Artykuł metodologiczny

Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

DOI:

10.3791/59331

⸱

24 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia alternatywną strategię do konwencjonalnej metody opartej na toksycznych analogach w identyfikacji nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony, aby osiągnąć jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zaspokoić stale rosnący rynek aminokwasów, potrzebne są wysokowydajne szczepy produkcyjne. Nadproducenci aminokwasów są konwencjonalnie identyfikowani poprzez wykorzystanie konkurencji między aminokwasami a ich analogami. Jednak ta metoda oparta na analogach ma niską dokładność, a właściwe analogi dla określonych aminokwasów są ograniczone. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną strategię, która umożliwia dokładne, czułe i wysokoprzepustowe badania przesiewowe nadprodukcji aminokwasów przy użyciu markerów bogatych w rzadkie kodony. Strategia ta jest inspirowana zjawiskiem tendencyjności użycia kodonów w translacji białek, dla której kodony są klasyfikowane jako powszechne lub rzadkie na podstawie ich częstości występowania w kodującym DNA. Translacja rzadkich kodonów zależy od odpowiadających im rzadkich transferowych RNA (tRNA), które nie mogą być w pełni naładowane przez pokrewne aminokwasy pod wpływem głodu. Teoretycznie rzadkie tRNA mogą być ładowane, jeśli występuje nadmiar aminokwasów po naładowaniu synonimicznych powszechnych izoakceptorów. W związku z tym opóźnione translacje spowodowane rzadkimi kodonami mogą zostać przywrócone przez karmienie lub wewnątrzkomórkową nadprodukcję odpowiednich aminokwasów. Przy takim założeniu ustanawia się system selekcji lub badań przesiewowych w celu identyfikacji nadprodukcji aminokwasów poprzez zastąpienie wspólnych kodonów docelowych aminokwasów ich synonimicznymi rzadkimi alternatywami w genach oporności na antybiotyki lub genach kodujących białka fluorescencyjne lub chromogenne. Wykazaliśmy, że ekspresja białek może być znacznie utrudniona przez włączenie rzadkich kodonów i że poziomy białek korelują dodatnio ze stężeniami aminokwasów. Korzystając z tego systemu, nadproducenci wielu aminokwasów mogą być łatwo odsiewani z bibliotek mutacji. Ta strategia oparta na rzadkich kodonach wymaga tylko jednego zmodyfikowanego genu, a gospodarz ma mniejsze szanse na uniknięcie selekcji niż w przypadku innych metod. Oferuje alternatywne podejście do pozyskiwania nadproducentów aminokwasów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna produkcja aminokwasów opiera się głównie na fermentacji. Jednak miana i plony dla większości szczepów produkujących aminokwasy są poniżej rosnących wymagań globalnego rynku aminokwasów, który jest wart miliardy dolarów1,2. Uzyskanie wysokowydajnych nadproducentów aminokwasów ma kluczowe znaczenie dla ulepszenia przemysłu aminokwasowego.

Tradycyjna strategia identyfikacji nadproducentów aminokwasów wykorzystuje konkurencję między aminokwasami i ich analogami w syntezie białek3,4. Analogi te są w stanie ładować tRNA, które rozpoznają odpowiednie aminokwasy, a tym samym hamować wydłużenia łańcuchów peptydowych, prowadząc do zatrzymania wzrostu lub śmierci komórki5. Jednym ze sposobów na przeciwstawienie się naprężeniom analogowym jest zwiększenie stężenia aminokwasów wewnątrzkomórkowych. Wzbogacone aminokwasy będą konkurować z analogami o skończone tRNA i zapewnią prawidłową syntezę funkcjonalnych białek. W związku z tym szczepy, które przetrwają analogi, mogą być wybrane i prawdopodobnie są nadproducentami odpowiednich aminokwasów.

Chociaż okazała się skuteczna w doborze nadproducentów aminokwasów, takich jak L-leucyna6, strategia oparta na analogach ma poważne wady. Jednym z głównych problemów jest oporność analogowa wynikająca z procesu mutagenezy lub spontanicznych mutacji. Szczepy z opornością mogą uniknąć selekcji poprzez blokowanie, eksportowanie lub degradację analogów5. Innym problemem są toksyczne skutki uboczne analogów dla innych procesów komórkowych7. W konsekwencji szczepy, które przetrwają selekcję analogową, mogą nie być nadproducentami aminokwasów, podczas gdy pożądani nadproducenci mogą zostać fałszywie wytępieni z powodu negatywnych skutków ubocznych.

Tutaj prezentowana jest nowatorska strategia oparta na prawie odchylenia kodonów w celu osiągnięcia dokładnej i szybkiej identyfikacji nadproducentów aminokwasów. Większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden tryplet nukleotydowy, który jest w różny sposób faworyzowany przez organizmy gospodarza8,9. Niektóre kodony są rzadko używane w sekwencjach kodujących i są określane jako rzadkie kodony. Ich translacje na aminokwasy opierają się na pokrewnych tRNA, które przenoszą odpowiednie aminokwasy. Jednak tRNA, które rozpoznają rzadkie kodony, zwykle mają znacznie niższą obfitość niż tRNA popularnych kodonów10,11. W związku z tym te rzadkie tRNA są mniej skłonne do wychwytywania wolnych aminokwasów w konkurencjach z innymi izoakceptorami, a translacje sekwencji bogatych w rzadkie kodony zaczynają zwalniać lub nawet są przerywane, gdy ilości aminokwasów są ograniczone10. Teoretycznie translacje mogłyby zostać przywrócone, gdyby po naładowaniu synonimicznych wspólnych tRNA wystąpiła nadwyżka aminokwasów z powodu nadprodukcji lub dodatkowego podawania odpowiednich aminokwasów12. Jeśli gen bogaty w rzadkie kodony koduje marker selekcyjny lub przesiewowy, szczepy wykazujące odpowiednie fenotypy mogą być łatwo zidentyfikowane i prawdopodobnie są nadproducentami docelowych aminokwasów.

Powyższa strategia jest stosowana do ustanowienia systemu selekcji i selekcji w celu identyfikacji nadproducentów aminokwasów. System selekcji wykorzystuje geny oporności na antybiotyki (np. kanR) jako markery, podczas gdy system przesiewowy wykorzystuje geny kodujące białka fluorescencyjne (np. białko zielonej fluorescencji [GFP]) lub chromogenne (np. PrancerPurple). Geny markerowe w obu układach są modyfikowane poprzez zastąpienie określonej liczby wspólnych kodonów dla docelowego aminokwasu jego synonimiczną rzadką alternatywą. Szczepy w bibliotece mutacji, które zawierają gen markerowy bogaty w rzadkie kodony, są selekcjonowane lub badane w odpowiednich warunkach, a nadproducenci docelowych aminokwasów mogą być łatwo zidentyfikowani. Proces pracy rozpoczyna się od budowy systemu genów markerowych bogatych w rzadkie kodony, następnie następuje optymalizacja warunków pracy, a następnie identyfikacja i weryfikacja nadproducentów aminokwasów. Ta niezależna od analogów strategia opiera się na dogmacie dotyczącym translacji białek i została praktycznie zweryfikowana, aby umożliwić dokładną i szybką identyfikację nadproducentów aminokwasów. Teoretycznie można by go bezpośrednio zastosować do aminokwasów z rzadkimi kodonami i do wszystkich mikroorganizmów. Ogólnie rzecz biorąc, strategia oparta na rzadkich kodonach będzie służyć jako skuteczna alternatywa dla konwencjonalnego podejścia opartego na analogach, gdy odpowiednie analogi dla określonych aminokwasów są niedostępne lub gdy głównym problemem jest wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich. Poniższy protokół wykorzystuje rzadki kodon leucyny, aby zademonstrować tę strategię w identyfikacji nadproducentów L-leucyny Escherichia coli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa plazmidów wyrażających geny markerowe bogate w rzadkie kodony

  1. Należy wybrać gen markerowy, który zawiera odpowiednią liczbę wspólnych kodonów dla docelowego aminokwasu.
    UWAGA: Dla L-leucyny, gen oporności na kanamycynę kanR, który zawiera 29 kodonów leucyny, z których 27 to kodony powszechne, jest używany do budowy systemu selekcji13. Gen gfp, który zawiera 17 wspólnych kodonów z 19 kodonów leucyny, lub fioletowy gen kodujący białko prancerpurple (ppg), który zawiera 14 wspólnych kodonów leucyny, jest używany w systemie przesiewowym (tabela uzupełniająca 1).
  2. Zastąp wspólne kodony w genach markerowych synonimicznym rzadkim kodonem. W przypadku L-leucyny zastąp jej kodony w kanR, gfp lub ppg rzadkim kodonem CTA, generując odpowiednio kanR-RCs, gfp-RC lub ppg-RC13 (Tabela uzupełniająca 1).
    UWAGA: Częstość występowania rzadkiego kodonu w genach markerowych będzie miała wpływ na rygorystyczność systemu selekcji lub badań przesiewowych. Ogólnie rzecz biorąc, zwiększenie liczby rzadkich kodonów zwiększy rygorystyczność systemu selekcji lub badań przesiewowych. Aby osiągnąć odpowiednią siłę selekcji lub badań przesiewowych, zaprojektuj serię genów markerowych, które zawierają różną liczbę rzadkich kodonów i porównaj ich działanie.
  3. Generuj bloki budulcowe genów markerowych bogatych w rzadkie kodony za pomocą narzędzi takich jak GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) do syntezy genów. Alternatywnie, zamów geny markerowe z komercyjnych usług syntezy genów.
    1. Na stronie GeneDesign wybierz pozycję Projekt bloku konstrukcyjnego (nakładanie się o stałej długości).
    2. Wklej sekwencje genów markerowych bogatych w rzadkie kodony w polu Sekwencja.
    3. Umożliwia zdefiniowanie długości nakładania się oligonukleotydów zespołu; należy pamiętać, że domyślna wartość 40 pz działa poprawnie dla większości sekwencji.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją online, aby uzyskać więcej instrukcji dotyczących ustawień innych parametrów.
    4. Kliknij przycisk Projektuj bloki konstrukcyjne i uporządkuj oligonukleotydy wymienione na stronie.
  4. Zsyntetyzuj geny zmodyfikowane rzadkimi kodonami za pomocą dokładnej syntezy opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)15.
  5. Ligacja bogatego w rzadkie kodony kanR-RC do wektora pET-28a, gfp-RC do pSB1C3 i ppg-RC do CPB-37-44116.
    UWAGA: Mapy plazmidów pET-28a i pSB1C3 są dostępne w internetowej bazie danych plazmidów SnapGene (tabela uzupełniająca 1); mapa plazmidu CPB-37-441 jest dostępna na stronie internetowej białka chromogennego ATUM.
    1. Na lodzie dodać wektor i fragmenty znacznika w stosunku molowym 1:1 do 7,5 μl mieszanki montażowej (patrz tabela materiałów) do całkowitej objętości 10 μl. Inkubować próbkę w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
    2. Przekształć 5 μl produktu montażowego w 50 μl właściwych komórek (patrz tabela materiałów) w temperaturze 42 °C przez 30 s.
    3. Odzyskaj komórki w pożywce SOC (Super optymalny bulion z represją katabolitu) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, pokryj je na pożywce agarowej LB (bulion lizogeniczny) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
    4. Zaszczepić kolonię na pożywce LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
    5. Wyizoluj plazmid za pomocą preferowanego zestawu komercyjnego.

2. Optymalizacja warunków wyboru

  1. Spraw, aby szczep macierzysty używany do mutagenezy został przekształcony w kompetentne komórki17.
  2. Przekształć 50 μl kompetentnych komórek za pomocą 1 μl plazmidu, który przenosi kanR typu dzikiego, i przekształć inny zestaw kompetentnych komórek z plazmidem zawierającym kan R-RC29 z całym kodonem leucyny zastąpionym rzadkim kodonem CTA.
  3. Dodać 950 μl pożywki SOC i inkubować próbkę w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Umieścić 100 μl kultury komórkowej na pożywce agarowej LB zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez około 8 godzin, aż pojawią się kolonie.
  5. Wybierz kolonie, które zawierają kanR typu dzikiego i bogaty w rzadkie kodony leucyny kan R-RC29 i użyj każdej z nich do zaszczepienia 5 ml pięciokrotnie rozcieńczonej pożywki LB (0,2 x LB) zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny. Próbki inkubować w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Medium ma kluczowe znaczenie dla systemu selekcji. Powinien zawierać tylko tyle węgla i azotu, aby umożliwić ekspresję białka oporności na antybiotyki z genu typu dzikiego, a nie z pochodnych zmodyfikowanych kodonami rzadkimi. W tym przypadku stężenie L-leucyny w pożywce 1x LB jest zbyt wysokie, aby całkowicie zahamować ekspresję białka z bogatego w rzadkie kodony kanR. W ten sposób rozcieńczoną pożywkę LB ze współczynnikiem rozcieńczenia, takim jak 5, stosuje się do wytworzenia wyraźnej różnicy w ekspresji białek z genów typu dzikiego i genów bogatych w rzadkie kodony.
  6. Przenieść 200 μl każdej z kultur komórkowych na 96-dołkową płytkę w trzech powtórzeniach w określonych punktach czasowych (np. 8 godzin, 16 godzin i 24 godzin). Zmierz średnicę zewnętrzną600 (gęstość optyczną przy 600 nm) za pomocą czytnika płytek.
    UWAGA: Jeśli nie można wykryć spadku OD600 w komórce dla szczepów zawierających geny markerowe bogate w kodony rzadkie w porównaniu z OD600 szczepu zawierającego geny markerowe typu dzikiego, spróbuj zwiększyć ilość rzadkiego kodonu w genach markerowych lub użyć bardziej rozcieńczonej pożywki.
  7. Wykonać test podawania aminokwasów, aby sprawdzić, czy ekspresja genów markerowych bogatych w rzadkie kodony (np. kan R-RC29) może zostać przywrócona przez zwiększenie stężenia docelowych aminokwasów.
    UWAGA: W celu selekcji nadproducentów L-leucyny, L-leucyna jest używana do karmienia.
    1. Zaszczepić szczepy zawierające gen markera kan R-RC29 w 5 ml 0,2x LB (zawierającego 50 μg·mL-1 kanamycyny) z lub bez dostarczania 1 g·L-1 L-leucyny. Zaszczep kolejne 5 ml 0,2x LB szczepami, które zawierają kanR typu dzikiego jako kontrolę. Inkubować próbki w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    2. Zmierz OD600 dla każdej kultury w określonych punktach czasowych (np. 15 godzin, 17 godzin, 19 godzin i 22 godzin).

3. Optymalizacja warunków przesiewowych

  1. Przekształć 50 μl szczepu rodzicielskiego używanego do mutagenezy za pomocą 1 μl plazmidu (~50 ng·μL-1), który przenosi gfp typu dzikiego lub ppg typu dzikiego. Przekształć również szczep rodzicielski za pomocą bogatych w rzadkie kodony pochodnych genów markerowych.
  2. Dodać 950 μl pożywki SOC i inkubować próbkę w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Umieścić 100 μl kultury komórkowej na pożywce agarowej LB zawierającej odpowiednie antybiotyki (25 μg·mL-1 chloramfenikolu dla plazmidu gfp zawierającego marker cmR lub 50 μg·mL-1 kanamycyny dla plazmidu ppg zawierającego marker kanR) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Wybierz jedną kolonię, która zawiera gfp lub ppg typu dzikiego i jedną kolonię, która zawiera odpowiednią pochodną bogatą w rzadkie kodony, i przenieś je indywidualnie do 5 ml odpowiednio rozcieńczonej pożywki LB. Próbki inkubować w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W przypadku szczepów E. coli zawierających rzadkie kodony oleucyny gfp-RC lub ppg-RC, nierozcieńczona pożywka LB (1x LB) może być użyta do wytworzenia znaczących różnic w ekspresji genów markerowych typu dzikiego i bogatych w rzadkie kodony. Indukowalne promotory są również wykorzystywane do kierowania ekspresją genów markerów przesiewowych. Rozpocznij indukcję, gdy komórki wejdą w fazę wykładniczą, aby osiągnąć lepszą dyskryminację.
  5. W przypadku markerów fluorescencyjnych przenieść 200 μl każdej z kultur komórkowych na 96-dołkową czarną płytkę z przezroczystym dnem w trzech egzemplarzach w określonych punktach czasowych (np. 2 godziny, 4 godziny i 6 godzin). Zmierz OD600 i fluorescencję i oblicz intensywność fluorescencji (stosunek fluorescencji do OD600). W przypadku markerów chromogennych zmierz rozwój barwy kultur komórkowych.
    UWAGA: Jeśli nie można wykryć niższej intensywności fluorescencji dla szczepów zawierających gfp-RC w porównaniu ze szczepami zawierającymi gfp typu dzikiego, lub jeśli nie można wykryć jaśniejszego koloru dla komórek wyrażających fioletowe białko z ppg-RC niż z genu typu dzikiego, spróbuj zwiększyć liczbę rzadkich kodonów w genach markerowych lub użyć bardziej rozcieńczonej pożywki.
  6. Wykonać test karmienia (patrz kroki 2.7.1 i 2.7.2). Zmierz intensywność fluorescencji lub rozwój koloru w określonych punktach czasowych (np. 12 godzin, 18 godzin i 24 godzin).

4. Identyfikacja nadproducentów aminokwasów

  1. Zaszczepić 100 μl kultury mutantów w 5 ml pożywki LB (2% v/v) i inkubować ją w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C, aż wartości OD600 osiągną 0,4.
  2. Zamień mutanty w kompetentne komórki17.
  3. Przekształć 50 μl zmutowanych komórek z 1 μl plazmidu (~50 ng·μL-1) przenoszącego marker selekcyjny kan R-RC29 lub markery przesiewowe gfp-RC lub ppg-RC. Dodać 950 μl pożywki SOC i obracać próbkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Wybierz nadproducentów aminokwasów.
    1. Odwirować kulturę komórkową przy 4 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i dodać 5 ml pożywki 0,2x LB zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny. Próbkę inkubować przez noc w wytrząsarce o temperaturze 37 °C.
    2. Rozmnażać przez noc (np. 100 μl, w zależności od gęstości komórek hodowli) na pożywce agarowej o wielkości 0,2 LB zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 h.
      UWAGA: Rozwinięte kolonie są kandydatami docelowych nadproducentów aminokwasów i, w tym przypadku, nadproducentów L-leucyny.
  5. Przesiewać nadproducentów aminokwasów.
    1. Umieścić odpowiednią liczbę komórek (np. 100 μl), w których znajduje się marker przesiewowy (jak opisano w kroku 4.3) na pożywce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk (25 μg·mL-1 chloramfenikolu do badań przesiewowych z gfp-RC i 50 μg·mL-1 kanamycyny do badania przesiewowego z ppg-RC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
    2. Zaszczepić pożywkę LB zawierającą odpowiedni antybiotyk (patrz krok 4.5.1) każdą pojedynczą kolonię z płytki. Inkubować próbki w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    3. Zmierz OD600 i fluorescencję i oblicz intensywność fluorescencji, jeśli używany jest gfp-RC. Zmierz rozwój koloru kultur komórkowych, jeśli używany jest ppg-RC. Należy zauważyć, że szczepy wykazujące wyższą intensywność fluorescencji lub głębszy kolor niż szczep rodzicielski są kandydatami na nadproducentów aminokwasów i, w tym przypadku, nadproducentów L-leucyny.
      UWAGA: Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją nadaje się również do identyfikacji pojedynczych komórek o wysokim wskaźniku, gdy do badań przesiewowych wykorzystuje się geny białek fluorescencyjnych bogate w rzadkie kodony.
  6. Sprawdź produktywność aminokwasów kandydujących szczepów.
    1. Zaszczepić 5 ml pożywki LB każdym z kandydujących szczepów i pozwolić komórkom rosnąć przez noc w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    2. Pobrać komórki z 1 ml kultury komórkowej przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody.
    3. Zaszczepić 20 ml pożywki M9 zawierającej 4% glukozy 200 μl zawiesiny komórkowej i inkubować w wytrząsarce o pojemności 250 ml przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    4. Odwirować 1 ml pożywki przy 4 000 x g przez 5 minut. Przenieść 200 μl supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotować roztwory L-leucyny (klasa HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)) 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 i 1 g·L-1 jako wzorce.
    5. Dodać 100 μl 1 mM trietyloaminy i 100 μl 1 M izotiocyjanianu fenylu do supernatantu i wzorców, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h18.
      UWAGA: Trietyloamina i izotiocyjanian fenylu mogą powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu oraz są szkodliwe w przypadku wdychania. Nosić rękawice i maskę i, jeśli to możliwe, wykonać tę czynność w dygestorium.
    6. Dodaj 400 μl n-heksanu do tej samej probówki i wiruj przez 10 s. Przefiltruj dolną fazę zawierającą pochodne aminokwasów przez membranę politetrafluoroetylenową o grubości 0,2 μm.
      UWAGA: n-heksan może powodować podrażnienie skóry. Nosić rękawice i odzież ochronną. W przypadku kontaktu ze skórą spłucz skórę dużą ilością wody.
    7. Przygotować ruchomą fazę A, mieszając 0,1 M octan sodu (pH 6,5) i acetonitryl w stosunku objętościowym 99,3:0,7. Przygotować acetonitryl (80% v/v) jako fazę ruchomą B. Przefiltrować wszystkie fazy ruchome przez membrany z politetrafluoroetylenu 0,2 μm.
      UWAGA: Acetonitryl jest szkodliwy w przypadku wdychania i może powodować podrażnienia skóry i oczu. Nosić rękawice i odzież ochronną i wykonać tę czynność w dygestorium.
    8. Uruchomić 1 μl próbki na ultra-HPLC wyposażonej w kolumnę C18 zgodnie z programem elucji w tabeli 1 przy natężeniu przepływu 0,42 ml·min-1 i temperaturze kolumny 40 °C. Wykryć docelowe aminokwasy przy długości fali 254 nm za pomocą detektora diodowego i obliczyć ich stężenia, odwzorowując obszary pików na krzywej wzorcowej.
Rozdział szt.
Czas (min)Faza mobilna A (%)Faza ruchoma B (%)
0Rozdział 98cyfra arabska
3,570Rozdział 30
7Rozdział 4357
7,10100
11Rozdział 98cyfra arabska

Tabela 1: Program elucji do ilościowego oznaczania aminokwasów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla systemu selekcji należy zaobserwować gwałtowny spadek OD600 dla szczepów zawierających gen oporności na antybiotyki bogaty w rzadkie kodony w porównaniu do szczepu posiadającego gen oporności na antybiotyki typu dzikiego, gdy są hodowane w odpowiednim podłożu (Rysunek 1a). W tych samych warunkach spadek OD600 w komórce staje się bardziej oczywisty wraz ze wzrostem liczby rzadkich kodonów w genie oporności na antybiotyki (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczba rzadkich kodonów w genach markerowych oraz pożywka selekcyjna lub przesiewowa mają kluczowe znaczenie dla zahamowania ekspresji białek z genów markerowych zmodyfikowanych rzadkimi kodonami. Jeśli nie można wykryć znaczącej różnicy między ekspresjami białek z genów markerowych typu dzikiego a ich pochodnych, zwiększenie liczby rzadkich kodonów lub użycie pożywki o ograniczonej zawartości składników odżywczych może wzmocnić różnice. Jeśli jednak efekt hamowania jest zbyt silny, ekspresja białka może nie zostać odzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspólnie wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 21676026), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (grant nr 2017YFD0201400) oraz Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (grant nr 2017M620643). Prace w UCLA Institute of Advancement (Suzhou) były wspierane przez wewnętrzne granty z prowincji Jiangsu i Parku Przemysłowego Suzhou.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylThermo51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep KitTransgenEM111-01
EasyPure Zestaw do szybkiej ekstrakcji żeluTransgenEG101-01
Gibson assembly master mixNEBE2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideSolarbioI8070
L-leucynaSigmaL8000
Czytnik mikropłytekBiotekSynergy 2
n-heksanThermo H3061
Izotiocyjanian fenyluSigmaP1034
PrancerPurple CPB-37-441ATUMCPB-37-441
TransStar FastPfu Polimeraza DNA muchyTransgenAP231-01
TriethylamineSigmaT0886
Ultra-wysokowydajna chromatografia cieczowaAgilent1290 Infinity II
Typ dziki C. glutamicumATCC13032
XL10-Gold E. coli kompetentnakomórka Agilent200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 kolumnaAgilent959759-902K
:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616(2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507(2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Markery rzadkich kodon wstronniczo w u yciu kodon wanaliza ekspresji bia ekprzesiewanie bia ek fluorescencyjnychtest marker w chromogennychprotok transformacji plazmidowejpomiar OD600analiza aminokwas w metod HPLCoptymalizacja rygorystyczno ci selekcji

Powiązane artykuły