Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59336

⸱

14 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China, Yangzhou University, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety, Yangzhou University, 4Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 5The Testing Center, Yangzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

Pochodzenie flawonolu jest kluczowe dla jego zastosowania w opiece zdrowotnej i przemyśle spożywczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół biosyntezy flawonolu z flawanonu i omawiamy kluczowe etapy i jego zalety w porównaniu z innymi podejściami.

Streszczenie

Flawonole to główna podklasa flawonoidów o różnorodnych działaniach biologicznych i farmakologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę enzymatycznej syntezy flawonolu in vitro. W tej metodzie Atf3h i Atfls1, dwa kluczowe geny w szlaku biosyntezy flawonoli, są klonowane i nadmiernie eksprymowane w Escherichia coli. Rekombinowane enzymy są oczyszczane przez kolumnę powinowactwa, a następnie w określonym buforze syntetycznym tworzy się kaskada bienzymatyczna. Dwa flawonole są syntetyzowane w tym systemie jako przykłady i oznaczane za pomocą analiz TLC i HPLC/LC/MS. Metoda ta wykazuje oczywistą przewagę w otrzymywaniu flawonoli w porównaniu z innymi podejściami. Oszczędza czas i pracę oraz jest wysoce opłacalny. Reakcja jest łatwa do dokładnego kontrolowania, a tym samym skalowania do masowej produkcji. Docelowy produkt można łatwo oczyścić dzięki prostym komponentom systemu. Jednak system ten jest zwykle ograniczony do produkcji flawonolu z flawanonu.

Wprowadzenie

Flawonole są główną podklasą flawonoidów roślinnych i biorą udział w rozwoju i pigmentacji roślin1,2,3. Co ważniejsze, związki te mają szeroki zakres korzystnych dla zdrowia działań, takich jak przeciwnowotworowe4,5, przeciwutleniające6, przeciwzapalne7, przeciwotyłość8, przeciwnadciśnieniowe9 i właściwości przywoływania pamięci10, co doprowadziło do przeprowadzenia wielu badań nad tymi metabolitami wtórnymi pochodzenia roślinnego. Tradycyjnie związki te pochodzą głównie z ekstrakcji roślinnej przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Jednak ze względu na ich bardzo niską zawartość w roślinach11,12,13, koszt produkcji większości flawonoli pozostaje wysoki, co nakłada duże ograniczenia na ich zastosowanie w służbie zdrowia i przemyśle spożywczym.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci naukowcy opracowali wiele metod pozyskiwania flawonoidów14,15. Jednak synteza chemiczna tych skomplikowanych cząsteczek ma wiele wewnętrznych wad16. Wymaga to nie tylko toksycznych odczynników i ekstremalnych warunków reakcji, ale także wielu kroków do wytworzenia docelowego związku flawonoidowego14,17. Co więcej, kolejnym ważnym wyzwaniem w tej strategii jest chiralna synteza aktywnych cząsteczek flawonoidów. W związku z tym nie jest to idealna strategia produkcji flawonoidów na skalę komercyjną poprzez syntezę chemiczną16,17.

Ostatnio naukowcy opracowali obiecującą alternatywną strategię wytwarzania tych skomplikowanych naturalnych związków poprzez inżynierię mikrobów ze ścieżką biosyntezy flawonoidów18,19,20,21,22, która została pomyślnie rozszyfrowana w roślinach23. Na przykład Duan i wsp. wprowadzili szlak biosyntezy do pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu produkcji kemferolu (KMF)24. Malla i wsp. wyprodukowali astragalinę, glikozylowany flawonol, wprowadzając3-hydroksylazę flawanonu (f3h), syntazę flawonolu (fls1) i UDP-glukozę: 3-O-glukozylotransferazę flawonoidową UGT78K1 do Escherichia coliBL21(DE3)17. Mimo że istnieje wiele paradygmatów, nie wszystkie genetycznie modyfikowane mikroorganizmy wytwarzają interesujące je produkty ze względu na złożoność platformy komórkowej, niezgodność między sztucznie zsyntetyzowanymi elementami genetycznymi a gospodarzami, hamujący wpływ produktów docelowych na komórki gospodarza oraz niestabilność samego zmodyfikowanego systemu komórkowego16.

Inną obiecującą alternatywną strategią produkcji flawonoidów jest ustanowienie kaskady multienzymatycznej in vitro. Cheng i wsp. stwierdzili, że poliketydy enterocyny mogą być z powodzeniem syntetyzowane poprzez złożenie kompletnego szlaku enzymatycznego w jednym garnku25. Ta bezkomórkowa strategia syntezy omija ograniczenia fabryki produkcji mikroorganizmów, a zatem jest możliwa do produkcji niektórych flawonoidów w dużych ilościach16.

Ostatnio udało nam się opracować system syntezy bienzymów do przekształcania naringeniny (NRN) w KMF w jednym garnku16. Tutaj bardzo szczegółowo opisujemy ten system i metody związane z analizą produktów. Przedstawiamy również dwa przykłady, które wykorzystują ten system do produkcji KMF z KSOW i kwercetyny (QRC) z eriodictyolu (ERD). Ponadto omówiono kluczowe etapy tej metody i przyszłe kierunki badań w biosyntezie flawonoidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wyizoluj całkowity RNA z tkanek roślinnych26,27

  1. Homogenizuj tkanki roślinne.
    1. Zebranie 100 mg świeżej tkanki roślinnej (np. 4-tygodniowych sadzonek Arabidopsis thaliana). Zamroź tkankę oraz moździerz i pistle ciekłym azotem, a następnie zmiel ją na proszek.
    2. Dodaj 1 mL odczynnika do izolacji RNA (zobacz Tabelę materiałów) do moździerza. Odczynnik natychmiast zamrozi się. Homogenizuj próbkę tkanki pistlem w miarę topnienia zamarzniętego odczynnika.
    3. Przenieś homogenat do probówki o pojemności 1,5 mL, odwirowując próbkę przy 12 000 × g przez 5 min przy 4 °C, a następnie przenieś klarowny roztwór homogenatu do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 mL.
    4. Incynuj zhomogenizowaną próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  2. Wyizoluj całkowity RNA.
    1. Dodaj 0,2 mL chloroformu do homogenatu, dobrze zamknij probówkę, wstrząsaj intensywnie ręką przez 15 s i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    2. Odwirowuj próbkę przy 12 000 × g przez 15 min przy 4 °C i przenieś bezbarwną, górną fazę wodną do świeżej probówki o pojemności 1,5 mL. Po wirowaniu próbka dzieli się na trzy fazy.
    3. Dodaj 0,5 mL alkoholu izopropylowego do fazy wodnej, wstrząsaj probówką ręcznie energicznie i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    4. Odwirowuj mieszaninę przy 12 000 × g przez 10 min przy 4 °C i usuń supernatant.
    5. Przepłucz osad RNA jeden raz 1 mL etanolu 75% poprzez wortexowanie, a następnie wirowanie przy 7 500 × g przez 5 min przy 4 °C.
    6. Powtórz krok 1.2.5.
    7. Osusz osad powietrzem przez 5–10 minut i ponownie rozpuść RNA w wodzie zatężonej dietylopYROwęglanem (DEPC) przez pipetowanie w górę i w dół, a następnie zmierz stężenie całkowitego RNA za pomocą mikrospektrofotometru (zobacz Tabelę materiałów).

2. Synteza DNA komplementarnego (cDNA)28

  1. Synteza pierwszego nici cDNA za pomocą zestawu (zobacz Tabela materiałów). Przygotuj 20-μL mieszaninę reakcyjną, jak pokazano w Tabela 1, i inkubuj probówkę z reakcją w urządzeniu PCR przez 50 min przy 42 °C, a następnie zakończ reakcję przez 5 min przy 85 °C. Przechowuj produkt reakcji w -20 °C w celu późniejszej amplifikacji genów.
OdczynnikiObjętość
dNTP Mix, po 2,5 mM4,0 μL
Mieszanina starterów2,0 μL
Matryca RNA1,0 μg
Bufor odwrotnej transkryptazy, 5×4,0 μL
Odwrotna transkryptaza, 200 U/μL1,0 μL
H2O bez RNazuzupełnić do 20,0 μL

Tabela 1: Transkrypcja odwrotna całkowitego RNA do cDNA

3. Skonstruuj plazmidy rekombinowane29

  1. Zaprojektuj startery PCR.
    1. Zaprojektuj startery PCR za pomocą oprogramowania (zobacz Tabela materiałów) na podstawie sekwencji genów kluczowych enzymów uzyskanych z bazy danych GenBank i zsyntetyzuj startery w firmie (zobacz Tabela materiałów). Na końcu 5’ startera dodaj miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego (np. BamHI lub EcoRI w tym protokole).
      UWAGA: Startery użyte w tym badaniu przedstawiono w Tabela 2.
Sekwencja, 5' → 3'Cel
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACTPierwszy starter do amplifikacji PCR Atf3h gen z Arabidopsis thaliana BamMiejsce HI jest kursywą i dołączono je w celu klonowania do wektora pET32a(+).
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGAOdwrócony starter do amplifikacji metodą PCR Atf3h gen z A. thaliana EcoMiejsce restrykcyjne RI jest pochylone i dołączono je w celu klonowania do wektora pET32a(+).
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCAPierwotnik w kierunku wstępnym do amplifikacji PCR Atfls1 gen z A. thaliana BamMiejsce HI jest kursywą i dołączono je w celu klonowania do wektora pET32a(+).
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTATOdwrócony starter do amplifikacji metodą PCR Atfls1 gen z A. thaliana EcoMiejsce restrykcyjne RI jest pochylone i dołączono je w celu klonowania do wektora pET32a(+).

Tabela 2: Startery oligonukleotydowe wykorzystane w obecnym badaniu

  1. Klonuj geny do wektora ekspresyjnego prokariotycznego.
    1. Uzyskaj amplifikację genów z pierwszego łańcucha zsyntezowanego kwasu cDNA przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (zobacz Tabelę materiałów). Przygotuj 100-μL mieszaninę reakcyjną PCR zgodnie z opisem w Tabeli 3 i przeprowadź następujący cykl PCR: 94 °C przez 2 min dla wstępnego denaturowania; następnie 35 cykli: 94 °C przez 30 s – denaturowanie, 55 °C przez 2 min – annealing, 72 °C przez 1 min – elongacja; na końcu końcowe przedłużenie w 72 °C przez 10 min. Ochłódź mieszaninę reakcyjną do 12 °C.
      UWAGA: Czas elongacji jest zmienny i zależy od długości genu – dla większości polimeraz DNA wynosi około 1000 nukleotydów na minutę.
    2. Wizualizuj produkty PCR (najczęściej 5 μL) w żelu agarozowym 1% i wyizoluj docelowy fragment DNA z pozostałych produktów za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (zobacz Tabelę materiałów).
    3. Przeprowadź cięcie oczyszczonego fragmentu DNA oraz wektora (np. pET-32a(+)) enzymami restrykcyjnymi (np. BamHI lub EcoRI w niniejszym protokole). Przygotuj 50-μL mieszaninę reakcyjną w rurce PCR o pojemności 0,2 mL zgodnie z Tabelą 4 i inkubuj mieszaninę w 37 °C przez 3 h. Rozdziel DNA po cięciu w żelu agarozowym 1%.
    4. Wyizoluj pasmo DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu (zobacz Tabelę materiałów). Dalsze oczyszczenie DNA przeprowadź za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (zobacz Tabelę materiałów), a następnie zmierz stężenie DNA mikrospektrofotometrem (zobacz Tabelę materiałów).
    5. Przeprowadź ligację fragmentu genu do liniowego DNA wektora za pomocą ligazy T4 DNA (zobacz Tabelę materiałów). Przygotuj mieszaninę ligacyjną w rurce 1,5-mL zgodnie z Tabelą 5 i inkubuj rurkę w temperaturze pokojowej przez 2–3 h.
      UWAGA: Stosunek molowy insertu do wektora jest zmienny i zawiera się w przedziale od 3:1 do 10:1.
    6. Dodaj 2,5 μL mieszaniny ligacyjnej do 50 μL chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli (np. TOP10 lub DH5α), delikatnie wymieszaj i umieść rurkę na lodzie na 30 min. Przeprowadź szok cieplny w 42 °C przez 90 s, a następnie natychmiast umieść rurkę na lodzie na 2 min.
    7. Dodaj 200 μL ciekłego pożywki LB bez antybiotyków do rurki i inkubuj ją w 37 °C na wstrząsarce przy 220 rpm przez 1 h. Rozlej 50–100 μL komórek na płytę z pożywką LB zawierającą 100 μg/mL ampicyliny i inkubuj w 37 °C całą noc.
OdczynnikiObjętość
Pfu Master Mix, 2×50.0 μL
Primer w kierunku do przodu, 10 μM4.0 μL
Primer w kierunku odwrotnym, 10 μM4.0 μL
cDNA2.0 μL
H2O40.0 μL

Tabela 3: Przygotowanie systemu reakcji PCR

OdczynnikiObjętość
Fragmet DNA/wektor3,0 μg
BamHI1,0 μL
EcoRI1,0 μL
Bufor Cutsmart, 10×5,0 μL
H2Ouzupełnić do 50,0 μL

Tabela 4: Podwójne cięcie fragmentu DNA/wektora

OdczynnikiObjętość
WstawkaX μL (0.09 pmol)
WektorY μL (0.03 pmol)
Bufor ligacji, 10×1.0 μL
T4 DNA ligaza, 400 U/μL1.0 μL
H2Ouzupełnić do 10,0 μL

Tabela 5: Ligacja fragmentu genu do wektora zlinearizowanego

  1. Wybierz kolonie pozytywne.
    1. Zaszczep pojedynczą kolonię z płytki LB do 200 μL ciekłego ośrodka LB zawierającego 100 μg/mL ampicyliny i inkubuj przez 2–3 h w 37 °C, 250 rpm.
      UWAGA: Ogólnie należy wybrać 4–8 kolonii w celu wykrycia kolonii pozytywnych.
    2. Przygotuj reakcję PCR z kolonią o objętości 10 μL, podobnie jak w kroku 3.2.1.
      UWAGA: Zamiast 1 μL wzmaczania cDNA użyj 1 μL hodowli LB.
    3. Wizualizuj produkty PCR w żelu agarozowym o stężeniu 1%. Zaszczep resztę hodowli, która dała pozytywny wynik, do 3 mL ciekłego ośrodka LB zawierającego 100 μg/mL ampicyliny i inkubuj w shakerze w 37 °C, 250 rpm przez 14–16 h.
    4. Wyizoluj DNA plazmidowe z hodowli rekombinowanego E. coli za pomocą zestawu do miniprep plazmidów (zobacz Tabelę materiałów).
    5. Określ oczyszczone rekombinowane plazmidy za pomocą analizy podwójnym enzymem restrykcyjnym (np. BamHI i EcoRI w tym protokole). Przygotuj układ reakcji o objętości 10 μL, jak w kroku 3.2.3, a następnie inkubuj przez 3 h w 37 °C. Wizualizuj konkretny pasmo uwalniane z rekombinowanego plazmidu w żelu agarozowym o stężeniu 1%.
  2. Sprawdź sekwencje pozytywnych rekombinowanych plazmidów.
    1. Wyślij plazmidy do firmy wykonującej sekwencjonowanie. Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji DNA (zobacz Tabelę materiałów), porównując sekwencję uzyskaną od firmy z sekwencją referencyjną pobraną z bazy danych GenBank.

4. Ekspresja białek enzymatycznych rekombinowanych30

  1. Transformuj odpowiedni rekombinowany plazmid do kompetentnych komórek E. coli BL21(DE3).
    1. Dodaj 0,1 μL plazmidu do 10 μL kompetentnych komórek E. coli BL21(DE3) w probówce o pojemności 1,5 mL umieszczonej na lodzie i pozostaw probówkę na lodzie przez 5 min.
    2. Poddaj komórki szokowi cieplnemu w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 90 s, a następnie ponownie umieść na lodzie przez 2 min.
    3. Dodaj 200 μL płynnego medium LB bez antybiotyków i inkubuj w temperaturze 37 °C na wstrząsarce przy 220 rpm przez 5 min.
    4. Wymieść 50 μL transformacji na płytę agarową LB zawierającą 100 μg/mL ampicyliny i inkubuj płytę całą noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  2. Wywołaj ekspresję genów.
    1. Zaszczep 3–5 kolonii z płyty do probówki zawierającej 3 mL płynnego medium LB z 100 μg/mL ampicyliny i inkubuj przy 250 rpm na wstrząsarce w temperaturze 37 °C całą noc.
    2. Przenieś całą nocną hodowlę do 300 mL płynnego medium LB zawierającego 100 μg/mL ampicyliny i inkubuj przy 250 rpm na wstrząsarce w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia gęstości optycznej hodowli przy długości fali 600 nm w zakresie 0,4–0,6.
    3. Dodaj izopropyl β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do hodowli w końcowym stężeniu 0,2 mM i wywołaj ekspresję genów przy 250 rpm, w temperaturze 20–22 °C przez 3 h.

5. Oczyszczenie białek enzymatycznych rekombinowanych31

  1. Odłóż bakterie przez wirowanie hodowli w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 min.
  2. Wstrząśnij osad w 15 mL buforu do lizy bakterii zawierającego 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerolu, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotyniny, 1 μg/mL leupeptyny i 1 μg/mL pepstatyny w 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
  3. Przeprowadź sonikację zawiesiny bakteryjnej w celu uwolnienia rekombinowanych białek enzymatycznych, a następnie odwiń przez wirowanie w warunkach 13 000 x g, 4 °C przez 10 min.
  4. Zebrany supernatant rozdziel na porcje po 1 mL do probówek o pojemności 1,5 mL i przechowuj w temperaturze -70 °C do późniejszego użycia.
  5. Załaduj 500 μL żywicy do oczyszczania białek z tagiem His (zobacz Tabelę materiałów) na wielokrotnie używaną pustą kolumnę powinowactwa. Przepłucz żywicę 5 objętościami łóżka wody dejonizowanej, aby usunąć etanol z roztworu magazynowego. Zrównoważ żywicę 10 objętościami łóżka buforu wiązania składającego się z Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazolu (10 mM) i NaCl (0,5 M).
  6. Załaduj 4 mL supernatantu z kroku 5.4 na zawiesinę powyższej żywicy i zamknij oba końce kolumny zaślepkami.
  7. Incubuj mieszaninę w 4 °C na mieszadle obrotowym przy niskiej prędkości przez 2 h.
  8. Przepłucz żywicę związaną z białkiem fuzją 15 objętościami łóżka buforu wiązania w temperaturze 4 °C przy prędkości przepływu 1 mL/min przed elucją.
  9. Dodaj 500 μL buforu elucyjnego (zawierającego 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM imidazolu, 0,5 M NaCl) do kolumny i inkubuj zawiesinę w 4 °C na mieszadle obrotowym przy niskiej prędkości przez 10 min. Zebrany eluat stanowi oczyszczone próbki białka.
  10. Powtórz krok 5.5 jeszcze cztery razy.
  11. Przepłucz żywicę kolejno 10 objętościami łóżka wody dejonizowanej oraz 3 objętościami łóżka 20% etanolu. Zanurz żywicę w 20% etanolu. Zamknij kolumnę zaślepkami i przechowuj w 4 °C.
  12. Określ stężenie oczyszczonych białek metodą oznaczania białka wg Bradforda. Oceń czystość białek w 10% żelu SDS-PAGE i uwidocznij pasma metodą barwienia niebieskim kwasem kowalowego.
  13. Dodaj glicerol do roztworu oczyszczonego białka, aby uzyskać końcowe stężenie 10%, w celu stabilizacji aktywności enzymatycznej. Rozdziel na porcje i przechowuj w -80 °C.

6. Otrzymywanie flawonolu z flawanonu w in vitro dwuenzymatycznym systemie syntezy16

  1. Przygotuj bufory.
    1. Przygotuj 2x bufor syntetyczny bez siarczanu żelazowego(II), zawierający 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM kwasu α-ketoglutarynowego, 0,8% octanu sodu i 20% glicerolu. Rozpuść 1,938 g bazy Tris, 0,640 g octanu sodu, 0,250 g kwasu α-ketoglutarynowego oraz 16 mL glicerolu w 64 mL wody dejonizowanej. Dostosuj pH do wartości 7,2 za pomocą kwasu solnego (HCl) i uzupełnij wodę dejonizowaną do objętości 80 mL. Przechowuj bufor w temperaturze 4 °C w celu późniejszego użycia.
    2. Przygotuj 100-krotny roztwór magazynowy o stężeniu 2 mM siarczanu żelazowego(II). Rozpuść 55,6 mg siarczanu żelazowego(II) heptahydratu w 50 mL wody dejonizowanej, wymieszaj i uzupełnij wodą do objętości 100 mL.
    3. Przygotuj roztwór magazynowy o stężeniu 25 mM flawonoidu. Rozpuść flawonoid w metanolu, a następnie przechowuj w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj układ syntetyczny do produkcji flawonolu z flawanonu.
    1. Przygotuj układ syntetyczny zgodnie z Tabelą 6.
    2. Incubuj reakcję w otwartej probówce o pojemności 2,0 mL w temperaturze 40 °C przy szybkości mieszania 600 rpm (w termobloku z mieszadłem) przez 40 minut.
    3. Zakończ reakcję poprzez dodanie 10 μL kwasu octowego i 100 μL octanu etylu.
    4. Dwa godziny później przenieś fazy organiczne do probówek o pojemności 1,5 mL i wysusz je powietrzem w okapie w temperaturze pokojowej.
OdczynnikiObjętość
2× bufor syntetyczny bez siarczanu żelazawego50,0 μL
25 mM flawonol2,0 μL
2 mM siarczan żelazawego0,5 μL
1 mg/mL AtF3H2,5 μL
1 mg/mL AtFLS12,5 μL
25 mM flawanon2,0 μL
H2Ouzupełnić do 100,0 μL

Tabela 6: Układ syntetyczny użyty w tym protokole.

7. Analiza produktów reakcji

  1. Analiza chromatografii cienwarstwowej (TLC).
    1. Zebrac 5 probówek z próbkami flawonoidów z kroku 6.2.4 i odlać 300 μL do wysuszenia na powietrzu. Ponownie rozpuścić proszek flawonoidów w 160 μL metanolu. Przygotować autentyczne próbki flawonoidów o stężeniach 12,5, 25, 50, 100 i 200 ng/μL w metanolu. Nałożyć po 1 μL próbek reakcyjnych oraz autentycznych próbek flawonoidów na płytki poliamidowe 6.
    2. Przeprowadzić rozwinięcie nasyconych próbek na plytkach w układzie rozpuszczalników: chloroform/metanol/octan etylu/kwas mrówkowy w stosunku 5,0:1,5:1,0:0,5.
    3. Wysuszyć płytki w temperaturze pokojowej. Opryskać płytki 1% roztworem chlorku glinu (AlCl3) w etanolu, a następnie ponownie wysuszyć w temperaturze pokojowej.
    4. Trzydzieści minut później, zwizualizować plamki na plytkach w świetle UV o długości fali 254 nm i wykonać zdjęcia.
    5. Przeanalizować wartość szarości każdej plamki na obrazach za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. ImageJ v1.51j8 w niniejszym protokole).
      1. Otworzyć oprogramowanie ImageJ. Kliknąć Plik > Otwórz, aby otworzyć obraz do analizy.
      2. Kliknąć najbardziej po lewej stronie znajdujące się narzędzie Prostokątne narzędzie zaznaczania w interfejsie użytkownika ImageJ. Zaznaczyć interesujący obszar (ROI) za pomocą myszy i nacisnąć Diagram równowagi statycznej z siłami ΣFx=0, MA=0; analiza równowagi; zastosowanie edukacyjne., aby oznaczyć pierwszy ROI.
      3. Przesunąć prostokątne zaznaczenie myszą w prawo do następnego ROI i nacisnąć Opis błędu obserwacyjnego, wykres równowagi statycznej, ΣFx=0, analiza wektorowa, eksperyment., aby oznaczyć drugi ROI.
      4. Powtórzyć poprzedni krok, aby oznaczyć wszystkie pozostałe ROI.
      5. Nacisnąć Diagram dopasowania widmowy z symbolami związanymi z rachunkiem różniczkowym, ilustrujący technikę analizy danych., aby wygenerować wykresy profili wszystkich ROI w oknie podręcznym.
        UWAGA: W tym momencie narzędzie Narzędzie do zaznaczania prostych linii w interfejsie użytkownika ImageJ zostanie automatycznie aktywowane.
      6. Użyć Narzędzia do zaznaczania prostych linii, aby narysować linie bazowe i w ten sposób zdefiniować zamknięte obszary dla każdego interesującego szczytu.
      7. Aktywować Narzędzie pędzel, klikając odpowiednią ikonę w interfejsie użytkownika ImageJ. Kliknąć wewnątrz szczytu, aby wyświetlić wyniki dla wszystkich szczytów w oknie podręcznym.
    6. Utworzyć krzywą wzorcową flawonoidów opartą na TLC, poprzez wykreślenie wartości szarości z kroku 7.1.5.7 względem odpowiednich stężeń flawonoidów z kroku 7.1.1. Następnie obliczyć wydajność interesującego flawonoidu otrzymanego w tym protokole na podstawie uzyskanego wzoru.
  2. Analizy chromatografii cieczowej wysokiej wydajności (HPLC) oraz chromatografii cieczowej/spektrometrii masowej (LC/MS)
    1. Przeprowadzić kolejno oczyszczanie próbek z kroku 7.1.1 przez filtry o wielkości porów 0,45 μm i 0,22 μm.
    2. Nałożyć próbki na system HPLC/LC/MS (zobacz Tabela materiałów) i oddzielić je w temperaturze 30 °C przy użyciu kolumny C18 (4,6 × 150 mm; średnica wewnętrzna, 5 μm). Eluować kolumnę z szybkością 1,0 mL/min za pomocą gradientu 10–85% (v/v) acetonitrylu (ACN) w wodzie (0–10 min, 10–25% ACN; 10–35 min, 25–50% ACN; 35–45 min, 50–85% ACN; 45–50 min, 85–10% ACN; 50–60 min, 10% ACN) i monitorować absorbancję eluatów w zakresie od 200 do 800 nm. Wykonać analizę LC/MS w trybie jonów ujemnych przy przepływie azotu suszącego 10 L/min w temperaturze 300 °C oraz przepływie gazu osłonowego 7 L/min w temperaturze 250 °C, zbierając dane za pomocą wbudowanego oprogramowania (zobacz Tabela materiałów).
    3. Wyodrębnić chromatogramy dla pojedynczej długości fali, aby obliczyć powierzchnie szczytów próbek reakcyjnych i autentycznych związków flawonoidowych za pomocą oprogramowania (zobacz Tabela materiałów).
      1. Otworzyć program Analiza jakościowa i kliknąć Plik > Otwórz plik danych. Wybrać plik(i) do analizy w oknie Otwórz plik danych i kliknąć Otwórz, aby otworzyć plik(i).
      2. Kliknąć prawym przyciskiem myszy w oknie Wyniki chromatogramu, a następnie wybrać Wyodrębnij chromatogramy w menu podręcznym.
      3. Otworzyć okno dialogowe Wyodrębnij chromatogramy. Na liście Typ kliknąć Inne chromatogramy. W polu kombi Detektor wybrać DAD1. Następnie kliknąć OK, aby wyświetlić wyniki HPLC w oknie Wyniki chromatogramu.
      4. Kliknąć ikonę Integracja ręczna umieszczoną u góry okna Wyniki chromatogramu. Narysować linię bazową dla szczytu wymagającego analizy integracji ręcznej za pomocą myszy.
      5. Kliknąć Widok > Lista szczytów integracji, aby wyświetlić wyniki.
    4. Utworzyć krzywą wzorcową flawonoidów opartą na HPLC, poprzez wykreślenie powierzchni szczytów z kroku 7.2.3.5 względem odpowiednich stężeń flawonoidów z kroku 7.2.1. Następnie obliczyć wydajność interesującego flawonoidu otrzymanego w tym protokole na podstawie uzyskanego wzoru.
    5. Przeanalizować dane MS pod kątem dokładnej masy związków flawonoidowych za pomocą oprogramowania (zobacz Tabela materiałów).
      1. Powtórzyć kroki 7.2.3.1 – 7.2.3.3.
      2. Kliknąć ikonę Wybór zakresu na pasku narzędzi Wyniki chromatogramu.
      3. Zaznaczyć interesujący szczyt. Kliknąć prawym przyciskiem myszy w wybranym zakresie i wybrać Wyodrębnij widmo MS w menu podręcznym, aby wyświetlić wyniki w oknie Wyniki widma MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

F3H i FLS1 to dwa ważne kluczowe enzymy w przemianie flawanonu w flawonol u roślin, jak pokazano na Rysunku 1. W celu opracowania in vitro systemu biosyntetycznego do produkcji flawonolu z flawanonu, geny Atf3h (numer dostępu GenBank NM_114983.3) i Atfls1 (numer dostępu GenBank NM_120951.3) zostały sklonowane z siewek 4-tygodniowych roślin A. thaliana do prokariotycznego wektora ekspresyjnego pET-32a(+). Rekombinowane plazmidy wprow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sporo badań koncentruje się na pochodnym flawonoli ze względu na ich potencjalne zastosowanie w ochronie zdrowia i przemyśle spożywczym. Jednak tradycyjna ekstrakcja roślin przy użyciu rozpuszczalników organicznych i synteza chemiczna mają nieodłączne wady, które ograniczają ich zastosowanie w produkcji flawonoli. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę wytwarzania flawonolu z flawanonu w jednym doniczce poprzez ustanowienie bienzymatycznej kaskady in vitro. Kluczowymi etapami tego protokołu są: 1) otrzymanie czys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była finansowana przez Fundusze Start-up Uniwersytetu Yangzhou, Fundusze Start-up Specjalnie Profesora Jiangsu, Projekt Six Talent Peaks w prowincji Jiangsu (Grant nr 2014-SWYY-016) oraz projekt finansowany przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (Medycyna Weterynaryjna). Dziękujemy Centrum Badawczemu Uniwersytetu w Yangzhou za analizy flawonoidów metodą HPLC i MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 razy; Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717Aamplifikację genów metodą PCR z wysoką wiernością
System Agilent 1200 Series RRLC z systemem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MSAgilent Technologies, IncN/Aurządzenie do analizy flawonoidów metodą HPLC/MS
Stacja robocza Agilent MassHunter (wersja B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aoprogramowanie do zbierania danych z systemu Agilent 1200 Series RRLC z systemem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS
dihydrokaemferolSigma-Aldrich Co. LLC91216produkt pośredni do wytwarzania kemferolu z naringeniny
dihydrokwercetynySyczuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371produkt pośredni do produkcji kwercetyny z eriodictyolu
Zestaw do czyszczenia DNABeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301oczyszczanie eriodictyolu DNA amplifikowanego PCR lub oczyszczonego żelem
Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160substrat do produkcji kwercetyny
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809szczep bakterii do ekspresji docelowych genów
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808szczep bakterii do proliferacji plazmidu
FreeZone 1 litrowy laboratoryjny system liofilizacjiLabconco Corporation7740020urządzenie do liofilizacji flawonoidów rozpuszczonych w rozpuszczalniku organicznym Zestaw do ekstrakcji
żeluBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302oczyszczanie pasma DNA z żelu agarozowego
Systemobrazowania żeluNauka i nauka o tanonie w Szanghaju Technologia Co., Sp. z o.o.Tanon-
2500		urządzenie do wizualizacji pasma DNA na żelu agarozowym lub plamce flawonoidowej na płytce poliamidowej TLC
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co., LLCPLN350-1KTminipreparat plazmidów
kemferolSigma-Aldrich Co., LLC60010produkt końcowej reakcji i substancja wzorcowa
Analiza Quanlitative MassHunter (wersja B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aoprogramowanie do analizy danych HPLC/LC/MS NanoDrop
Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLurządzenie do oznaczania stężenia DNA/RNA
naringeninaSigma-Aldrich Co. LLCN5893Podłoże do produkcji kemferolu
Ni-IDA Żywica agarozowaBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010oczyszczanie białek fuzyjnych znakowanych His
plazmid pET-32a(+)Novagen69015-3do klonowania i ekspresji genów docelowych,
sekwencjonowanie plazmidów,GENEWIZ Suzhounie dotyczysekwencjonowanie rekombinowanych plazmidów,
synteza starterówGENEWIZ SuzhouN/A, synteza starterów PCR
kwercetyna, Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.Q111273końcowy produkt reakcji i substancja wzorcowa
Zestaw do syntezy cDNA SuperRTBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741synteza pierwszej nici cDNA z całkowitej
ligazy DNA RNA T4Ligaza Thermo Fisher ScientificEL0016ligacja insertu do zlinearyzowanego wektora DNA
TrizolThermo Fisher Naukowaizolacja całkowitego RNA15596018
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099oprogramowanie do projektowania starterów PCR i analizy sekwencji DNA
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aoprogramowanie do analizy danych HPLC
, , : , , , ,

Bibliografia

  1. Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
  2. Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
  3. Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
  4. Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
  5. Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
  6. Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
  7. Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
  8. Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
  9. Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
  10. Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
  11. Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
  12. Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
  13. Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
  14. Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
  15. Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
  16. Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
  17. Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
  18. Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
  19. Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
  20. Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
  21. Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
  22. Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).
  23. Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
  24. Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).
  25. Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
  26. Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  27. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  28. Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  32. Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
  33. Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biosynteza flawonolikonwersja flawanonukaskada enzymatycznanadekspresja Atf3hnadekspresja Atfls1ekspresja w Escherichia colioczyszczanie powinowactwaanaliza TLCanaliza HPLCanaliza LC/MS
Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.