Tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji rozpuszczalnych w wodzie rekombinowanych roztworów białek pajęczej nici oraz form materialnych, które mogą być formowane z tych roztworów.

Streszczenie

Wiele pająków wytwarza siedem rodzajów jedwabiu. Sześć jedwabi ma postać włókna, gdy są wytwarzane przez pająki. Włókna te nie są rozpuszczalne w wodzie. Aby odtworzyć niezwykłe właściwości mechaniczne pajęczych nici, muszą one być wytwarzane w heterologicznych żywicielach, ponieważ pająki są zarówno terytorialne, jak i kanibalistyczne. Syntetyczne analogi pajęczej nici są również nierozpuszczalne w roztworach wodnych. W związku z tym duży odsetek badań nad rekombinowanymi pajęczymi niciami opiera się na rozpuszczalnikach organicznych, które są szkodliwe dla produkcji materiałów na dużą skalę. Metoda naszej grupy wymusza solwatację tych rekombinowanych pajęczych nici w wodzie. Co ciekawe, gdy białka te są przygotowywane przy użyciu tej metody ciepła i ciśnienia, z tego samego roztworu rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego (rSSp) można przygotować szeroką gamę form materiałowych, w tym: folie, włókna, gąbkę, hydrożel, lyożel i kleje. W artykule przedstawiono sposób wytwarzania solwatowanego rSSp i form materialnych w sposób łatwiejszy do zrozumienia niż na podstawie samych materiałów i metod pisanych.

Wprowadzenie

Nici pajęcze wzbudziły zainteresowanie naukowców zajmujących się materiałami ze względu na ich imponującą kombinację wytrzymałości, elastyczności i biokompatybilności. Odtwarzanie włókien było tradycyjnie głównym celem badań. Wysiłki te były utrudnione przez nierozpuszczalność rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego (rSSp) w wodzie, a także niezdolność tradycyjnych technik solwatacji (środków chaotropowych i detergentów) do uzyskania solwatacji wodnej. Co więcej, techniki, które zostały opracowane do solwatacji wersji rSSp, nie działają na wszystkich wariantach rSSp, a także wymagają znacznych manipulacji i czasu, co często prowadzi do utraty białka^1,2. Doprowadziło to w dużej mierze do wykorzystania 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanolu (HFIP) jako rozpuszczalnika, z którego formuje się włókna i inne ograniczone formy materiałowe. Zaletą jest to, że wszystkie znane rSSp są rozpuszczalne w HFIP, co zapewnia jednolitość danych między każdą grupą badawczą. Wadą jest to, że HFIP jest toksycznym rozpuszczalnikiem, który jest drogi i niepraktyczny w skalowaniu ze względu na problemy zdrowotne i względy środowiskowe.

Opracowano nowatorskie podejście do solwatacji rSSp, które wypełniło lukę technologiczną między ostrym rozpuszczalnikiem organicznym HFIP a innymi technikami, które selektywnie działały dla solwatacji rSSp. Kombinację ciepła właściwego i ciśnień zastosowano do zawiesin rSSp i wody. Wyniki obejmowały bliską 100% solwatację i odzysk rSSp, a także wysokie stężenia białka; Na podstawie tych preparatów uznano, że możliwe są różne formy materiałów, które nie wszystkie były osiągalne przy użyciu HFIP lub innych rozpuszczalników organicznych^3,4,5,6. Celem tego podejścia jest skuteczne i łatwe rozpuszczanie oczyszczonych i wysuszonych rekombinowanych białek pająka w roztworze wodnym, który można następnie wykorzystać do produkcji różnych form materialnych.

Włókna, folie, powłoki, kleje, hydrożele, lyogele, mikrosfery i materiały gąbkowe są łatwo osiągalne z tego samego wodnego roztworu rSSp przy użyciu tej metody. Ciągła ewolucja tej metody, nie tylko z dodatkowym rSSp, ale także z innymi białkami, może prowadzić do nowych form materiałów oraz alternatywnych sposobów oczyszczania i rozpuszczania białek.

Protokół

1. Przygotowanie mieszanki rekombinowanej pajęczej nici z liofilizowanych białek

1. Określ niezbędną formułę i objętość wymaganą dla zamierzonych formacji materiałowych. Typowe formulacje wahają się od 3% (w/v) do 15% (w/v). Korzystając z tego wyboru, oblicz odpowiednie rSSp, stężenia i stosunki.
   1. Do przygotowania każdego materiału opisanego w niniejszym protokole należy użyć następujących odpowiednich preparatów: hydrożele/gąbki/lyogele, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; folie/powłoki, 5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2; kleje, 12% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; włókna, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2.
      UWAGA: Mimo że większość preparatów jest lepiej dopasowana do określonych form i materiałów, istnieje szeroka gama receptur, które często mogą się pokrywać. Dodatkowo, końcowe materiały rSSp mogą być również dostosowywane podczas formowania i przetwarzania, aby uzyskać pożądane właściwości. Ogólnie rzecz biorąc, każde białko będzie wymagało zbadania odpowiednich lub użytecznych parametrów.
2. Wybierz czystą i nową fiolkę o pojemności 8 ml z autoklawowalnym szkłem borokrzemianowym z gumową nakrętką.
3. Zdjąć nakrętkę i umieścić pustą fiolkę na wadze analitycznej. Staruj masę pustej fiolki tak, aby waga wskazywała masę zerową.
4. Dodaj żądany liofilizowany proszek rSSp do pustej fiolki dla każdego konkretnego materiału.
   1. Przygotowując 2 ml roztworu, należy użyć tych określonych mas każdego rodzaju białka dla każdego materiału: hydrożele/gąbki/lyogele, 60 mg MaSp1 i 60 mg MaSp2; folie/powłoki, 80 mg MaSp1 i 20 mg MaSp2; kleje, 120 mg MaSp1 i 120 mg MaSp2; włókna, 200 mg MaSp1 i 50 mg MaSp2.
5. Dodaj żądaną ilość ultraczystej wody, co najmniej 2 ml, do fiolki, która zawiera już ważone proszki rSSp.
   UWAGA: Minimalna objętość 2 ml jest zalecana dla wszystkich procedur solwatacji.
6. Uszczelnić nakrętkę fiolki i energicznie rozmieszać zawartość, aby utworzyć rozproszoną i jednorodną mieszaninę rSSp, która jest teraz gotowa do procedury solwatacji. Dodatkowe podejścia do homogenizacji, takie jak sonikacja lub mieszanie wirnikowe, mogą być stosowane z lub dodatkowo z mieszaniem wirowym.

2. Rekombinowana solwatacja pajęczej nici

UWAGA: Podczas procedury solwatacji generowane są wysokie temperatury i ciśnienia. Do tego procesu wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej, zwłaszcza okulary, długie rękawy i rękawice odporne na ciepło.

1. Przeprowadzić końcową kontrolę nakrętki fiolki lub naczynia, aby upewnić się, że została mocno i bezpiecznie dokręcona. Następnie przenieś zawieszoną mieszaninę rSSp do konwencjonalnej kuchenki mikrofalowej.
   UWAGA: Jednostki mikrofalowe w zakresie mocy od 700 do 1,500 watów, o mniejszej pojemności komory wewnętrznej i platformach obrotowych są zalecane w celu zapewnienia lepszych warunków solwatacji.
2. Rozpocznij pracę kuchenki mikrofalowej od 5 s impulsów z pełną mocą. Po każdym pęknięciu należy na krótko otworzyć drzwiczki i ostrożnie wymieszać/zawirować fiolkę, aby zapobiec osiadaniu i utrzymać zawieszoną mieszaninę.
3. Powtarzać ten proces mikrofalowy do momentu, gdy mieszanina i/lub roztwór osiągną temperaturę co najmniej 130 °C, mierzoną termometrem na podczerwień bezpośrednio w stosunku do roztworu zawierającego porcje fiolki. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie cząstki stałe zostaną całkowicie rozpuszczone i nie będą już widoczne.
   UWAGA: Zaleca się, aby od czasu do czasu pozostawić fiolkę i roztwór do ostygnięcia, zwłaszcza jeśli preparat zawiera wysokie stężenie rSSp. Temperatury przekraczające 200 °C zwiększają ryzyko uszkodzenia uszczelki fiolki. Należy również zwrócić szczególną uwagę, aby przegrzana mieszanina/roztwór nie dotknęła uszczelki, co również spowoduje uszkodzenie hermetyzacji fiolki.
4. Po pomyślnym solwatowaniu mieszaniny rSSp do roztworu, przed otwarciem należy odczekać, aby temperatura roztworu i nasadki fiolki ostygła poniżej 100 °C (temperatura wrzenia).

3. Hydrożele

1. Przygotuj hydrożel z roztworu po wyjęciu go z kuchenki mikrofalowej i pozostawieniu do ostygnięcia i stężenia. Odlej hydrożel do określonej geometrii przed pozostawieniem go do całkowitego ostygnięcia.
   UWAGA: Różne rSSps będą wymagały różnej ilości czasu, aby przejść na hydrożel. Na przykład sekwencje podobne do MaSp2 mają tendencję do szybszego tworzenia hydrożeli w porównaniu z sekwencjami podobnymi do MaSp1. Stężenie białka, zasolenie i pH również bezpośrednio wpływają na szybkość przejścia do hydrożelu.

4. Gąbki

1. Przygotuj gąbki rSSp, najpierw pozwalając, aby pierwszorzędowy solwatowany roztwór utworzył hydrożel.
2. Umieść hydrożel w łaźni wodnej, umieść tę kąpiel w zamrażarce w temperaturze -20 °C i poczekaj, aż kąpiel całkowicie zamarznie.
3. Zakończyć proces formowania gąbki, wyjmując zamrożony hydrożel i łaźnię wodną z zamrażarki i rozmrażając w temperaturze 25 °C. Powstałą w ten sposób gąbkę można teraz wyjąć z rozmrożonej wody.

5. Lyogel

1. Przygotować lyożel rSSp, bezpośrednio zamrażając utworzony hydrożel, z kąpielą wodną lub bez, i przenosząc zamrożoną próbkę hydrożelu do liofilizatora (liofilizatora).
2. Usuń ostatni liofilizowany materiał żelowy z naczynia, w którym nastąpiła sublimacja wilgoci.

6. Folie i powłoki

1. Użyj jednej z trzech następujących metod: odlewanie roztworem, natryskiwanie roztworem lub powlekanie zanurzeniowe w celu wytworzenia powłok lub powłok rSSp.
   1. Odlewać rozpuszczony roztwór jedwabiu do/na formy PDMS o pożądanym kształcie.
   2. Wlać i rozprowadzić 200 μl roztworu folii i pozostawić do wyschnięcia przed oderwaniem ich od podłoża PDMS w celu przeprowadzenia testów lub obróbki.
   3. Po pozostawieniu ich do wyschnięcia, usuń uformowane folie do testów mechanicznych lub poddaj je obróbce końcowej, aby poprawić właściwości mechaniczne.
2. Aby przygotować powłokę lub folię, której nie można usunąć z podłoża, należy użyć powłoki natryskowej lub zanurzeniowej, aby uzyskać cienką warstwę warstwy.
   UWAGA: Aby natryskować powłokę, ten protokół okazał się skuteczny w przypadku głównego modelu aerografu do malowania natryskowego.
   1. Uformuj powłokę zanurzeniową, po prostu zanurzając wybrane podłoże w rozpuszczonym rSSp i powtórz po wyschnięciu, aby uzyskać pożądaną grubość.
   2. Wykonaj wstępną warstwę natryskową przed nałożeniem warstwy zanurzeniowej, aby zwiększyć konsystencję i skuteczność końcowej powłoki.

7. Kleje

UWAGA: Tworzenie klejów odbywa się za pomocą jednej z następujących metod.

1. Bezpośrednio dodać rozpuszczony rSSp na podłoże, a następnie nałożyć drugi substrat na wierzch roztworu. Mocno zacisnąć kawałki razem, a następnie suszyć próbki w piecu o minimalnej temperaturze 25 °C przez co najmniej 16 godzin.
2. Alternatywnie należy spryskać dwie powierzchnie podłoża powłoką natryskową, a następnie zacisnąć podłoża razem.
3. Nakładanie rSSp metodą zanurzeniową polegającą na powlekaniu podłoży i przyklejaniu podłoży może być również stosowane do przygotowania i klejenia.

8. Włókna przędzone na mokro

1. Załadować rozpuszczony roztwór domieszkowy do koncentrycznej strzykawki z końcówką Luer-Lok przez igłę ślizgową 19 G. Wyrzuć pęcherzyki powietrza i pozwól dozórce osiąść na końcu strzykawki Luer-Lok.
2. Włóż co najmniej 25 mm rurki PEEK o średnicy wewnętrznej 0.01 cala do jednoczęściowych, szczelnych złączek palcowych rurki PEEK dla średnicy zewnętrznej 1/16 cala i stożka 10/32. Podłącz tę złączkę do rurki PEEK do żeńskiego adaptera Luer-Lok.
   1. Wymienić igłę o rozmiarze 19 na ten zestaw na załadowanej strzykawce.
3. Napełnij wysoką, przezroczystą szklaną wannę 99% czystym izopropanolem, aby użyć jej do kąpieli krzepnięcia.
   1. Napełnij wanny rozciągliwe, znajdujące się poniżej rozciągliwych wanny. Będą one zawierały izopropanol w proporcji 80:20: woda destylowana w pierwszej kąpieli rozciągającej i izopropanol w proporcji 20:80: woda destylowana w drugiej kąpieli rozciągającej.
4. Ustaw system rozciągania godeta w taki sposób, aby pierwszy godet po kąpieli krzeprzepiącej i pierwszy godet w pierwszej kąpieli rozciągającej obracały się z tą samą prędkością.
   1. Rozpocznij pierwsze rozciąganie, dostosowując do tej samej prędkości prędkość ostatniego gonetu w kąpieli rozciągającej 1, środkowego górnego godetu i pierwszego godeta w kąpieli rozciągającej 2. Prędkość ta będzie 2 razy większa niż początkowa prędkość usuwania włókien.
   2. Rozpocznij drugi odcinek, dostosowując prędkości końcowego gonetu w kąpieli rozciągającej 2, ostatniego górnego godetu i nawijarki do tej samej prędkości. Prędkość ta będzie 2 razy większa niż prędkość użyta do pierwszego odcinka lub 4 razy większa niż początkowa prędkość usuwania włókien.
   3. Umieść rękawice nitrylowe na zewnątrz pośrednich godetów, aby zapobiec ślizganiu się włókna.
5. Zacznij powoli wytłaczać roztwór do kąpieli krzepiącej. W zautomatyzowanym systemie ustaw szybkość wytłaczania tak, aby odpowiadała prędkości usuwania 10 mm/s.
   1. Poczekaj, aż wytłaczanie włókien stanie się jednolite przed wyciągnięciem włókien z kąpieli za pomocą cienkiego metalowego haczyka lub kleszczy. Sprawdź, czy usunięcie włókna z kąpieli utworzyło pętlę między końcówką rurki PEEK a ścieżką włókna opuszczającego wannę.
6. Przeprowadź odzyskane włókno przez szereg godetów tak, aby włókno było zanurzone w kąpielach rozciągliwych, ale schło w powietrzu między kąpielami rozciągającymi i przed umieszczeniem na szpuli. Suszenie to osiąga się dzięki wyżej umieszczonym godetom pośrednim.
   UWAGA: Szybkość usuwania włókien i/lub szybkość wytłaczania będzie musiała zostać dostosowana w oparciu o stężenie białka, dodatki i rodzaj białka, aby zapewnić wystarczający czas krzepnięcia bez gromadzenia się włókien na dnie kąpieli krzepiącej.
7. Przymocuj całkowicie rozciągnięte włókno do szpuli na mechanizmie nawijarki za pomocą taśmy.

Wyniki

Z opisanej metody rozpuszczania rSSp, można uzyskać różnorodne formy materialne, jak widać na Rysunek 1. Metoda solubilizacji polega na zastosowaniu ciepła i ciśnienia, generowanych przez konwencjonalną kuchenkę mikrofalową, do zawiesiny rSSp i wody. Po osiągnięciu krytycznych temperatur i ciśnień białko ulega soludyzacji. Z tego rozpuszczonego roztworu rSSp przedstawiono wymagane warunki dla siedmiu form materiałów: hydrożeli, lyogeli, gąbki, klejów, powłok,...

Dyskusja

Po oczyszczeniu rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego należy je następnie przygotować w roztworze, który można wykorzystać do tworzenia materiału. Mieszając liofilizowane białko jedwabiu pajęczego z wodą i wystawiając tę mieszaninę na promieniowanie mikrofalowe w celu wytworzenia ciepła i ciśnienia, można przygotować roztwór rSSp. Dzięki tej prostej i wydajnej metodzie solubilizacji rSSp można uzyskać szeroką gamę form materiałowych. Każdy materiał musi być unikalnie przygotowany i przetworzony, aby osiągnąć pożądany...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 3 ml z końcówką Luer-Lok Tip	BD	309657	Można używać strzykawek o innych rozmiarach, ale aby utrzymać końcówki, zaleca się użycie końcówek Luer-Lok
Fiolka hodowlana 4 mL, przezroczysta z gumową nasadką	Wheaton	225142	Minimalna objętość dozowania to 1 ml, maksymalna to 2 ml
Fiolka hodowlana 8 ml, przezroczysta z gumową nasadką	Wheaton	225144	Minimalna objętość dozownika to 2 ml, max to 4 ml
99% alkoholu izopropylowego, odczynnik ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Liofilizator
Luer Adapter żeński Luer x 10-32 żeński, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Kuchenka mikrofalowa	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 W; Pojemność 1,1 stopy sześciennej; ze szklanym stołem
obrotowymJednoczęściowy stożek 10-32 Fingertight, do rurki 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK 1/16" OD x 0,010" ID	IDEX	1531B
Opryskiwacz: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60