Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

Yi-Xin Huo; Bo Zheng; Ning Wang; Yunpeng Yang; Xinxin Liang; Xiaoyan Ma

doi:10.3791/59331

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59331

⸱

24 czerwca 2019

Yi-Xin Huo¹^,² , Bo Zheng¹ , Ning Wang¹ , Yunpeng Yang¹ , Xinxin Liang¹ , Xiaoyan Ma¹

¹Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, ²UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia alternatywną strategię do konwencjonalnej metody opartej na toksycznych analogach w identyfikacji nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony, aby osiągnąć jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość.

Streszczenie

Aby zaspokoić stale rosnący rynek aminokwasów, potrzebne są wysokowydajne szczepy produkcyjne. Nadproducenci aminokwasów są konwencjonalnie identyfikowani poprzez wykorzystanie konkurencji między aminokwasami a ich analogami. Jednak ta metoda oparta na analogach ma niską dokładność, a właściwe analogi dla określonych aminokwasów są ograniczone. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną strategię, która umożliwia dokładne, czułe i wysokoprzepustowe badania przesiewowe nadprodukcji aminokwasów przy użyciu markerów bogatych w rzadkie kodony. Strategia ta jest inspirowana zjawiskiem tendencyjności użycia kodonów w translacji białek, dla której kodony są klasyfikowane jako powszechne lub rzadkie na podstawie ich częstości występowania w kodującym DNA. Translacja rzadkich kodonów zależy od odpowiadających im rzadkich transferowych RNA (tRNA), które nie mogą być w pełni naładowane przez pokrewne aminokwasy pod wpływem głodu. Teoretycznie rzadkie tRNA mogą być ładowane, jeśli występuje nadmiar aminokwasów po naładowaniu synonimicznych powszechnych izoakceptorów. W związku z tym opóźnione translacje spowodowane rzadkimi kodonami mogą zostać przywrócone przez karmienie lub wewnątrzkomórkową nadprodukcję odpowiednich aminokwasów. Przy takim założeniu ustanawia się system selekcji lub badań przesiewowych w celu identyfikacji nadprodukcji aminokwasów poprzez zastąpienie wspólnych kodonów docelowych aminokwasów ich synonimicznymi rzadkimi alternatywami w genach oporności na antybiotyki lub genach kodujących białka fluorescencyjne lub chromogenne. Wykazaliśmy, że ekspresja białek może być znacznie utrudniona przez włączenie rzadkich kodonów i że poziomy białek korelują dodatnio ze stężeniami aminokwasów. Korzystając z tego systemu, nadproducenci wielu aminokwasów mogą być łatwo odsiewani z bibliotek mutacji. Ta strategia oparta na rzadkich kodonach wymaga tylko jednego zmodyfikowanego genu, a gospodarz ma mniejsze szanse na uniknięcie selekcji niż w przypadku innych metod. Oferuje alternatywne podejście do pozyskiwania nadproducentów aminokwasów.

Wprowadzenie

Obecna produkcja aminokwasów opiera się głównie na fermentacji. Jednak miana i plony dla większości szczepów produkujących aminokwasy są poniżej rosnących wymagań globalnego rynku aminokwasów, który jest wart miliardy dolarów¹^,². Uzyskanie wysokowydajnych nadproducentów aminokwasów ma kluczowe znaczenie dla ulepszenia przemysłu aminokwasowego.

Tradycyjna strategia identyfikacji nadproducentów aminokwasów wykorzystuje konkurencję między aminokwasami i ich analogami w syntezie białek³^,⁴. Analogi te są w stanie ładować tRNA, kt....