Method Article

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

DOI:

10.3791/59321

⸱

May 1st, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół umożliwia szybką i efektywną konwersję indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej, poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych z indukowalnych wektorów piggyBac.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania funkcjonalnych neuronów ruchowych rdzenia kręgowego i czaszki z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Bezpośrednia konwersja do neuronu ruchowego uzyskuje się poprzez ektopową ekspresję alternatywnych modułów czynników transkrypcyjnych, a mianowicie Ngn2, Isl1 i Lhx3 (NIL) lub Ngn2, Isl1 i Phox2a (NIP). NIL i NIP określają, odpowiednio, tożsamość neuronów ruchowych rdzenia i czaszki. Nasz protokół rozpoczyna się od wygenerowania zmodyfikowanych linii iPSC, w których NIL lub NIP są stabilnie zintegrowane z genomem za pomocą wektora transpozonowego piggyBac. Ekspresja transgenów jest następnie indukowana przez doksycyklinę i prowadzi w ciągu 5 dni do przekształcenia iPSC w komórki progenitorowe MN. Późniejsze dojrzewanie, przez 7 dni, prowadzi do jednorodnych populacji rdzeniowych lub czaszkowych MN. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi protokołami: jest niezwykle szybka i uproszczona; nie wymaga infekcji wirusowej ani dalszej izolacji MN; pozwala na generowanie różnych subpopulacji MN (rdzeniowych i czaszkowych) o niezwykłym stopniu dojrzałości, o czym świadczy zdolność do wystrzeliwania ciągów potencjałów czynnościowych. Co więcej, dużą liczbę neuronów ruchowych można uzyskać bez oczyszczania z populacji mieszanych. Neurony ruchowe rdzenia i czaszki pochodzące z iPSC mogą być wykorzystywane do modelowania in vitro stwardnienia zanikowego bocznego i innych chorób neurodegeneracyjnych neuronu ruchowego. Jednorodne populacje neuronów ruchowych mogą stanowić ważny zasób dla badań przesiewowych leków specyficznych dla typu komórki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwyrodnienie neuronu ruchowego (MN) odgrywa przyczynową rolę w chorobach ludzkich, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i rdzeniowy zanik mięśni (SMA). Stworzenie odpowiednich systemów modeli komórkowych in vitro, które podsumowują złożoność ludzkiego MN, jest ważnym krokiem w kierunku opracowania nowych podejść terapeutycznych. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), które są obdarzone niezwykłymi właściwościami różnicowania pluriline, zostały obecnie uzyskane od wielu pacjentów dotkniętych chorobami neuronu ruchowego1,2. Dodatkowe linie iPSC niosące patogenne mutacje związane z chorobami MN zostały wygenerowane przez edycję genów, zaczynając od kontrolnych "zdrowych" pluripotencjalnych komórek macierzystych3. Linie te stanowią użyteczne narzędzia do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie metody różnicowania iPSC w MN. Przesłanką do opracowania tej metody jest zapewnienie środowisku naukowemu zainteresowanemu chorobami MN szybkiego i skutecznego protokołu różnicowania, który prowadzi do powstania dojrzałych funkcjonalnych MN. Pierwszą zaletą tej metody jest czas jej wykonania. Kolejnym istotnym punktem mocnym jest wyeliminowanie jakiegokolwiek etapu oczyszczania. Wreszcie, protokół może być wykorzystany do wygenerowania dwóch odrębnych populacji neuronów ruchowych.

Możliwość generowania różnych podtypów MN jest szczególnie istotna dla modelowania chorób MN. Nie wszystkie podtypy MN są jednakowo podatne na ALS i SMA, a wystąpienie objawów w różnych jednostkach motorycznych ma duży wpływ na rokowanie. W ALS początek kręgosłupa z objawami rozpoczynającymi się w kończynach górnych i dolnych prowadzi do śmierci po około 3-5 latach4. I odwrotnie, początek opuszkowy, rozpoczynający się zwyrodnieniem MN czaszki, ma najgorsze rokowanie. Co więcej, odsetek wystąpienia objawów opuszkowych jest znacznie wyższy u pacjentów z mutacjami w białkach wiążących RNA FUS i TDP-43 niż u osób z mutacjami SOD15. Prawie wszystkie alternatywne protokoły różnicowania MN opierają się na aktywności kwasu retinowego (RA), który nadaje kręgosłupowy charakter różnicującym się iPSCs6,7,8. Ogranicza to możliwość badania czynników wewnętrznych, które mogą działać ochronnie w określonych podtypach MN9,10.

Zgodnie z poprzednią pracą nad embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy11, ostatnio wykazaliśmy, że w ludzkich iPSC ektopowa ekspresja Ngn2, Isl1 i Lhx3 (NIL) indukuje rdzeniową tożsamość MN, podczas gdy Ngn2 i Isl1 plus Phox2a (NIP) określają czaszkowe MNs12. W związku z tym opracowaliśmy skuteczny protokół, który doprowadził do wytworzenia ludzkich MN obdarzonych właściwościami funkcjonalnymi w ciągu 12 dni. Celem tej metody jest uzyskanie, w krótkim czasie i bez konieczności oczyszczania (np. przez FACS), populacji komórek wysoce wzbogaconych dla MN z tożsamością rdzeniową lub czaszkową.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie ludzkich iPSC

  1. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą
    1. Rozmrozić jedną fiolkę o pojemności 5 ml z matrycą (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc. Oryginalne zapasy matrycowe występują w różnych stężeniach, a podwielokrotności są sporządzane zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia wskazanym w arkuszu danych, właściwym dla danej partii. Ważne jest, aby fiolka i probówki były lodowate, aby zapobiec przedwczesnemu zżelowaniu matrycy. Dozować matrycę do podwielokrotności we wstępnie schłodzonych krioprobówkach na lodzie. Niewykorzystane podwielokrotności zamrozić w temperaturze -20 °C.
    2. Umieść jedną porcję na lodzie na około 2 godziny do rozmrożenia.
    3. Rozcieńczyć podwielokrotność matrycy 20 ml zimnego DMEM/F12 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    4. Dobrze wymieszać i rozlać 1 ml rozcieńczonej matrycy do szalek o średnicy 35 mm (równoważne ilości na powierzchnię innych szalek).
    5. Naczynia zawierające rozcieńczoną matrycę należy przechowywać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić powlekanie.
      nuta: Naczynia uszczelnione parafilmem można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego (20 ml) i 1x porcji roboczych delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów).
    1. Rozpuścić proszek do 10 mg/ml w PBS (wolny od Ca2+/Mg2+).
    2. Filtr sterylizuje przez membranę filtracyjną 0,22 μm.
    3. Przygotować 20 porcji (po 1 ml każdy) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Przed użyciem rozcieńczyć jedną podwielokrotność w PBS (wolne od Ca2+/Mg2+) do 1 mg/ml (1x podwielokrotności robocze).
      UWAGA: 1x porcje robocze mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  3. Przenikanie ludzkich komórek iPS.
    1. Przed rozpoczęciem: W przypadku przechowywania w temperaturze 4 °C należy wstępnie ogrzać płytki pokryte matrycą w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20-30 min. Wstępnie podgrzej w temperaturze pokojowej ilość potrzebnej pożywki iPSC dla ludzi (patrz Tabela materiałów). Wstępnie rozgrzej DMEM/F12.
    2. Aspirować pożywkę hodowlaną.
    3. Przepłukać iPSC PBS (wolne od Ca2+/Mg2+).
    4. Dodaj 1x delikatny roztwór dysocjacyjny (0,5 ml na naczynie 35 mm). Inkubować w temperaturze 37 °C, aż krawędzie kolonii zaczną odrywać się od płytki, zwykle 3-5 minut.
    5. Zassać delikatny roztwór dysocjacyjny, uważając, aby nie oderwać kolonii iPSC.
    6. Umyj komórki DMEM/F12 (2 ml na naczynie 35 mm) i odessać, uważając, aby nie oderwać komórek. Powtórz ten krok jeszcze raz.
    7. Dodać ludzką pożywkę iPSC (1 ml na szalkę o średnicy 35 mm).
    8. Delikatnie odłącz kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.
    9. Delikatnie rozbić grudki komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.
    10. Odessać supernatant z płytki(-ek) pokrytej matrycą(-ych).
    11. Wysiewać komórki w odpowiedniej objętości hodowli ludzkiej pożywki iPSC. Współczynnik podziału może się różnić w zależności od wiersza i wynosi około 1:4-1:8. Zmieniaj medium codziennie.

2. Generowanie indukowanych przez NIL i NIP linii iPSC

  1. Transfekcja komórek.
    1. Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca2+ / Mg2+).
    2. Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż pojedyncze komórki zostaną oddzielone (5-10 min).
    3. Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.
    4. Zebrać w probówce o pojemności 15 ml i dodać PBS (wolny od Ca2+ / Mg2 +) do 10 ml. Policz komórki.
    5. Osad 106 ogniw i ponownie zawiesić w 100 μl buforu R (dołączonego do zestawu do elektroporacji ogniw, patrz tabela materiałów).
    6. Dodaj plazmidowe DNA do transfekcji: 4,5 μg wektora transpozycyjnego (epB-Bsd-TT-NIL lub epB-Bsd-TT-NIP12) i 0,5 μg plazmidu transpozazy piggyBac13.
    7. Transfekcja z systemem elektroporacji ogniw (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i zgodnie z wcześniejszym opisem3 o następujących parametrach: napięcie 1 200 V, szerokość 30 ms, 1 impuls. Wysiewać komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK, patrz tabela materiałów) w naczyniu pokrytym matrycą o średnicy 6 mm.
  2. Selekcja antybiotykami.
    1. Dwa dni po transfekcji dodać 5 μg/ml blasticydyny do pożywki hodowlanej.
    2. Większość komórek nietransfekowanych umrze w ciągu 48 godzin od selekcji blasticydyny. Utrzymuj komórki w blasticydynie przez co najmniej 7-10 dni, aby dokonać kontrselekcji komórek, które nie zintegrowały transgenów z genomem.
    3. Utrzymuj stabilnie transfekowane komórki jako populację mieszaną, składającą się z komórek o różnej liczbie transgenów i różnych miejscach integracji, lub izoluj pojedyncze klony.
    4. Przygotować dodatkowe naczynie w celu sprawdzenia skutecznej ekspresji transgenów, po indukcji doksycykliny 1 μg/ml metodą RT-PCR ze starterami specyficznymi dla transgenu dla Ngn2 (Dalej: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Odwrotny: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), zgodnie z wcześniejszym opisem12.
    5. Na tym etapie należy zamrozić zapasy nowych linii NIL i NIP-iPSC w pożywce do zamrażania dla ludzkich iPSC (patrz tabela materiałów).

3. Różnicowanie neuronów ruchowych

  1. Oddzielić komórki za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek, jak opisano (kroki 2.1.1.-2.1.3.). Zebrać zdysocjowane komórki w probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć 5 objętościami DMEM/F12. Osadzać komórki i ponownie zawiesić w ludzkim pożywce iPSC uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Policz komórki i nasiona na szalkach pokrytych matrycą o gęstości 62 500 komórek/cm2.
  2. Następnego dnia zastąp pożywkę DMEM/F12, uzupełnioną 1x stabilnym analogiem L-glutaminy, 1x suplementem hodowli komórkowej aminokwasów endogennych (NEAA) i 0,5x penicyliną/streptomycyną i zawierającą 1 μg/ml doksycykliny. Jest to traktowane jako dzień 0 różnicowania. W dniu 1 odśwież pożywkę i doksycyklinę.
  3. W dniu 2 zmień pożywkę na pożywkę Neurobasal/B27 (pożywka neuropodstawowa uzupełniona 1x B27, 1x stabilny analog L-glutaminy, 1x NEAA i 0,5x penicylina/streptomycyna), zawierającą 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 i 1 μg/ml doksycykliny (patrz tabela materiałów). Odświeżaj pożywkę i doksycyklinę codziennie aż do 5 dnia.
  4. Dzień 5: Dysocjacja komórek za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela materiałów).
    1. Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca2+ / Mg2+).
    2. Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż cała monowarstwa komórek oddzieli się od naczynia. Należy pamiętać, że pojedyncze komórki nie zostaną oddzielone podczas inkubacji.
    3. Dodać 1 ml DMEM/F12 i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 10-15 razy.
    5. Dodaj 4 ml DMEM/F12 i policz komórki.
    6. Na tym etapie należy zamrozić komórki progenitorowe neuronów ruchowych w pożywce do zamrażania komórek (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Osadzać komórki i ponownie zawiesić w pożywce neuronalnej (pożywka Neurobaseal/B27 uzupełniona 20 ng/ml BDNF, 10 ng/mL GDNF i 200 ng/ml kwasu L-askorbinowego, patrz tabela materiałów) uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK.
    8. Wysiewaj komórki na poliornitynie/lamininie lub alternatywnie na podłożach pokrytych matrycą o gęstości 100 000 komórek/cm2. Do analizy barwienia immunologicznego należy użyć plastikowych podpór μ-Slide z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym (patrz Tabela materiałów).
  5. W 6 dniu zmień pożywkę na świeżą pożywkę neuronalną pozbawioną inhibitora ROCK. W kolejnych dniach odświeżać połowę podłoża co 3 dni. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać bardzo ostrożnie, aby zapobiec oderwaniu się od powierzchni.

4. Analiza immunologiczna

  1. Utrwalenie komórek. Przepłukać komórki PBS (z Ca2+/Mg2+) i inkubować przez 15 minut w 4% paraformaldehydzie w PBS (z Ca2+/Mg2+) w temperaturze pokojowej.
    ostrożność: Paraformaldehyd jest toksyczny i podejrzewa się, że powoduje raka. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz obchodzić się z nimi pod wyciągiem chemicznym.
  2. Przepuszczać PBS (z Ca2+/Mg2+) zawierającym 0,1% Triton X-100 przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym przeciwciała (ABS: 3% BSA w PBS z Ca2+/Mg2+).
  4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z pierwszorzędowymi przeciwciałami w ABS: anty-TUJ1 (1:1000; królik) i anty-Oct4 (1:200; mysz) lub anty-CHAT (anty-cholina acetylotransferaza; 1:150; koza). Zobacz tabelę materiałów.
  5. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej z odpowiednią parą przeciwciał drugorzędowych osła w ABS: anty-mysim Alexa Fluor 647 (1:250), anty-króliczym Alexa Fluor 594 (1:250) i anty-kozim Alexa Fluor 488 (1:250). Zobacz tabelę materiałów.
  6. Inkubować w 0,4 μg/ml DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu znakowania jąder.
  7. Zamontuj ogniwa za pomocą pożywki montażowej (patrz tabela materiałów) do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Charakterystyka funkcjonalna za pomocą nagrań z zaciskiem krosowym

  1. Przygotować roztwór zewnętrzny równoważony HEPES (NES) w następujący sposób: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES i 10 mM glukozy. Ustaw osmolarność w zakresie 290-300 mΩ. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1N NaOH i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować roztwór wewnętrzny: 140 mM K-glukonian, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą 1M KOH i sprawdź, czy osmolarność jest ustawiona na około 290 mΩ. Zamrozić roztwór w temperaturze -20 °C w małych porcjach.
  3. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy wstępnie podgrzać roztwór NES w łaźni wodnej do temperatury około 28-30 °C.
  4. Wyciągnąć kilka mikropipet borokrzemianowych (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) z końcówką o rezystancji 5-6 MΩ i napełnić roztworem wewnątrzkomórkowym przed zamontowaniem w uchwycie na pipety.
    nuta: Należy pamiętać o chlorowaniu srebrnych drutów elektrody rejestrującej i elektrody odniesienia w wybielaczu przez co najmniej 30 minut, aby na powierzchni drutu powstała jednolita warstwa AgCl.
  5. Przenieść szalkę Petriego do komory rejestracyjnej i pozostawić komorę z roztworem NES na poziomie 1-2 ml/min. Pozwól, aby przepływ przepływał przez grzałkę liniową ustawioną na temperaturę 30 °C, aby utrzymać ciepło roztworu.
  6. Umieścić elektrofizjologiczną komorę zapisową pod mikroskopem pionowym. Rejestruj prądy membranowe za pomocą wzmacniacza krosowego i pozyskuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  7. Otwórz amplifier oprogramowanie sterujące i ustaw wzmocnienie sygnału na wartość 1, a filtr Bessela na 10 kHz. Upewnij się, że filtr Bessela jest 2.5 razy niższy niż częstotliwość próbkowania.
  8. Ustaw protokoły eksperymentalne dla eksperymentów z cęgami napięciowymi i prądowymi w oprogramowaniu do nagrywania.
  9. W ustawieniach protokołu zaznacz tryb stymulacji epizodycznej i ustaw częstotliwość próbkowania na 25 kHz. Następnie przejdź do zakładki przebiegu i wpisz amplitudę i długość kroku napięcia lub prądu w następujący sposób.
  10. W przypadku prądów sodowych bramkowanych napięciem należy zastosować 15 stopni napięcia (każdy czas trwania 50 ms) od -100 mV do +40 mV (przyrost 10 mV). Uruchom protokół po nałożeniu na załatane ogniwo potencjału podtrzymania -60 mV przez wzmacniacz. Podobnie, prądy potasowe bramkowane napięciem są wywoływane przez kroki napięcia (każdy czas trwania 250 ms) od -30 mV do +50 mV (przyrost 10 mV) utrzymujące zarejestrowane ogniwo do -40 mV.
  11. Do zbadania właściwości wypalania MN czaszkowych i rdzeniowych pochodzących z iPSC, należy zacisnąć komórki w trybie cęgowania prądowego przy potencjale błonowym -70 mV i użyć 4 impulsów prądowych (każdy o czasie trwania 1 s) o rosnącej amplitudzie (od +20 pA do +80 pA; przyrost 20 pA).
  12. Uzyskaj dla każdego ogniwa prądy aktywowane napięciem, wywołaną aktywność wypalania i trzy właściwości pasywne, takie jak pojemność całego ogniwa (Cm), rezystancja błony komórkowej (Rm) i spoczynkowy potencjał błonowy (RMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny opis metody różnicowania jest pokazany w Rysunek 1. Ludzkie iPSC (WT I line3) transfekowano epB-Bsd-TT-NIL lub epB-Bsd-TT-NIP, generując, po selekcji blastycydyny, stabilne i indukowalne linie komórkowe12, zwane dalej odpowiednio iPSC-NIL i iPSC-NIP. Komórki różnicujące się scharakteryzowano pod kątem ekspresji markera pluripotencji OCT4 i markera panneuronalnego TUJ1. Analiza barwienia immunologicznego wykazała jednolitą ekspresję...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten pozwala na skuteczne przekształcanie ludzkich iPSC w rdzeniowe i czaszkowe neurony ruchowe dzięki ektopowej ekspresji czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii. Te transgeny są indukowane przez doksycyklinę i stabilnie zintegrowane z genomem dzięki wektorowi opartemu na transpozonach piggyBac. W populacji mieszanej jedna lub kilka kopii wektora piggyBac zostanie losowo zintegrowanych z genomem poszczególnych komórek, co zwiększa ryzyko zmian integralności genomu. Co więcej, z czasem może dojść do po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Zakładowi Obrazowania w Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, za wsparcie i porady techniczne. Jesteśmy wdzięczni członkom Center for Life Nano Science za pomocną dyskusję. Prace te zostały częściowo wsparte grantem z AriSLA (grant pilotażowy 2016 "StressFUS") dla AR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1Gchemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML Odczynnik do dysocjacji komórek
anty-CHATEMD Millipore AB144PAcetylotransferaza antycholinowa. Przeciwciało pierwotne stosowane w testach barwienia immunologicznego. RRID: AB_2079751; Numer serii: 2971003
antykozioł Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Naukowy A11055Przeciwciało drugorzędowe stosowane do testów immonofluorescencyjnych. RRID: AB_2534102; Numer serii: 1915848
anty-mysz Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571Przeciwciało drugorzędowe stosowane do testów immonofluorescencyjnych. RRID: AB_162542; Numer serii: 1757130
anty-Oct4 BD Biosciences611202Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w testach barwienia immunologicznego. RRID: AB_398736; Numer serii: 5233722
anty-Phox2bSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-376997Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w testach barwienia immunologicznego. Numer serii: E0117
anty-królik Alexa Fluor 594 Nauki immunologiczneIS-20152-1Przeciwciało drugorzędowe stosowane do testów immonofluorescencyjnych
anty-TUJ1 Sigma-Aldrich T2200Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w testach barwienia immunologicznego. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566Suplement bez surowicy do utrzymania komórek nerwowych
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Pożywka do zamrażania komórek, stosowana tutaj do progenitorów neuronów ruchowych
BDNFPreproTech450-02Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego
BlasticidinSigma-Aldrich203350Antybiotyk nukleozydowy hamujący syntezę białek u prokariontów i eukariontów
BSASigma-AldrichA2153Albumina surowicy bydlęcej. Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach barwienia immunologicznego
Chemikalia CaCl2Sigma-AldrichC3881do roztworów elektrofizjologicznych
Oprogramowanie Clampex 10Urządzenia molekularneClampex 10System rejestracji prądów membranowych
Corning Matrigel z kwalifikacją hESC MatrixCorning354277Odtworzony preparat błony podstawnej z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Służy do przyczepności iPSC do podłoży plastikowych i szklanych
CRYOSTEM ACF MROŻENIEPrzemysł biologiczny05-710-1EPodłoże do zamrażania dla ludzkich iPSC
D-GlucoseSigma-AldrichG5146chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Proszek DAPIRoche102362760014&,6-diamidino-2-fenyloindol. Barwnik fluorescencyjny, który wiąże się z adeniną– Regiony bogate w tyminę w DNA używane do barwienia jąder w testach immonofluorescencyjnych
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005Inhibitor sekretazy gamma
DypazaGibco17105-041Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLPodłoże bazowe do hodowli komórkowych
DoksycyklinaSigma-AldrichD9891-1G& nbsp;Służy do indukowania ekspresji transgenów z wektorów epB-Bsd-TT-NIL i epB-Bsd-TT-NIP
DS2U WiCellUWWC1-DS2UKomercyjna ludzka linia iPSC
E.Z.N.A Total RNA Kit Omega bio-tekR6834-02Zestaw do całkowitej ekstrakcji RNA z hodowanych komórek eukariotycznych
GDNFPreproTech450-10Glejowy czynnik neurotroficzny
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945Komercyjna linia iPSC dla ludzi
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038Alternatywa dla L-glutaminy o zwiększonej stabilności. Poprawia zdrowie komórek.
HepesSigma-AldrichH4034chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
iScript Odwrotna transkrypcja Supermix dla RT-qPCR Bio-Rad1708841Kit do analizy ekspresji genów za pomocą qPCR
iTaqTM w czasie rzeczywistym Uniwersalny SYBR Green Supermix Bio-Rad172-5121 Gotowa do użycia główna mieszanka reakcji zoptymalizowana pod kątem ilościowego PCR na bazie barwnika (qPCR) na dowolnym urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym
K-GluconateSigma-AldrichG4500chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
KClSigma-AldrichP9333chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Kwas L-askorbinowyLKT LaboratoriesA7210Stosowany w hodowlach komórkowych jako przeciwutleniacz
LamininSigma-Aldrich11243217001Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Olimpia  iX83 FluoView1200Mikroskop konfokalny do akwizycji obrazów barwienia immunologicznego
Mg-ATPSigma-AldrichA9187chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
MgCl2Sigma-AldrichM8266chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Medium montażowe Ibidi50001Rozwiązanie montażowe stosowane do mikroskopii konfokalnej i testów immunofluorescencyjnych
Wzmacniacz z wieloma zaciskami krosowymiUrządzenia molekularne700BSystem rejestracji prądów membranowych
Na-GTPSigma-AldrichG8877chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
NaClSigma-Aldrich71376chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
NEAAThermo Fisher Scientific11140035aminokwasy endogenne. Stosowany jako suplement do pożywki do hodowli komórkowych w celu zwiększenia wzrostu i żywotności komórek.
Neon 100 μ L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Zestaw do elektroporacji komórek
System transfekcji neonowejThermo Fisher ScientificMPK5000System elektroporacji komórek
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Podłoże bazowe przeznaczone do długotrwałego utrzymania i dojrzewania populacji komórek nerwowych bez konieczności stosowania warstwy zasilającej astrocyty
NutriStem-XF/FF Przemysł biologiczny05-100-1APożywka hodowlana ludzkiego iPSC
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki157-8Służy do utrwalania komórek w testach barwienia immunologicznego
PBSSigma-AldrichD8662-500MLBufor fosforanowy Dulbecco, sól fizjologiczna, z wapniem, z magnezem
PBS Ca2+/Mg2+ wolnySigma-AldrichD8537-500MLBufor fosforanowy Dulbecco, bez wapnia, bez penicyliny magnezowej
/streptomycyny Sigma-AldrichP4333-100MLRoztwór penicyliny/streptomycyny stosowany w celu zapobiegania zanieczyszczeniu kultur komórkowych bakteriami.
poliornitynaSigma-AldrichP4957Wspomaga przyłączanie i wzrost komórek nerwowych in vitro
SU5402Sigma-AldrichSML0443-5MGSelektywny inhibitor receptora 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR-2)
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787Glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy,  t-oktylofenoksypolietylen, glikol polietylenowy  eter tert-oktylofenylowy. Służy do przenikania komórek w testach barwienia immunologicznego
Mikroskop pionowyOlympusBX51VIMikroskop do zapisu elektrofizjologicznego wyposażony w kamerę CoolSnap Myo 
Y-27632  (inhibitor ROCK)Enzo Nauki PrzyrodniczeALX-270-333-M005 Przepuszczalny przez komórkę selektywny inhibitor kinazy białkowej zawierającej zwiniętą cewkę (ROCK) związaną z Rho. Zwiększa przeżywalność iPSC
μ-Slide 8 Well Ibidi80826Wsparcie dla wysokich– Końcowa analiza mikroskopowa komórek stałych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

Related Articles