Artykuł metodologiczny

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

DOI:

10.3791/59325

⸱

20 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowe zmiany w fenotypie i morfologii śródbłonka są uważane za początkowe zdarzenia w patogenezie miażdżycy. Bezpośrednia obserwacja nienaruszonego śródbłonka dostarczy cennych informacji potrzebnych do zrozumienia zdarzeń komórkowych i molekularnych w dysfunkcyjnych komórkach śródbłonka. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowaną technikę barwienia immunofluorescencyjnego en face, która umożliwia naukowcom uzyskanie wyraźnych obrazów nienaruszonej powierzchni śródbłonka i analizę wzorców ekspresji cząsteczek in situ. Metoda jest prosta i niezawodna do obserwacji całej monowarstwy śródbłonka w różnych miejscach aorty. Technika ta może być obiecującym narzędziem do zrozumienia patofizjologii miażdżycy, zwłaszcza na wczesnym etapie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne zmiany w układzie naczyniowym rozpoczynają się przede wszystkim w śródbłonku, który funkcjonuje jako selektywna bariera między krwią a ścianą naczynia z jego międzykomórkowymi kompleksami ściśle połączeniowymi1. Istotne dowody wskazują na kluczową rolę mechanicznych skutków przepływu krwi w modulowaniu funkcji śródbłonka2. Naprężenie ścinające płynu, siła tarcia generowana przez przepływ krwi, w różny sposób kształtuje morfologię i funkcję komórek śródbłonka, w zależności od konkretnych paradygmatów przepływu w różnych miejscach naczyniowych2,3. Zmiany miażdżycowe występują preferencyjnie w miejscach zaburzonego przepływu krwi (d-flow), takich jak krzywizny naczyń, rozdzielacze przepływu i punkty rozgałęzień, w porównaniu z obszarami stałego przepływu (s-flow), takimi jak prosty odcinek tętnicy. Dlatego bezpośrednia obserwacja morfologii śródbłonka i wzorców ekspresji cząsteczek powinna dostarczyć ważnych informacji na temat strukturalnych i funkcjonalnych fenotypów komórek śródbłonka w różnych paradygmatach przepływu.

Hodowane komórki śródbłonka mogą nie wyrażać rzeczywistego fenotypu, tak jak robią to in vivo, częściowo z powodu utraty wpływu naprężeń ścinających płyn, otaczających cytokin i interakcji komórka-komórka lub komórka-macierz zewnątrzkomórkowa. Aby to wspomóc, nienaruszoną monowarstwę komórek śródbłonka można badać na przekrojach poprzecznych przy użyciu klasycznej immunohistochemii. Jednak monowarstwa śródbłonka jest tak cienka i delikatna, że zwykle nie można jej wyraźnie zaobserwować. Immunohistochemia en face została wykorzystana do obserwacji wewnętrznej powierzchni śródbłonka, ale jej wyniki są albo skomplikowane, albo niekonsekwentne, ponieważ śródbłonek jest łatwo usuwany z leżącej poniżej tkanki lub tylko część ściany tętnicy szczurów lub królików, których ściany są grube, jest montowany4,5.

Modele myszy mają znaczną przewagę nad innymi zwierzętami pod wieloma względami. Tutaj stosujemy zmodyfikowaną technikę immunofluorescencji en face do analizy komórek śródbłonka łuku aorty i aorty piersiowej u myszy C57BL / 6. Taka technika jest szeroko stosowana do badania patofizjologii śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy6,7,8,9,10. Metoda ta pozwala naukowcom na wyraźną obserwację całej powierzchni śródbłonka i porównanie wzorców ekspresji danego białka w regionach narażonych na różne naprężenia ścinające płynu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju.

1. Perfuzja aorty myszy

  1. Krótko mówiąc, znieczulij 12-tygodniowe myszy C57BL/6 za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć pentobarbitalu sodu (50 mg/kg masy ciała). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc ogon.
    UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.
  2. Przyklej łapki myszy do stosu ręczników papierowych za pomocą taśm samoprzylepnych.
  3. Podnieś skórę myszy kleszczami i przetnij skórę nożyczkami od brzucha do górnej części klatki piersiowej.
  4. Otwórz jamę brzuszną poniżej klatki piersiowej ostrymi nożyczkami.
  5. Podnieś mostek za pomocą kleszczy i przetnij przeponę, a następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową.
  6. Odetnij żyłę główną tuż nad wątrobą nożyczkami.
  7. Ciśnienie perfuzji (100 mmHg) drzewa tętniczego przez 5 minut za pomocą wstępnie schłodzonego normalnego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 40 jednostek/ml heparyny przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade. Następnie perfuzjować wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez 3 minuty.
  8. Usuń wszystkie mięśnie, narządy i tłuszcz, aż aorta zostanie odsłonięta.
  9. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.

2. Rozwarstwienie i wzdłużne otwarcie aorty

  1. Odsłoń aortę wyraźnie pod mikroskopem preparacyjnym i usuń tkanki łączne wzdłuż aorty tak czyste, jak to możliwe, za pomocą delikatnych kleszczyków i pary delikatnych nożyczek (Ryc. 1).
  2. Wypreparuj aortę piersiową od serca do pnia trzewnej za pomocą delikatnych nożyczek i umieść aortę w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 6 cm z PBS. Rozetnij aortę wzdłużnie, wzdłuż mniejszej krzywej i wzdłuż większej krzywej, aż do zetknięcia się z prostym segmentem. Rozetnij mikronożyczkami trzy gałęzie łuku aorty, w tym bezimienną, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową, jak pokazano na Rycina 2.

3. Wstępne leczenie i barwienie immunologiczne aorty

  1. Przesiąknij aortę 0,1% eterem polioksyetylenooktylofenylowym w PBS przez 10 minut i zablokuj ją 10% normalną surowicą kozią w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającej 2,5% polisorbatu 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
  2. Następnie inkubować aortę z 5 g/ml króliczej anty-VCAM-1 i 5 g/ml szczurzej anty-VE-kadheryny w buforze blokującym, przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Po 3-krotnym przepłukaniu próbki roztworem myjącym (TBS zawierający 2,5% polisorbatu 20), należy zastosować sprzężone z fluorescencją przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenie 1:1,000, anty-królicze IgG znakowane Alexa Fluor 555 i anty-szczurze IgG znakowane Alexa Fluor 488) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Spłucz 3x w roztworze myjącym.
  4. Przeciwbarwić aortę 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (1 μg/ml) przez 10 minut i płukać ją 3x w roztworze myjącym.

4. Montaż aorty na szkiełku

  1. Umieść aortę na szkiełku nakrywkowym powierzchnią światła skierowaną w dół i powoli przesuwaj ją do roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu, który wcześniej został upuszczony na szkiełko nakrywkowe. Delikatnie rozciągnij aortę, aby próbka była płaska.
  2. Odwróć szkiełko nakrywkowe i połóż je na szkiełku szkiełkowym. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do pozostawienia pęcherzyków powietrza między próbką a szkłem.

5. Obserwacja aorty

  1. Zbadaj aortę za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
  2. Analizuj intensywność kolorów różnych kanałów z żądanego obszaru na obrazach en face za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

12-tygodniowa mysz C57BL/6 została poddana eutanazji i perfuzji normalną solą fizjologiczną zawierającą 40 jednostek/ml heparyny, a następnie wstępnie schłodzona 4% paraformaldehydu. Mysia aorta została wystawiona pod mikroskopem preparacyjnym (Ryc. 1), wypreparowana i rozcięta wzdłużnie (Rycina 2). Barwienie immunofluorescencyjne en face komórek śródbłonka naczyń krwionośnych przeprowadzono zgodnie z ilustracją na rysunku Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródbłonek jest narażony na liczne czynniki proaterogenne, w tym lipidy, mediatory stanu zapalnego i stres ścinający płyny 1,11,12. Bezpośrednia obserwacja komórek śródbłonka in situ zapewnia szczególne korzyści w analizie zmian w morfologii komórek, połączeniach międzykomórkowych i wzorcach ekspresji cząsteczek w odpowiedzi na bodźce urazowe.

Wcześniejsze badania dostarczyły dwóch różnych technik imm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) oraz Science Technology Committee of the Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mocowanie zapobiegające blaknięciuServicebioG1401
Delikatne kleszczeRWD Life ScienceF11001-11
Delikatne nożyczkiRWD Life ScienceS12003-09
Kleszcze preparacyjneRWD Life ScienceF12005-10
Nożyczki sprężynowe MciroRWD Life ScienceS11001-08
Eter polioksyetylenooktylofenylowy (Triton X-100)AmrescoM143
Polisorbat 20 (Tween 20)Przeciwciało Amresco0777
VCAM-1Abcamab134047
Przeciwciało VE-CadherinBD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 oznakowane anty-króliczym IgGinvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 oznaczone anty-szczurzy IgGinvitrogenA-21208
Laserowy mikroskop skaningowy Carl Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozwarstwienie aortymikroskopia konfokalnaekspresja VCAM 1marker VE kadherynynapr enie cinaj ce cieczybarwienie kontrastowe DAPImorfologia r db onkabadania nad mia d yc

Powiązane artykuły