czasowo-rozdzielcza cytometria przepływowa żywych komórek pozwala na analizę całej populacji i dostarcza badaczowi informacji dotyczących kinetyki napływu wapnia, tworzenia porów i/lub funkcji fagocytarnej. Oprócz tego cytometria przepływowa może być łatwo stosowana jako metoda oceny wzorców ekspresji markerów i analizy populacji na podstawie wielkości komórki lub poziomu ekspresji białek.

Podczas przeprowadzania tych eksperymentów można zaobserwować różnice w maksymalnym napływie wapnia, wychwytywaniu etydyny lub szybkości fagocytozy między powtórzeniami. Aby to zminimalizować, rozmiar kuli, warunki hodowli i reżim żywienia muszą być spójne, ponieważ zdrowie komórek będzie miało znaczący wpływ na uzyskane wyniki. Czas na lodzie może również wpływać na dane, więc upewnij się, że wszystko jest przygotowane z wyprzedzeniem, aby czas na lodzie był minimalny. Upewnij się, że czas ładowania barwnika wskaźnika wapnia jest stały. Innym czynnikiem, który może prowadzić do dużych niespójności w zapisach maksymalnych ilości wapnia, są różnice między partiami ATP. Przygotowanie zapasów ATP ma kluczowe znaczenie i należy unikać stosowania różnych partii do tych samych eksperymentów. Zaleca się również porównywanie starych i nowych partii w celu upewnienia się, że ATP jest spójne. Skuteczność antagonistów receptora P2X7 może być również zależna od linii komórkowej i partii, dlatego może być wymagana optymalizacja czasu inkubacji i stężeń.

Warto zauważyć, że napływ/odpływ wapnia jest jedną z najbardziej podstawowych i złożonych funkcji komórkowych i może być pośredniczony przez wiele receptorów. Indukowany przez ATP napływ wapnia, jako klasyczny pomiar funkcji kanału / porów P2X7, może nie odzwierciedlać dokładnie prawdziwej funkcji receptorów P2X7, ponieważ ATP może również aktywować receptory P2Y do uwalniania wewnątrzkomórkowego wapnia. W tym przypadku bar może być lepszym kationem do użycia zamiast wapnia, ponieważ jego napływ jest jednokierunkowy16. Aby zróżnicować udział receptorów P2Y w napływie wapnia, w tym teście można zastosować warunki, w których 1 mM EDTA lub kwas 1 mM EDTA lub glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA) dodaje się do pożywki K+ zamiast CaCl2 .

Protokół ten może być również łatwo dostosowany do innych typów komórek i może być przydatny do badania funkcjonalności alternatywnych receptorów kanałów jonowych lub receptorów, które uczestniczą w fagocytozie. Metoda ta może być również dostosowana do maszyny do cytometrii przepływowej bez modułu czasu. Na przykład testy fagocytozy można przeprowadzić, w których kulki YG są dodawane 7–8 minut przed analizą za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i ciągle je obracaj. Nie dostarczy to informacji w czasie rzeczywistym, ale różnice w średniej końcowej fluorescencji nadal będą informować badacza o funkcjonalności receptorów P2X7.

Zainteresowanie receptorami P2X7 jako celem terapeutycznym21,22 lub nawet drogą dostarczania leku23,24 szybko rośnie, dlatego metody badania tego enigmatycznego receptora muszą być stale dostosowywane i ulepszane, aby ułatwić te badania. Protokół ten przedstawia metodologie, które mogą być wykorzystane do zbadania funkcji P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych i istnieje nadzieja, że osiągnięcie lepszego zrozumienia receptorów P2X7 w niszach neurogennych może prowadzić do postępów w leczeniu udaru mózgu i innych urazów niedokrwiennych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Marii Kasherman i Xin Huangowi za ich wkład w te badania. Praca ta była wspierana przez granty Fundacji Badań Medycznych Rebecci L. Cooper dla M.W., T.C.L. i M.L. oraz dla T.C.L. z Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Australii (571100 i 1048082) oraz Fundacji Charytatywnej Baxter (Sydney, Australia). B.G. był wspierany przez Australian Research Council (ARC) Future Fellowship (FT120100581), NHMRC Project Grants (1048082, 1061419 i 1120095) oraz Victorian Government's Operational Infrastructure Support Grant dla Florey Institute. M.L. był wspierany przez Charles D. Kelman, M.D. Postdoctoral Award (2010) od International Retinal Research Foundation (USA).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A438079Tocris2972/10
ATPSigma-AldrichA2383
AZ10606120Tocris3323/10
bzATPSigma-AldrichB6396
Cytochalazyna DSigma-AldrichC8273
FACSCaliburBecton Dickinson 
Fluo-8AMAAT-Bioquest21080Fluo-4AM i Fura-Red AM również są stosowane z powodzeniem 
Mikrosfery fluoresbrite YG Polysciences Inc17154-101.00 &mikro; m, żółto-zielona
GlutaminaThermoFisher Scientific25030081200 mM
HBSSThermoFisher Scientific14170112
HeparynaSigma-AldrichH3149
NeuroCult Basal MediumStemcell Technologies5700Mysz i szczur
Suplement proliferacyjny NeuroCultStemcell Technologies5701Mysz i szczur
Utleniony ATPSigma-AldrichA6779
Pluronic  F-127Sigma-AldrichP2443kwas pluronowy
Rekombinowany mysi EGFPeprotech315-09
Rekombinowany mysi FGF-basicPeprotech450-33
Wodorotlenek tetrametyloamonuSigma-AldrichT7505
Moduł Time Zero CytekBiosciences Kolby do hodowli tkankowych
BD Falcon ( Corning)353108 (T25), 353136 (T75)Niebieska nakrętka z wentylacją
TrypLE ExpressGibco12604013
Trypsin-EDTA (0,25%)ThermoFisher Scientific25200056z czerwienią fenolową
UltraPure Ethidium BromekThermoFisher Scientific1558501110 mg/ml

Bibliografia

  1. Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
  2. Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
  3. Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64(2017).
  4. Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
  5. Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
  6. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
  7. Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
  8. North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
  9. Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
  10. Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281(2014).
  11. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  12. Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
  13. Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
  14. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225(2014).
  15. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89(2011).
  16. Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
  17. Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
  18. Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
  19. Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
  20. Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
  21. Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
  22. Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
  23. Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
  24. Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Receptor P2X7sortowanie komórek aktywowane fluorescencjąmoduł czasubromek etydynykoraliki żółto-zielone
Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.