Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59333

⸱

22 września 2019

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), Neurotherapeutic Development Unit (NTDU), National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Podsumowanie

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Streszczenie

Cytotoksyczność to krytyczny parametr, który musi być określony ilościowo podczas badania leków, które mogą mieć korzyści terapeutyczne. Z tego powodu wiele testów przesiewowych leków wykorzystuje cytotoksyczność jako jedną z krytycznych cech, które należy profilować dla poszczególnych związków. Komórki w hodowli są użytecznym modelem do oceny cytotoksyczności przed przystąpieniem do obserwacji obiecujących związków ołowiu w bardziej kosztownych i pracochłonnych modelach zwierzęcych. Opisujemy strategię identyfikacji związków, które wpływają na wzrost komórek w linii tdTomato z ekspresją ludzkich nerwowych komórek macierzystych (NSC). Strategia wykorzystuje dwa uzupełniające się testy do oceny liczby komórek. Jeden test działa poprzez redukcję bromku 3-(4,5-dimetylotizolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) do formazanu jako wskaźnika zastępczego liczby komórek, a drugi bezpośrednio zlicza tdPomidor wyrażający NSC. Te dwa testy można wykonać jednocześnie w jednym eksperymencie i nie są pracochłonne, szybkie i niedrogie. W ramach strategii opisanej w tej demonstracji przetestowano 57 związków w eksploracyjnym pierwotnym badaniu przesiewowym pod kątem toksyczności na 96-dołkowej płytce. Trzy z trafień zostały dodatkowo scharakteryzowane w sześciopunktowej odpowiedzi na dawkę przy użyciu tej samej konfiguracji testu, co w pierwotnym badaniu przesiewowym. Oprócz zapewnienia doskonałego potwierdzenia toksyczności, porównanie wyników z tych dwóch testów może być skuteczne w identyfikacji związków wpływających na inne aspekty wzrostu komórek.

Wprowadzenie

Jedną z najważniejszych cech, które należy określić dla związku chemicznego o potencjale terapeutycznym, jest jego toksyczność dla komórek zwierzęcych. Ta cecha określi, czy lek jest dobrym kandydatem do bardziej obszernych badań. W większości przypadków poszukuje się związków o minimalnej toksyczności, ale zdarzają się sytuacje, w których interesujący jest związek mający zdolność do zabijania określonych typów komórek, np. leki przeciwnowotworowe. Chociaż całe zwierzęta są najlepszymi systemami modelowymi do określania toksyczności ogólnoustrojowej, związane z tym koszty i praca są zaporowe, gdy trzeba przetestować więcej niż kilka związków. W związku z tym hodowla komórek ssaków jest zwykle stosowana jako najbardziej efektywna alternatywa1,2. Badania przesiewowe leków o małej i średniej przepustowości są ważną metodą, za pomocą której można ocenić toksyczność w hodowli komórkowej. Ekrany te mogą być używane do przeszukiwania bibliotek z adnotacjami ukierunkowanych na poszczególne ścieżki sygnałowe. Ogólny format takiego badania przesiewowego polega na wstępnym przetestowaniu wszystkich związków w bibliotece przy pojedynczej dawce (zwykle 10 μM) w eksploracyjnym badaniu przesiewowym toksyczności pierwotnej, a następnie przeprowadzeniu dogłębnego badania przesiewowego odpowiedzi na dawkę wtórną, aby w pełni scharakteryzować profil toksyczności trafień z pierwotnego badania. Metody wdrażania tej strategii zostaną opisane tutaj i zapewnią szybki, skuteczny i niedrogi sposób identyfikacji i charakterystyki związków toksycznych.

Opracowano wiele metod oceny cytotoksyczności małych związków i nanomateriałów w komórkach ssaków3,4. Należy zauważyć, że niektóre materiały mogą wchodzić w interakcje z testem, dostarczając mylących wyników, a takie interakcje powinny być testowane podczas charakteryzowania trafień z ekranów toksyczności4. Testy cytotoksyczności obejmują wykluczenie błękitu trypanowego5, test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH)6, test niebieskiego Alamar7, ester acetoksymetylowy kalcienu (AM)8, oraz test ATP9. Wszystkie te testy mierzą różne aspekty metabolizmu komórkowego, które mogą służyć jako wskaźnik zastępczy dla liczby komórek. Chociaż wszystkie oferują korzyści, testy na bazie soli tetrazoliowych, takie jak bromek 3-(4,5-dimetylotizol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT), 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofeny)-2H-tetrazolium-5-karboksyjanilid sole wewnętrznej (XTT)-1 i 4-(3-[4-jodofenylo]-2-[4-nitrofenylo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-disulfonian benzenu (WST-1)10,11 zapewniają dobrą dokładność i łatwość użycia przy niskich kosztach. MTT, który zostanie wykorzystany w tej demonstracji, jest redukowany do nierozpuszczalnego formazanu przez reduktazę mitochondrialną, a szybkość tej konwersji jest silnie skorelowana z liczbą komórek. Test ten jest rutynowo stosowany zarówno na małą skalę, jak i do bibliotek przesiewowych zawierających do 2,000 związków12. Bezpośrednie liczenie komórek za pomocą znakowanego markera oferuje inną metodę oceny liczby komórek i w przeciwieństwie do testu MTT może dostarczyć dodatkowych informacji na temat dynamiki wzrostu komórek. Dostępnych jest kilka publicznie dostępnych algorytmów do wykonywania automatycznych analiz zliczania komórek, a także zastrzeżone algorytmy, które są częścią pakietów oprogramowania do czytników obrazowania13,14. W tym opisie metody, linia ludzkich nerwowych komórek macierzystych (NSC), która została genetycznie zmodyfikowana w celu konstytutywnej ekspresji tdTomato15, posłuży jako linia testowa do porównania wyników żywotności komórek między testem MTT a testem automatycznego zliczania komórek w badaniu przesiewowym oceniającym toksyczność 57 badanych związków. Chociaż głównym celem tej strategii była identyfikacja i scharakteryzowanie związków toksycznych, ma ona dodatkową zaletę w postaci potencjalnej identyfikacji związków hamujących i stymulujących wzrost, a tym samym zapewnia skuteczną metodę identyfikacji leków, które mogą modulować wzrost komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kultura NSC

UWAGA: Manipulacja ludzką linią NSC zostanie opisana poniżej, ale dowolna linia komórkowa może być użyta do tego protokołu. Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Pokryj 96-dołkową płytkę błoną podstawną/macierzą zewnątrzkomórkową (ECM).
    1. Rozmrozić podwielokrotność ECM (Tabela Materiałów), która ułatwi mocowanie NSC, na lodzie. Rozcieńczyć ECM do odpowiedniego stężenia (zwykle 1:100) w 10 ml pożywki bazowej (tabela materiałów) i dodać 50 μl na studzienkę do każdego z 60 dołków wewnętrznych płytki 96-dołkowej (Rysunek 1). Używaj tylko wewnętrznych 60 studzienek, aby uniknąć artefaktów, które mogą wynikać z efektu krawędzi16.
    2. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) przez co najmniej 30 minut.
  2. Dysocjacja i płytka nerwowych komórek macierzystych.
    UWAGA: Komórki do użycia w tej metodzie powinny być hodowane do co najmniej 80% konfluencji w kolbie T75.
    1. Hodowla komórek w kolbie T75 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce NSC, która składa się z pożywki zasadowej, B27, aminokwasów endogennych, 2 mM glutaminy i 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGFb lub FGF2).
    2. Wyjmij komórki z inkubatora, gdy osiągną 80% zbieżności i odessaj pożywkę NSC. Dodać odpowiednią ilość odczynnika do dysocjacji komórek (3 ml dla kolby T75; Tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w inkubatorze.
    3. Po inkubacji dodać 7 ml pożywki NSC do kolby T75 i energicznie pipetować, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączą. Przenieść zdysocjowany roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.
    4. Po odwirowaniu usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki NSC i zliczyć komórki.
    5. Dostosuj koncentrację komórek do 200 000 komórek/ml za pomocą pożywki NSC. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w celu jednorodnego posiewu w studzienkach.
    6. Płytka 100 μl mieszaniny komórek (20 000 komórek) w 60 studzienkach wewnętrznych trzech 96-dołkowych płytek, które zostały pokryte zgodnie z opisem w sekcji 1.1. Użyj sześciu z ośmiu szczelin 8-kanałowego pipetora wielokanałowego, aby płytkować komórki kolumna po kolumnie.
    7. Dodać 100 μl pożywki zasadowej lub pożywki NSC do wszystkich studzienek bez komórek, aby zminimalizować potencjalne parowanie z najbardziej zewnętrznych studzienek.
    8. Pod mikroskopem hodowli komórkowej sprawdź wzrokowo co najmniej 10 dołków na każdej z trzech 96-dołkowych płytek, aby potwierdzić, że komórki są wysiewane w oczekiwanej gęstości. Nie należy przystępować do testu, jeśli komórki są posiane z gęstością zbyt rzadką lub zbyt gęstą.

2. Leczenie komórek związkami

UWAGA: Domowa biblioteka testowana w tej demonstracji zawiera związki, które modulują szlaki sygnałowe bezskrzydłe/zintegrowane (Wnt), kwas retinowy, transformujący czynnik wzrostu-beta (TGF-β) i soniczny jeż, a także różne kinazy tyrozynowe.

  1. Pierwotne badanie eksploracyjne pod kątem toksyczności/liczby komórek
    1. Podwielokrotność 50−100 μl maksymalnie 57 badanych związków (tabela uzupełniająca 1) przy stężeniu 10 mM w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do wewnętrznych 60 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, V lub okrągłodennym z trzema studzienkami DMSO jako kontrolą (patrz Rysunek 1 dla mapy płyty). Będzie to służyć jako główna płytka złożona z 25 μl mieszanki, którą można kilkakrotnie zamrażać i rozmrażać.
      UWAGA: Nie należy używać płytek z płaskim dnem, ponieważ trudniej będzie zassać z nich małe objętości związków za pomocą pipetora stołowego.
    2. Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora 16-24 godziny po podzieleniu, jak opisano w sekcji 1, i odessać pożywkę NSC kolumna po kolumnie za pomocą 8-kanałowego pipetora wielodołkowego, używając tylko sześciu z ośmiu szczelin wielodołkowych. Dodać 95 μl świeżej pożywki NSC do komórek na każdej z trzech płytek repliki i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze do momentu zakończenia kroku 2.1.4 poniżej.
    3. Dodać 49 μl pożywki NSC do każdej z 60 wewnętrznych studzienek pustej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, V lub okrągłodennej z 8-kanałowym pipetem wielodołkowym. Rozszczelnić płytkę wzorcową i za pomocą pipety stołowej lub równoważnego przyrządu odpipetować 1 μl związku z płytki wzorcowej do 49 μl pożywki NSC w każdym z 60 wewnętrznych studzienek.
    4. Wymieszaj rozcieńczony związek 3x z pipetorem stołowym.
    5. Wyjąć z inkubatora trzy 96-dołkowe płytki NSC, odpipetować 15 μl każdego rozcieńczonego związku za pomocą pipetora stołowego i dozować 5 μl podwielokrotności związku do każdej z trzech płytek.
      UWAGA: To rozcieńczenie związku w stosunku 1:20 do komórek w połączeniu z początkowym rozcieńczeniem 1:50 w kroku 2.1.3 daje rozcieńczenie 1:1000 takie, że końcowe stężenie związków na NSC wyniesie 10 μM przy stężeniu DMSO 0,1%, a końcowe stężenie dla kontroli DMSO wyniesie 0,1%.
    6. Inkubować komórki ze związkiem przez 72 godziny i przystąpić do testów cytotoksyczności. Można stosować krótsze odstępy czasu, ale 72-godzinny okres inkubacji powinien maksymalizować potencjalne efekty cytotoksyczne badanych związków.
  2. Test dawka-odpowiedź
    UWAGA: Konfiguracja dla 96-dołka używanego do odpowiedzi na dawkę jest wyświetlana w Rysunek 2.
    1. Użyć kolumny 2 dla sześciu kontrprób kontrolnych DMSO i przeprowadzić potrójne próby maksymalnie trzech różnych związków w dwukrotnych seryjnych rozcieńczeniach przy sześciu dawkach, zaczynając od wysokiej dawki 10 μM.
    2. Rozcieńczyć 4 μl DMSO lub badanego związku w DMSO w 196 μl pożywki NSC w 1,5 ml probówce do mikrowirówki. Dodać 25 μl DMSO do kolumny studzienek z B2-G2 i 50 μl badanych związków do rzędu z B3-B11 z trzema badanymi związkami w 10 mM triplikatach w rzędach B3-B5, B6-B8 i B9-B11.
    3. Odpipetować 25 μl pożywki NSC do pozostałych pustych kolumn w wewnętrznej części płytki 96-dołkowej. Usunąć 25 μl związku z dołków B3-B11 za pomocą pipetora wielokanałowego, dodać do studzienek C3-C11 i wymieszać co najmniej pięć razy. Powtórzyć proces dla pozostałych rzędów, aby wytworzyć potrójne roztwory w dwukrotnych rozcieńczeniach, co daje w sumie sześć dawek dla każdego ze związków.
    4. Generować NSC dla odpowiedzi na dawkę dokładnie tak, jak opisano dla pierwotnego badania przesiewowego w punkcie 2.1. Związki odpowiedzialne za reakcję na dawkę są dodawane do komórek i inkubowane na nich dokładnie tak, jak opisano w krokach 2.1.5 i 2.1.6.
      UWAGA: Trzy powtórzenia biologiczne testu dawka-odpowiedź przeprowadza się poprzez powtórzenie testu na NSC przy różnych pasażach w różnych dniach.

3. Obrazowanie komórek na czytniku płytek

  1. Po inkubacji komórek ze związkami przez wyznaczony czas, zobrazuj komórki na czytniku płytkowym, aby określić liczbę komórek przed poddaniem działaniu substancji na studzienkę.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące obrazowania komórek są specyficzne dla czytnika, ale generalnie mają podobną strategię. Poniższe wskazówki dotyczą czytnika użytego w tej demonstracji (Spis materiałów).
  2. Wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie imagera, aby skonfigurować pliki protokołu i eksperymentu dla badania. Przejdź do trybu ręcznego Imager w Menedżerze zadań i kliknij Przechwyć teraz....
  3. Wybierz płytkę 96-dołkową jako typ naczynia, wybierz 10x dla powiększenia i czerwone białko fluorescencyjne (RFP) 531 i 593 do obrazowania tdTomato. Wybierz dołek, a następnie kliknij Autofokus, aby ustawić ostrość obrazu, i Auto Naświetlanie, aby uzyskać odpowiedni czas ekspozycji. W razie potrzeby ręcznie dostosuj ostrość i ekspozycję.
  4. Po uzyskaniu właściwej ostrości i ekspozycji kliknij ikonę aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie kliknij PROCESS/ANALZYE nad obrazem, aby kontynuować budowanie protokołu i wybierz zakładkę ANALIZA.
  5. Kliknij opcję Cellular Analysis (Analiza komórkowa) w obszarze ADD ANALYSIS STEP (KROK DODAWANIA ANALIZY) po prawej stronie obrazu, a następnie kliknij przycisk START (START). Obraz pokaże podświetlone komórki, aby wskazać każdą pojedynczą komórkę. Wybór opcji można kliknąć, aby zmienić parametry, aby lepiej wybrać komórki na podstawie progu fluorescencji lub rozmiaru komórki. Jeśli imager prawidłowo zlicza komórki, kliknij DODAJ KROK u dołu ekranu.
  6. Kliknij ikonę u góry ekranu, aby utworzyć eksperyment z zestawu obrazów, co spowoduje otwarcie okna z eksperymentem. Po otwarciu kliknij Procedura na karcie Protokół iw nowym oknie, które się otworzy, wybierz Odczyt, a następnie w nowym oknie kliknij pełną płytę, aby wybrać tylko 60 dołków zawierających komórki (B2... G11). Kliknij przycisk OK, aby zapisać zmiany, a następnie kliknij przycisk OK w oknie Procedura.
  7. Płytka może być teraz zobrazowana za pomocą tego protokołu, a plik eksperymentalny może zostać zapisany. Kliknij ikonę odtwarzania, aby uruchomić płytę. Po zobrazowaniu pierwszej płyty zobrazuj dwie pozostałe płyty. Po zakończeniu obrazowania pobierz dane dotyczące liczby komórek do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Rób wszystkie zdjęcia w 10-krotnym powiększeniu.

4. Test cytotoksyczności terminalnej MTT

UWAGA: Rozpocznij test MTT w ciągu dwóch godzin od zakończenia obrazowania tdTomato.

  1. Przygotować roztwór podstawowy MTT o stężeniu 5 mg/ml, odważając 25 mg MTT i ponownie umieszczając go w 5 ml pożywki NSC. Wiruj roztwór, aż nie będzie widocznych osadów MTT, co może potrwać kilka minut.
  2. Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć MTT w stosunku 1:10 w pożywce do hodowli komórkowych i dodać 100 μl MTT do każdej studzienki komórek.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Fioletowy osad powinien być widoczny mniej więcej proporcjonalnie do liczby komórek w studzience. Albo odessać roztwór MTT z płytek, albo szybko odwrócić płytkę, aby wytrzepać roztwór z płytki.
  4. Dodaj 50 μl 100% DMSO do każdej studzienki i potrząsaj płytkami w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 400 obr./min. Odczytaj absorbancję każdej studzienki przy długości fali 595 nm w czytniku płytek i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.

5. Analiza danych

  1. Wykonaj analizę liczby komórek i absorbancji tdTomato za pomocą odpowiedniego oprogramowania (komercyjny arkusz kalkulacyjny, R). Obliczyć średnie absorbancji lub liczby komórek trzech kontrprób DMSO na każdej płytce do celów normalizacji, a następnie podzielić wartość liczby komórek lub absorbancji dla każdego dołka na płytce przez tę średnią i przeliczyć na wartość procentową. W ten sposób uzyskuje się znormalizowaną liczbę komórek lub absorbancję w stosunku do kontroli DMSO dla każdej płytki.
  2. Obliczyć średnią znormalizowaną liczbę lub absorbancję i odchylenie standardowe dla studzienek replikowanych na trzech płytkach.
    UWAGA: W tym momencie powinny istnieć cztery różne zestawy znormalizowanych wartości: po jednym dla każdej z płytek i jedna średnia dla trzech powtórzonych płytek.
  3. Zachowaj ostrożność i użyj znormalizowanej wartości na poziomie lub poniżej 25% dla średniej z trzech powtórzonych płytek, aby sklasyfikować związek jako toksyczny. Ponadto, ponieważ na każdej płytce wykonuje się tylko jeden zabieg na związek, tylko związki, które spadają poniżej tego progu na wszystkich trzech płytkach repliki, oznaczaj jako toksyczne. Zbadaj obrazy fluorescencyjne wszystkich związków, które ta analiza filtruje jako toksyczne, aby wizualnie potwierdzić toksyczność.
    UWAGA: Identyfikacja związków o działaniu hamującym wzrost lub zwiększającym wzrost jest trudniejsza do oceny w teście eksploracyjnym tego typu ze względu na brak kontrprób na każdej płytce. Jednak poniżej znajduje się szybki sposób identyfikacji związków, które mogą spowolnić lub wzmocnić wzrost komórek.
  4. Obliczyć odchylenie standardowe dla trzech kontrprób kontrolnych DMSO na każdej płytce, a następnie przefiltrować pod kątem wszelkich związków, których średnie wartości są co najmniej dwa odchylenia standardowe powyżej lub poniżej kontrolki DMSO. Związki, które wypadają z tego filtra na każdej z trzech płytek, mogą wymagać dalszych badań.
  5. Dla odpowiedzi na dawkę należy stosować tę samą strategię analizy, co w przypadku badania przesiewowego toksyczności pierwotnej. Obliczyć średnie dla kontroli DMSO dla każdej kontrpróby biologicznej i wykorzystać te wartości do normalizacji procentu żywych komórek lub procentu absorbancji dla każdej kombinacji związek/dawka. Obliczyć średnie i błąd standardowy średnich dla wszystkich kombinacji związek/dawka dla trzech kontrprób biologicznych.
  6. Przekształć stężenie do jego wartości logarytmicznej, wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź dla logarytmu stężenia w funkcji znormalizowanej żywotności i dopasuj krzywą do analizy regresji nieliniowej (analizę można przeprowadzić w R lub różnych komercyjnych pakietach statystycznych). Z równania tej krzywej należy obliczyć dawkę śmiertelną 50 (lub technicznie w tym przypadku dawkę żywotną 50) lub stężenie związku, które powoduje 50% toksyczności. Wiele pakietów oprogramowania automatycznie oblicza tę liczbę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Automatyczne dane dotyczące zliczania komórek zidentyfikowały jedenaście związków o żywotności mniejszej niż 25% po znormalizowaniu do kontroli DMSO, podczas gdy dane MTT zidentyfikowały te same związki plus dwa dodatkowe (Tabela 1 i Tabela 2, zacieniowane na czerwono). Dwa związki, które okazały się toksyczne tylko w teście MTT (studzienki F3 i G10) miały odpowiednio 31% i 39%, liczba komórek tdPomidorowo-dodatnich jako kontrola i w kolejności rangi były kolejnymi dwoma najbardziej toks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym celem tego artykułu było opisanie strategii, która mogłaby skutecznie i niedrogo zidentyfikować związki wpływające na wzrost komórek w badaniach przesiewowych o niskiej lub umiarkowanej przepustowości. Do oceny liczby komórek wykorzystano dwie techniki ortogonalne, aby zwiększyć zaufanie do wniosków i zaoferować dodatkowe informacje, które nie byłyby dostępne, gdyby zastosowano tylko jeden test. W jednym z testów wykorzystano fluorescencyjny obrazownik komórek do bezpośredniego zliczania komórek tdTomato-dodatnic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NINDS Intramural Research Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific 17504001Składnik pożywki dla nerwowych komórek macierzystych.   
Piper laboratoryjnySorenson Bioscience73990Umożliwia pipetowanie biblioteki związków chemicznych do płytki 96-dołkowej za jednym razem.
BioLite 96-dołkowa wielotalerzowaThermo Scientific130188Każda 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej będzie działać.  Wykorzystujemy je w naszej pracy.
Mikroskop do hodowli komórkowychNikonEclipse TS100Oględziny komórek w celu zapewnienia odpowiedniej gęstości.
Cytat 5/ Czytnik obrazowaniaBioTekCYT3MFVSłuży do obrazowania komórek i odczytów absorbancji.
DMSOFisher Scientific610420010Rozpuszczalnik do związków stosowanych w sitach. Rozpuszcza osady MTT, aby ułatwić pomiary absorbancji.
FGF-basicPeprotech100-18BSkładnik z neuronalnymi komórkami macierzystymi.   
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202Macierz błony podstawnej nerwowych komórek macierzystych.  Umożliwia komórkom przyczepianie się do płytek do hodowli komórkowych.
Gen5 3.04Oprogramowanie BioTekAnalysis do określania liczby komórek wykazujących ekspresję tdTomato.
GlutaminaThermoFisher Scientific25030081Składnik pożywki dla nerwowych komórek macierzystych.   
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077Przechowywanie bibliotek złożonych.
MTTThermoFisher ScientificM6494Aktywny odczynnik testowy do określania żywotności komórek.
Pipeta wielokanałowaRaininE8-1200Dodawanie kolumna po kolumnie pożywki do hodowli komórkowych, MTT lub DMSO.
Pożywka neuropodstawowaThermoFisher Scientific21103049Pożywka na bazie nerwowych komórek macierzystych.
Kostka filtra RFPBioTek1225103Filter w Cytation 5 służy do obrazowania komórek eksprymujących tdTomato.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036Odczynnik do dysocjacji komórek.

Bibliografia

  1. National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
  2. Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
  3. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  4. Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
  5. Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
  6. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  7. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
  8. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  9. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  12. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  13. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  14. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100(2006).
  15. Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032(2015).
  16. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  17. Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
  18. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029(2018).
  19. Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
  20. Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
  21. Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
  22. Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wzrostu komórekbadanie cytotoksycznościtest MTTobrazowanie tdTomatoneuralne komórki macierzysteprzesiewanie związkówodpowiedź na dawkęliczenie komórektraktowanie DMSOczytnik płytek
Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.