Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.
Artykuł metodologiczny
Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.
Cytotoksyczność to krytyczny parametr, który musi być określony ilościowo podczas badania leków, które mogą mieć korzyści terapeutyczne. Z tego powodu wiele testów przesiewowych leków wykorzystuje cytotoksyczność jako jedną z krytycznych cech, które należy profilować dla poszczególnych związków. Komórki w hodowli są użytecznym modelem do oceny cytotoksyczności przed przystąpieniem do obserwacji obiecujących związków ołowiu w bardziej kosztownych i pracochłonnych modelach zwierzęcych. Opisujemy strategię identyfikacji związków, które wpływają na wzrost komórek w linii tdTomato z ekspresją ludzkich nerwowych komórek macierzystych (NSC). Strategia wykorzystuje dwa uzupełniające się testy do oceny liczby komórek. Jeden test działa poprzez redukcję bromku 3-(4,5-dimetylotizolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) do formazanu jako wskaźnika zastępczego liczby komórek, a drugi bezpośrednio zlicza tdPomidor wyrażający NSC. Te dwa testy można wykonać jednocześnie w jednym eksperymencie i nie są pracochłonne, szybkie i niedrogie. W ramach strategii opisanej w tej demonstracji przetestowano 57 związków w eksploracyjnym pierwotnym badaniu przesiewowym pod kątem toksyczności na 96-dołkowej płytce. Trzy z trafień zostały dodatkowo scharakteryzowane w sześciopunktowej odpowiedzi na dawkę przy użyciu tej samej konfiguracji testu, co w pierwotnym badaniu przesiewowym. Oprócz zapewnienia doskonałego potwierdzenia toksyczności, porównanie wyników z tych dwóch testów może być skuteczne w identyfikacji związków wpływających na inne aspekty wzrostu komórek.
Jedną z najważniejszych cech, które należy określić dla związku chemicznego o potencjale terapeutycznym, jest jego toksyczność dla komórek zwierzęcych. Ta cecha określi, czy lek jest dobrym kandydatem do bardziej obszernych badań. W większości przypadków poszukuje się związków o minimalnej toksyczności, ale zdarzają się sytuacje, w których interesujący jest związek mający zdolność do zabijania określonych typów komórek, np. leki przeciwnowotworowe. Chociaż całe zwierzęta są najlepszymi systemami modelowymi do określania toksyczności ogólnoustrojowej, związane z tym koszty i praca są zaporowe, gdy trzeba przetestować więcej niż kilka związków. W związku z tym hodowla k....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Kultura NSC
UWAGA: Manipulacja ludzką linią NSC zostanie opisana poniżej, ale dowolna linia komórkowa może być użyta do tego protokołu. Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Automatyczne dane dotyczące zliczania komórek zidentyfikowały jedenaście związków o żywotności mniejszej niż 25% po znormalizowaniu do kontroli DMSO, podczas gdy dane MTT zidentyfikowały te same związki plus dwa dodatkowe (Tabela 1 i Tabela 2, zacieniowane na czerwono). Dwa związki, które okazały się toksyczne tylko w teście MTT (studzienki F3 i G10) miały odpowiednio 31% i 39%, liczba komórek tdPomidorowo-dodatnich jako kontrola i w kolejności rangi były kolejnymi dwoma najbardziej toks.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Głównym celem tego artykułu było opisanie strategii, która mogłaby skutecznie i niedrogo zidentyfikować związki wpływające na wzrost komórek w badaniach przesiewowych o niskiej lub umiarkowanej przepustowości. Do oceny liczby komórek wykorzystano dwie techniki ortogonalne, aby zwiększyć zaufanie do wniosków i zaoferować dodatkowe informacje, które nie byłyby dostępne, gdyby zastosowano tylko jeden test. W jednym z testów wykorzystano fluorescencyjny obrazownik komórek do bezpośredniego zliczania komórek tdTomato-dodatnic.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ta praca była wspierana przez NINDS Intramural Research Program.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific 17504001 | Składnik pożywki dla nerwowych komórek macierzystych. | |
| Piper laboratoryjny | Sorenson Bioscience | 73990 | Umożliwia pipetowanie biblioteki związków chemicznych do płytki 96-dołkowej za jednym razem. |
| BioLite 96-dołkowa wielotalerzowa | Thermo Scientific | 130188 | Każda 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej będzie działać. Wykorzystujemy je w naszej pracy. |
| Mikroskop do hodowli komórkowych | Nikon | Eclipse TS100 | Oględziny komórek w celu zapewnienia odpowiedniej gęstości. |
| Cytat 5/ Czytnik obrazowania | BioTek | CYT3MFV | Służy do obrazowania komórek i odczytów absorbancji. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Rozpuszczalnik do związków stosowanych w sitach. Rozpuszcza osady MTT, aby ułatwić pomiary absorbancji. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Składnik z neuronalnymi komórkami macierzystymi. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Macierz błony podstawnej nerwowych komórek macierzystych. Umożliwia komórkom przyczepianie się do płytek do hodowli komórkowych. |
| Gen5 3.04 | Oprogramowanie BioTek | Analysis do określania liczby komórek wykazujących ekspresję tdTomato. | |
| Glutamina | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Składnik pożywki dla nerwowych komórek macierzystych. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Przechowywanie bibliotek złożonych. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Aktywny odczynnik testowy do określania żywotności komórek. |
| Pipeta wielokanałowa | Rainin | E8-1200 | Dodawanie kolumna po kolumnie pożywki do hodowli komórkowych, MTT lub DMSO. |
| Pożywka neuropodstawowa | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Pożywka na bazie nerwowych komórek macierzystych. |
| Kostka filtra RFP | BioTek | 1225103 | Filter w Cytation 5 służy do obrazowania komórek eksprymujących tdTomato. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Odczynnik do dysocjacji komórek. |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie