Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Podsumowanie

Pochodzenie flawonolu jest kluczowe dla jego zastosowania w opiece zdrowotnej i przemyśle spożywczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół biosyntezy flawonolu z flawanonu i omawiamy kluczowe etapy i jego zalety w porównaniu z innymi podejściami.

Streszczenie

Flawonole to główna podklasa flawonoidów o różnorodnych działaniach biologicznych i farmakologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę enzymatycznej syntezy flawonolu in vitro. W tej metodzie Atf3h i Atfls1, dwa kluczowe geny w szlaku biosyntezy flawonoli, są klonowane i nadmiernie eksprymowane w Escherichia coli. Rekombinowane enzymy są oczyszczane przez kolumnę powinowactwa, a następnie w określonym buforze syntetycznym tworzy się kaskada bienzymatyczna. Dwa flawonole są syntetyzowane w tym systemie jako przykłady i oznaczane za pomocą analiz TLC i HPLC/LC/MS. Metoda ta wykazuje oczywistą przewagę w otrzymywaniu flawonoli w porównaniu z innymi podejściami. Oszczędza czas i pracę oraz jest wysoce opłacalny. Reakcja jest łatwa do dokładnego kontrolowania, a tym samym skalowania do masowej produkcji. Docelowy produkt można łatwo oczyścić dzięki prostym komponentom systemu. Jednak system ten jest zwykle ograniczony do produkcji flawonolu z flawanonu.

Wprowadzenie

Flawonole są główną podklasą flawonoidów roślinnych i biorą udział w rozwoju i pigmentacji roślin1^,2,3. Co ważniejsze, związki te mają szeroki zakres korzystnych dla zdrowia działań, takich jak przeciwnowotworowe^4,5, przeciwutleniające⁶, przeciwzapalne⁷, przeciwotyłość⁸, przeciwnadciśnieniowe⁹ i właściwości przywoływania pamięci¹⁰, co doprowadziło do przeprowadzenia wielu badań nad tymi metabolitami wtórnymi pochodzenia roślinnego. Tradycyjnie związki te pochodzą głównie z ekstrakcji roślinnej przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Jednak ze względu na ich bardzo niską zawartość w roślinach^11,12,13, koszt produkcji większości flawonoli pozostaje wysoki, co nakłada duże ograniczenia na ich zastosowanie w służbie zdrowia i przemyśle spożywczym.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci naukowcy opracowali wiele metod pozyskiwania flawonoidów^14,15. Jednak synteza chemiczna tych skomplikowanych cząsteczek ma wiele wewnętrznych wad¹⁶. Wymaga to nie tylko toksycznych odczynników i ekstremalnych warunków reakcji, ale także wielu kroków do wytworzenia docelowego związku flawonoidowego^14,17. Co więcej, kolejnym ważnym wyzwaniem w tej strategii jest chiralna synteza aktywnych cząsteczek flawonoidów. W związku z tym nie jest to idealna strategia produkcji flawonoidów na skalę komercyjną poprzez syntezę chemiczną^16,17.

Ostatnio naukowcy opracowali obiecującą alternatywną strategię wytwarzania tych skomplikowanych naturalnych związków poprzez inżynierię mikrobów ze ścieżką biosyntezy flawonoidów^{18,19,20,21,22}, która została pomyślnie rozszyfrowana w roślinach²³. Na przykład Duan i wsp. wprowadzili szlak biosyntezy do pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu produkcji kemferolu (KMF)²⁴. Malla i wsp. wyprodukowali astragalinę, glikozylowany flawonol, wprowadzając3-hydroksylazę flawanonu (f3h), syntazę flawonolu (fls1) i UDP-glukozę: 3-O-glukozylotransferazę flawonoidową UGT78K1 do Escherichia coliBL21(DE3)¹⁷. Mimo że istnieje wiele paradygmatów, nie wszystkie genetycznie modyfikowane mikroorganizmy wytwarzają interesujące je produkty ze względu na złożoność platformy komórkowej, niezgodność między sztucznie zsyntetyzowanymi elementami genetycznymi a gospodarzami, hamujący wpływ produktów docelowych na komórki gospodarza oraz niestabilność samego zmodyfikowanego systemu komórkowego¹⁶.

Inną obiecującą alternatywną strategią produkcji flawonoidów jest ustanowienie kaskady multienzymatycznej in vitro. Cheng i wsp. stwierdzili, że poliketydy enterocyny mogą być z powodzeniem syntetyzowane poprzez złożenie kompletnego szlaku enzymatycznego w jednym garnku²⁵. Ta bezkomórkowa strategia syntezy omija ograniczenia fabryki produkcji mikroorganizmów, a zatem jest możliwa do produkcji niektórych flawonoidów w dużych ilościach¹⁶.

Ostatnio udało nam się opracować system syntezy bienzymów do przekształcania naringeniny (NRN) w KMF w jednym garnku¹⁶. Tutaj bardzo szczegółowo opisujemy ten system i metody związane z analizą produktów. Przedstawiamy również dwa przykłady, które wykorzystują ten system do produkcji KMF z KSOW i kwercetyny (QRC) z eriodictyolu (ERD). Ponadto omówiono kluczowe etapy tej metody i przyszłe kierunki badań w biosyntezie flawonoidów.

Protokół

1. Wyizoluj całkowite RNA z tkanek roślinnych^26,27

1. Homogenizuj tkanki roślinne.
   1. Zbierz 100 mg świeżej tkanki roślinnej (np. 4-tygodniowych siewek rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana). Zamroź tkankę, tłuczek i moździerz ciekłym azotem, a następnie zmiel tkankę na proszek.
   2. Dodać 1 ml odczynnika izolującego RNA (patrz tabela materiałów) do zaprawy. Odczynnik zostanie natychmiast zamrożony. Homogenizować próbkę tkanki za pomocą tłuczka, gdy zamrożony odczynnik się stopi.
   3. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować próbkę o sile 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść oczyszczony roztwór homogenatu do innej świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
   4. Inkubować homogenizowaną próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
2. Wyizoluj całkowite RNA.
   1. Dodać 0,2 ml chloroformu do homogenatu, szczelnie zamknąć probówkę, energicznie potrząsać probówką ręcznie przez 15 s i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przenieść bezbarwną górną fazę wodną do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Po odwirowaniu próbka rozdziela się na trzy fazy.
   3. Dodać 0,5 ml alkoholu izopropylowego do fazy wodnej, energicznie wstrząsnąć probówką ręcznie i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   4. Odwirować mieszaninę w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
   5. Przepłukać osad RNA raz 1 ml 75% etanolu przez wirowanie, a następnie odwirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Powtórz krok 1.2.5.
   7. Suszyć granulki na powietrzu przez 5-10 minut i ponownie rozpuścić RNA w wodzie uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC), pipetując w górę iw dół, a następnie mierząc całkowite stężenie RNA za pomocą mikrospektrofotometru (patrz Tabela materiałów).

2. Syntetyzuj komplementarne DNA (cDNA)²⁸

1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA za pomocą zestawu (patrz Tabela materiałów). Ustawić system reakcyjny o pojemności 20 μl, jak pokazano w tabeli 1, i inkubować probówkę reakcyjną w przyrządzie do PCR przez 50 minut w temperaturze 42 °C, a następnie zakończyć reakcję w temperaturze 85 °C na 5 minut. Produkt reakcji należy przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłej amplifikacji genów.

Odczynniki	głośność
dNTP Mix, 2,5 mM każdy	4,0 μl
Mieszanka podkładowa	2,0 μL
Szablon RNA	1,0 μg
Bufor odwrotnej transkryptazy, 5×	4,0 μl
Odwrotna transkryptaza, 200 U/μL	1,0 μl
Nie zawiera RNaz H2O	do 20,0 μL

Tabela 1: Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA do cDNA

3. Konstruowanie rekombinowanych plazmidów²⁹

1. Zaprojektuj startery PCR.
   1. Zaprojektuj startery PCR za pomocą oprogramowania (patrz Tabela materiałów) w oparciu o sekwencje kluczowych genów enzymatycznych uzyskanych z bazy danych GenBank i zsyntetyzuj startery przez firmę (patrz Tabela materiałów). Na końcu 5' startera dodaj miejsce enzymu restrykcyjnego (np. BamHI lub EcoRI w tym protokole).
      UWAGA: Startery użyte w tym badaniu przedstawiono w Tabeli 2.

Sekwencja, 5' → 3'	cel
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACT	Starter do przodu do amplifikacji PCR genu Atf3h z Arabidopsis thaliana. Miejsce BamHI jest pisane kursywą i dołączone do klonowania do pET32a(+).
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA	Odwrotny starter do amplifikacji PCR genu Atf3h z A. thaliana. Miejsce EcoRI jest kursywą i dołączone do klonowania do pET32a(+).
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA	Starter do przodu do amplifikacji PCR genu Atfls1 z A. thaliana. Miejsce BamHI jest pisane kursywą i dołączone do klonowania do pET32a(+).
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT	Odwrotny starter do amplifikacji PCR genu Atfls1 z A. thaliana. Miejsce EcoRI jest kursywą i dołączone do klonowania do pET32a(+).

Tabela 2: Startery oligonukleotydowe użyte w obecnym badaniu

2. Sklonuj geny do prokariotycznego wektora ekspresji.
   1. Amplifikuj geny z pierwszej nici zsyntetyzowanego cDNA za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności (patrz tabela materiałów). Ustawić system reakcji PCR o pojemności 100 μl, jak pokazano w tabeli 3, i uruchomić następujący cykl PCR: 94 °C przez 2 minuty w celu wstępnej denaturacji; następnie 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s w przypadku denaturacji, 55 °C przez 2 minuty w przypadku wyżarzania i 72 °C przez 1 minutę w przypadku przedłużenia; następnie końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury 12 °C.
      UWAGA: Czas wydłużenia jest zmienny i zależy od długości genu z polimeryzacją około 1000 zasad na minutę dla większości polimeraz DNA.
   2. Wizualizuj produkty PCR (najczęściej 5 μl) na 1% żelu agarozowym i oczyść określony fragment DNA z pozostałych produktów za pomocą zestawu do czyszczenia DNA (patrz tabela materiałów).
   3. Strawić oczyszczony fragment DNA i wektor (np. pET-32a(+)) za pomocą enzymów restrykcyjnych (np. BamHI lub EcoRI w tym protokole). Ustawić system reakcyjny o pojemności 50 μl w probówce do PCR o pojemności 0,2 ml, jak pokazano w tabeli 4, i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Oddziel strawione DNA na 1% żelu agarozowym.
   4. Odzyskaj pasmo DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz tabela materiałów). Dalsze oczyszczanie DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (patrz Tabela materiałów), a następnie pomiar stężenia DNA za pomocą mikrospektrofotometru (patrz Tabela materiałów).
   5. Zliguj fragment genu do zlinearyzowanego wektorowego DNA za pomocą ligazy DNA T4 (patrz tabela materiałów). Ustawić reakcję ligacji w probówce o pojemności 1,5 ml, jak pokazano w tabeli 5, i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny
      UWAGA: Stosunek molowy wkładki do wektora jest zmienny i mieści się w zakresie od 3:1 do 10:1.
   6. Dodać 2,5 μl mieszaniny ligacji do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli (np. TOP10 lub DH5α), delikatnie wymieszać i trzymać probówkę na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 90 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 2 minuty.
   7. Dodać do probówki 200 μl płynnej pożywki LB bez antybiotyków i inkubować probówkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez 1 godzinę. Rozprowadzić 50-100 μl komórek na płytce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

Odczynniki	głośność
Pfu Master Mix, 2×	50,0 μL
Podkład do przodu, 10 μM	4,0 μl
Podkład odwrotny, 10 μM	4,0 μl
Zawartość cDNA	2,0 μL
H2O	40,0 μL

Tabela 3: Konfiguracja systemu reakcji PCR

Odczynniki	głośność
Fragment DNA/wektor	3,0 μg
BamHI	1,0 μl
EkologicznyRI	1,0 μl
Bufor Cutsmart, 10×	5,0 μl
H2O	do 50,0 μL

Tabela 4: Podwójne trawienie fragmentu/wektora DNA

Odczynniki	głośność
wstawiać	X μL (0,09 pmol)
wektor	Y μL (0,03 pmol)
Bufor podwiązania, 10×	1,0 μl
Ligaza DNA T4, 400 U/μL	1,0 μl
H2O	do 10,0 μL

Tabela 5: Ligacja fragmentu genu do wektora linearyzowanego

3. Przesiewowe kolonie dodatnie.
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki LB w 200 μl płynnej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C, 250 obr./min przez 2 - 3 h.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wybierz od 4 do 8 kolonii do badania przesiewowego kolonii z wynikiem pozytywnym.
   2. Ustaw 10-μl reakcji PCR kolonii podobnej do tej w kroku 3.2.1.
      UWAGA: Użyj 1 μl kultury LB zamiast 1 μl matrycy cDNA.
   3. Wizualizuj produkty PCR na 1% żelu agarozowym. Pozostałą kulturę zaszczepić z wynikiem dodatnim w 3 ml płynnej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy 250 obr./min przez 14-16 godzin.
   4. Wyizolować plazmidowe DNA z rekombinowanych kultur E. coli za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (patrz tabela materiałów).
   5. Zidentyfikuj oczyszczone rekombinowane plazmidy za pomocą analizy enzymów podwójnej restrykcji (np. BamHI i EcoRI w tym protokole). Ustawić 10-μl system reakcji podobny do tego opisanego w kroku 3.2.3, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Wizualizuj specyficzne pasmo uwolnione z rekombinowanego plazmidu na 1% żelu agarozowym.
4. Sprawdź sekwencje dodatnich rekombinowanych plazmidów.
   1. Wyślij plazmidy do firmy w celu sekwencjonowania. Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji DNA (patrz tabela materiałów), porównując sekwencję uzyskaną od firmy sekwencjonującej z sekwencją referencyjną uzyskaną z bazy danych GenBank.

4. Ekspresja rekombinowanych białek enzymatycznych ³⁰

1. Przekształć prawidłowy rekombinowany plazmid w kompetentną E. coli BL21(DE3).
   1. Dodaj 0,1 μl plazmidu do 10 μl kompetentnego E. coli BL21(DE3) w 1,5 ml probówki na lodzie i trzymaj probówkę na lodzie przez 5 minut.
   2. Szok termiczny komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 90 s i ponownie umieścić na lodzie na 2 minuty.
   3. Dodać 200 μl płynnej pożywki LB bez antybiotyków i inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez 5 min.
   4. Rozprowadzić 50 μl przemiany na płytce agarowej LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować płytkę przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
2. Indukuj ekspresję genów.
   1. Zaszczepić 3 - 5 kolonii z płytki do probówki zawierającej 3 ml płynnego podłoża LB ze 100 μg/ml ampicyliny i inkubować z prędkością 250 obr./min w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez noc.
   2. Przenieść całą nocną kulturę do 300 ml płynnego podłoża LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować z prędkością 250 obr./min w wytrząsarce o temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna kultury przy 600 nm wyniesie 0,4 - 0,6.
   3. Dodać do hodowli izopropylo β-D-tiogalaktozyd (IPTG) o końcowym stężeniu 0,2 mM i indukować ekspresję genów przy 250 obr./min, 20–22 °C przez 3 godziny.

5. Oczyszczanie białek enzymatycznych rekombinowanych³¹

1. Zebrać bakterie przez odwirowanie kultury w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 minut.
2. Zawiesić osad w 15 ml bakteryjnego buforu do lizy zawierającego 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerolu, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml leupeptyny i 1 μg/ml pepstatyny w 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
3. Sonikować zawiesinę bakteryjną w celu uwolnienia rekombinowanych białek enzymatycznych, a następnie odwirować w temperaturze 13 000 x g, 4 °C przez 10 minut.
4. Zebrać i podzielić na porcje supernatant w probówkach o pojemności 1,5 ml w stężeniu 1 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -70 °C do wykorzystania w przyszłości.
5. Nanieść 500 μl żywicy oczyszczającej His-tag (patrz tabela materiałów) na pustą kolumnę powinowactwa wielokrotnego użytku. Przemyć żywicę 5 objętościami złoża wody dejonizowanej, aby wyrzucić etanol z roztworu podstawowego. Zrównoważyć żywicę z 10 objętościami złoża buforu wiążącego składającego się z Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazolu (10 mM) i NaCl (0,5 M).
6. Nanieść 4 ml supernatantu z kroku 5.4 na zawiesinę powyższej żywicy i zatkać dwa końce kolumny korkami.
7. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C na rotatorze z niską prędkością przez 2 godziny.
8. Przepłukać żywicę związaną z białkiem fuzyjnym 15 objętościami złoża buforu wiążącego w temperaturze 4 °C przy natężeniu przepływu 1 ml/min przed elucją.
9. Dodać 500 μl buforu elucyjnego (zawierającego 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM imidazolu, 0,5 M NaCl) do kolumny i inkubować zawiesinę w temperaturze 4 °C na rotatorze z małą prędkością przez 10 min. Zebrać eluent w postaci oczyszczonych próbek białka.
10. Powtórz krok 5.5 jeszcze cztery razy.
11. Żywicę należy przemyć sekwencyjnie 10 objętościami złoża wody dejonizowanej i 3 objętościami złoża 20% etanolu. Namocz żywicę w 20% etanolu. Zablokować kolumnę korkami i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
12. Zmierzyć stężenie oczyszczonych białek za pomocą testu białek Bradforda. Określ czystość białek na 10% żelu SDS-PAGE i zwizualizuj prążki za pomocą testu barwienia na niebiesko Coomassie.
13. Dodać glicerol do oczyszczonego roztworu białka do końcowego stężenia 10%, aby ustabilizować aktywność enzymu. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Wyprodukuj flawonol z flawanonu w systemie syntezy bienzymów in vitro¹⁶

1. Przygotuj.
   1. Zrób 2x bufor syntetyczny bez siarczanu żelazawego składający się z 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM kwasu α-ketoglutarowego, 0,8% askorbinianu sodu i 20% glicerolu. Rozpuść 1,938 g zasady Tris, 0,640 g askorbinianu sodu, 0,250 g kwasu α-ketoglutarowego i 16 ml glicerolu w 64 ml wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą kwasu solnego (HCl) i dodaj wodę dejonizowaną do 80 ml. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
   2. Przygotuj 100-krotny roztwór podstawowy 2 mM siarczanu żelazawego. Rozpuść 55,6 mg siedmiowodnego siarczanu żelazawego w 50 ml wody dejonizowanej, wymieszaj i dodaj wodę do 100 ml.
   3. Przygotować roztwór podstawowy 25 mM flawonoidu. Dokładnie rozpuść flawonoid w metanolu i przechowuj w temperaturze -20 ° C.
2. Stwórz system syntetyczny do produkcji flawonolu z flawanonu.
   1. Przygotować system syntetyczny, jak pokazano w tabeli 6.
   2. Inkubować reakcję w temperaturze 40 °C w otwartej probówce o pojemności 2,0 ml z prędkością 600 obr./min (w bloku grzewczym z wytrząsaniem) przez 40 minut.
   3. Zakończyć reakcję przez dodanie 10 μl kwasu octowego i 100 μl octanu etylu.
   4. Dwie godziny później przenieś fazy organiczne do probówek o pojemności 1,5 ml w celu wysuszenia na powietrzu w okapie w temperaturze pokojowej.

Odczynniki	głośność
2× Bufor syntetyczny bez siarczanu żelazawego	50,0 μL
25 mM flawonol	2,0 μL
2 mM siarczan żelazawy	0,5 μL
1 mg/ml AtF3H	2,5 μl
1 mg/ml AtFLS1	2,5 μl
25 mM flawanonu	2,0 μL
H2O	do 100,0 μL

Tabela 6: Syntetyczny system używany w tym protokole.

7. Analizuj produkty reakcji

1. Analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC).
   1. Zebrać 5 probówek z próbkami flawonoidów z kroku 6.2.4 i wyjąć 300 μl do suszenia na powietrzu. Ponownie rozpuść flawonoid w proszku w 160 μl metanolu. Przygotować autentyczne próbki flawonoidów o seryjnych stężeniach 12,5, 25, 50, 100 i 200 ng/μl w metanolu. Załadować 1 μl próbek reakcyjnych i autentycznych próbek flawonoidów na płytki z poliamidu 6.
   2. Płytki z próbką należy umieścić w układzie rozpuszczalnikowym składającym się z chloroformu/metanolu/octanu etylu/kwasu mrówkowego w stosunku 5,0:1,5:1,0:0,5.
   3. Wysuszyć talerze na powietrzu w temperaturze pokojowej. Spryskaj płytki 1% etanolowym roztworem chlorku glinu (AlCl₃), a następnie ponownie wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.
   4. Trzydzieści minut później wizualizuj plamy na płytkach pod światłem UV o długości fali 254 nm i rób zdjęcia.
   5. Przeanalizuj wartość szarości każdego punktu na obrazach za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. ImageJ v1.51j8 w tym protokole).
      1. Otwórz oprogramowanie ImageJ. Kliknij przycisk Plik > Otwórz, aby otworzyć obraz do analizy.
      2. Kliknij skrajne lewe narzędzie wyboru r ektualnego w interfejsie użytkownika ImageJ. Obrysuj obszar zainteresowania (ROI) na obrazie za pomocą myszy i naciśnij , aby oznaczyć pierwszy ROI.
      3. Przesuń prostokątne zaznaczenie myszą w prawo do następnego ROI i naciśnij , aby oznaczyć drugi ROI.
      4. Powtórz poprzedni krok, aby oznaczyć etykietą wszystkie inne ROI.
      5. Naciśnij , aby wygenerować wykresy profilu dla wszystkich ROI w wyskakującym okienku.
         UWAGA: W tym momencie narzędzie Zaznaczanie linii prostych w interfejsie użytkownika ImageJ zostanie automatycznie aktywowane.
      Użyj
      6. narzędzia Zaznaczanie linii prostych, aby narysować linie bazowe, tak aby zdefiniować zamknięty obszar dla każdego interesującego szczytu.
      7. Aktywuj narzędzie różdżki, klikając odpowiednią ikonę w interfejsie użytkownika ImageJ. Kliknij wewnątrz szczytu, aby wyświetlić wyniki dla wszystkich szczytów w wyskakującym okienku.
   6. Sporządzić krzywą wzorcową autentycznego flawonoidu na podstawie TLC, wykreślając wartości szarości z kroku 7.1.5.7 w stosunku do odpowiadających im stężeń flawonoidów z kroku 7.1.1. Następnie oblicz wydajność flawonoidu będącego przedmiotem zainteresowania wyprodukowanego w tym protokole zgodnie z otrzymanym wzorem.
2. Analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (LC/MS)
   1. Próbki z kroku 7.1.1 należy przetwarzać sekwencyjnie przez filtry 0,45 μm i 0,22 μm.
   2. Załadować próbki do systemu HPLC/LC/MS (patrz tabela materiałów) i rozdzielić próbki w temperaturze 30 °C za pomocą kolumny C18 (4,6 × 150 mm; średnica wewnętrzna 5 μm). Eluować kolumnę w tempie 1,0 ml/min przez gradient 10 - 85% (v/v) acetonitrylu (ACN) w wodzie (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min, 10% ACN) i monitorować absorpcję eluatu od 200 do 800 nm. Przeprowadzić analizę LC/MS w trybie jonów ujemnych przy przepływie azotu suszącego 10 l/min w temperaturze 300 °C i przepływie gazu w osłonie 7 l/min w temperaturze 250 °C i zebrać dane za pomocą wbudowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów).
   3. Wyodrębnić chromatografy o pojedynczej długości fali w celu obliczenia powierzchni pików próbek reakcyjnych i autentycznych związków flawonoidowych za pomocą oprogramowania (patrz tabela materiałów).
      1. Otwórz program Analiza jakościowa i kliknij przycisk Plik, > Otwórz plik danych. Wybierz plik(i) do analizy w oknie Otwórz plik danych i kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć plik(i).
      2. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie Chromatogram Results, a następnie hromatogramy Extract C w menu podręcznym.
      3. Otwórz okno dialogowe Extract Chromatograms. Na liście Type (Typ) kliknij pozycję Other Chromatograms (Inne chromatogramy). W polu kombi Detektor wybierz pozycję DAD1. Następnie kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki HPLC w oknie Wyniki hromatogramu C.
      4. Kliknij ikonę M rocznej integracji zadokowaną w górnej części okna Wyniki hromatogramu C. Narysuj linię bazową dla wartości szczytowej wymaganej do ręcznej analizy integracji za pomocą myszy.
      5. Kliknij przycisk Wyświetl > Listę szczytów integracji, aby wyświetlić wyniki.
   4. Sporządzić krzywą wzorcową autentycznego flawonoidu na podstawie HPLC, wykreślając obszary pików z kroku 7.2.3.5 w stosunku do odpowiadających im stężeń flawonoidów z kroku 7.2.1. Następnie oblicz wydajność flawonoidu będącego przedmiotem zainteresowania wyprodukowanego w tym protokole zgodnie z otrzymanym wzorem.
   5. Przeanalizuj dane MS pod kątem dokładnej masy związków flawonoidowych za pomocą oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
      1. Powtórz kroki 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
      2. Kliknij ikonę Wybór zakresu na pasku narzędzi Wyniki hromatogramu C.
      3. Wybierz szczyt zainteresowania. Kliknij prawym przyciskiem myszy zaznaczony zakres i kliknij opcję Wyodrębnij widmo MS w menu podręcznym, aby wyświetlić wyniki w oknie Wyniki widma MS
      .

Wyniki

F3H i FLS1 to dwa ważne kluczowe enzymy w przemianie flawanonu we flawonol w roślinach, jak pokazano w Rysunek 1. Opracowanie systemu biosyntezy in vitro do produkcji flawonolu z flawanonu, Atf3h (nr dostępu GenBank. NM_114983.3) i Atfls1 (nr dostępu do GenBanku. Geny NM_120951.3) sklonowano z siewek 4-tygodniowego A. thaliana do prokariotycznego wektora ekspresyjnego pET-32a(+). Rekombinowane plazmidy przekształcono w E. coli

Dyskusja

Sporo badań koncentruje się na pochodnym flawonoli ze względu na ich potencjalne zastosowanie w ochronie zdrowia i przemyśle spożywczym. Jednak tradycyjna ekstrakcja roślin przy użyciu rozpuszczalników organicznych i synteza chemiczna mają nieodłączne wady, które ograniczają ich zastosowanie w produkcji flawonoli. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę wytwarzania flawonolu z flawanonu w jednym doniczce poprzez ustanowienie bienzymatycznej kaskady in vitro. Kluczowymi etapami tego protokołu są: 1) otrzymanie czys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 razy; Pfu MasterMix	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW0717A	amplifikację genów metodą PCR z wysoką wiernością
System Agilent 1200 Series RRLC z systemem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS	Agilent Technologies, Inc	N/A	urządzenie do analizy flawonoidów metodą HPLC/MS
Stacja robocza Agilent MassHunter (wersja B.03.01)	Agilent Technologies, Inc	N/A	oprogramowanie do zbierania danych z systemu Agilent 1200 Series RRLC z systemem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS
dihydrokaemferol	Sigma-Aldrich Co. LLC	91216	produkt pośredni do wytwarzania kemferolu z naringeniny
dihydrokwercetyny	Syczuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine	PCS0371	produkt pośredni do produkcji kwercetyny z eriodictyolu
Zestaw do czyszczenia DNA	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW2301	oczyszczanie eriodictyolu DNA amplifikowanego PCR lub oczyszczonego żelem
	Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.	B21160	substrat do produkcji kwercetyny
Escherichia coli BL21(DE3)	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW0809	szczep bakterii do ekspresji docelowych genów
Escherichia coli DH5α	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW0808	szczep bakterii do proliferacji plazmidu
FreeZone 1 litrowy laboratoryjny system liofilizacji	Labconco Corporation	7740020	urządzenie do liofilizacji flawonoidów rozpuszczonych w rozpuszczalniku organicznym Zestaw do ekstrakcji
żelu	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW2302	oczyszczanie pasma DNA z żelu agarozowego
System	obrazowania żeluNauka i nauka o tanonie w Szanghaju Technologia Co., Sp. z o.o.	Tanon- 2500	urządzenie do wizualizacji pasma DNA na żelu agarozowym lub plamce flawonoidowej na płytce poliamidowej TLC
GenElute Plasmid Miniprep Kit	Sigma-Aldrich Co., LLC	PLN350-1KT	minipreparat plazmidów
kemferol	Sigma-Aldrich Co., LLC	60010	produkt końcowej reakcji i substancja wzorcowa
Analiza Quanlitative MassHunter (wersja B.01.04)	Agilent Technologies, Inc	N/A	oprogramowanie do analizy danych HPLC/LC/MS NanoDrop
Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-8000-GL	urządzenie do oznaczania stężenia DNA/RNA
naringenina	Sigma-Aldrich Co. LLC	N5893	Podłoże do produkcji kemferolu
Ni-IDA Żywica agarozowa	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW0010	oczyszczanie białek fuzyjnych znakowanych His
plazmid pET-32a(+)	Novagen	69015-3	do klonowania i ekspresji genów docelowych,
sekwencjonowanie plazmidów,	GENEWIZ Suzhou	nie dotyczy	sekwencjonowanie rekombinowanych plazmidów,
synteza starterów	GENEWIZ Suzhou	N/A	, synteza starterów PCR
kwercetyna	, Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	Q111273	końcowy produkt reakcji i substancja wzorcowa
Zestaw do syntezy cDNA SuperRT	Beijing CoWin Biotech Co., Ltd	CW0741	synteza pierwszej nici cDNA z całkowitej
ligazy DNA RNA T4	Ligaza Thermo Fisher Scientific	EL0016	ligacja insertu do zlinearyzowanego wektora DNA
Trizol	Thermo Fisher Naukowa	izolacja całkowitego RNA	15596018
Vector NTI Advance	Thermo Fisher Scientific	12605099	oprogramowanie do projektowania starterów PCR i analizy sekwencji DNA
Xcalibur v2.0.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	oprogramowanie do analizy danych HPLC