Artykuł metodologiczny

Ocena proliferacji keratynocytów na dwu- i trójwymiarowych substratach kolagenu typu I

DOI:

10.3791/59339

⸱

22 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1Nippi Research Institute of Biomatrix, 2Department of Anatomy and Cell Biology, Osaka Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania dwóch różnych form substratów hodowlanych wykorzystujących kolagen typu I. W zależności od tego, jak postępuje się z kolagenem, cząsteczki kolagenu albo zachowują dwuwymiarową, niewłóknistą formę, albo ponownie łączą się w trójwymiarową formę fibrylową. Na proliferację komórek kolagenu typu I drastycznie wpływa tworzenie fibryli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolagen typu I, przydatny jako substrat do hodowli komórkowych, występuje w dwóch formach: dwuwymiarowej, niewłóknistej i trójwymiarowej, fibrylowej. Obie formy mogą być przygotowane z tego samego kolagenu typu I. Ogólnie rzecz biorąc, forma niewłóknista sprzyja adhezji i proliferacji komórek. Forma fibrylowa (żele) zapewnia więcej warunków fizjologicznych w wielu typach komórek; Dlatego hodowla żelowa jest przydatna do badania fizjologicznych zachowań komórek, takich jak skuteczność leków.

Badacze mogą wybrać odpowiednią formę zgodnie z celem jej użycia. Na przykład w przypadku keratynocytów jako model gojenia się ran zastosowano posiew na żelu. FEPE1L-8, linia komórkowa keratynocytów hodowana na niewłóknistej formie kolagenu typu I, sprzyja adhezji komórek. Warto zauważyć, że proliferacja keratynocytów jest wolniejsza w postaci fibrylowej niż w postaci niewłóknistej. Protokoły przygotowania kolagenu typu I do hodowli komórkowych są proste i mają szerokie zastosowanie w zależności od potrzeb eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródmiąższowe tkanki łączne tworzą trójwymiarową siatkę białkową o niejednorodnym składzie, składającą się głównie z włókien kolagenu typu I1. Fibryle kolagenowe odgrywają kluczową rolę jako rusztowanie dla komórek1,2,3 i wchodzą w interakcje z innymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)3. In vitro różne formy kolagenu typu I mogą być stosowane jako substraty do hodowli komórkowych w zależności od metody obchodzenia się z nim1,2,3,4. W środowisku kwaśnym kolagen typu I zachowuje formę niewłóknistą5. Powlekanie powierzchni szalek hodowlanych formą niewłóknistą sprzyja adhezji i proliferacji komórek6,7. Przy fizjologicznym pH i temperaturze cząsteczki kolagenu typu I łączą się ponownie w fibryle, które tworzą żele o trójwymiarowej strukturze1,2,3,4,5,6,7,8. Istnieje kilka istotnych różnic między fibrylowymi i niewłóknistymi formami kolagenu typu I, w tym sztywność matrycy i skuteczność rekonstrukcji składników ECM przez komórki podczas hodowli1. Sztywność matrycy jest jednym z najlepiej badanych czynników regulacyjnych hodowli komórkowych1, 9. Jednak złożone interakcje między substratami a komórkami pozostają do wyjaśnienia. Do badania złożonych interakcji między komórkami a czynnikami środowiskowymi przydatny jest prosty system. Porównanie zachowania komórkowego dwóch różnych form kolagenu może pomóc uprościć działanie czynników środowiskowych. W zależności od celu ich stosowania, wybiórczo można stosować różne formy kolagenu typu I. Zwykle keratynocyty stykają się z błoną podstawną, ale nie z kolagenem typu I. Jednak podczas gojenia się ran keratynocyty przemieszczają się do tkanki łącznej skóry, namnażają się i goją ranę10.

Ostatnio wykazaliśmy, że stężenie zewnątrzkomórkowego wapnia jest ważne dla proliferacji komórek linii keratynocytów, wykorzystując system hodowli na formie fibrylowej kolagenu typu I, naśladując tkankę łączną skóry11. Gdy linia komórkowa keratynocytów FEPE1L-8 została wyhodowana na fibrylowej formie kolagenu typu I, kształt komórek był okrągły, a ich proliferacja została zatrzymana przy zewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia 30 μM11. Gdy stężenie wapnia wzrosło do 1,8 mM, wzrost komórek został odzyskany11. Komórki rosły pod oboma stężeniami wapnia (30 μM i 1,8 mM), gdy były hodowane na formie niewłóknistej 11, podczas gdy były bardziej wrażliwe na egzogenne stężenie wapnia podczas hodowli na formie fibrylowej. FEPE1L-8 został wygenerowany w wyniku transfekcji z genami transformującymi E6 i E7 wirusa brodawczaka brodawczaka typu 16 z ludzkiego raka szyjki macicy, nienowotworowego, hamującego nieograniczoną proliferację z ograniczonym potencjałem różnicowania, jak normalne keratynocyty12,13. Komórki FEPE1L-8 mogą być utrzymywane przy użyciu niektórych rodzajów pożywki specyficznej dla keratynocytów, w tym K110 typu II z dodatkiem suplementu K-1 (K110) 6. W tym miejscu opisujemy protokół hodowli ludzkiej linii komórkowej keratynocytów na niewłóknistych i fibrylowych formach kolagenu typu I.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki do hodowli keratynocytów

UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych.

  1. Dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny i 10 ml dodatku K-1 do 500 ml pożywki K110 typu II (K110) za pomocą pipety.

2. Przygotowanie formy fibrylowej kolagenu typu I

UWAGA: Wykonuj procedury do kroku 2.6 w warunkach aseptycznych.

  1. Trzymaj 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS (-)), wodę dejonizowaną, kolagen, 96-dołkową płytkę hodowlaną i pustą probówkę 2 ml na lodzie.
    UWAGA: Nie używaj tej samej płytki do przygotowania form fibrylowych i niewłóknistych.
  2. Dodaj 1,12 ml wody dejonizowanej do pustej probówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety. Dodać 200 μl 10x PBS (-) do dejonizowanej wody w probówce o pojemności 2 ml za pomocą pipety. Delikatnie potrząśnij rurką kilka razy.
  3. Dodaj 0,66 ml kolagenu do probówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety. Delikatnie i szybko potrząśnij rurką kilka razy.
    UWAGA: W miarę możliwości należy unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworze. Przygotuj roztwór kolagenu bezpośrednio przed użyciem.
  4. Wlać 100 μl roztworu kolagenu z kroku 2.3 do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie potrząśnij płytką hodowlaną ruchami od lewej do prawej.
    UWAGA: Pokryj całą powierzchnię studzienek roztworem kolagenu. Jeśli roztwór nie pokrywa całej powierzchni, rozprowadź roztwór za pomocą końcówki pipety. W miarę możliwości unikaj tworzenia się pęcherzyków w roztworze.
  5. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze z użyciem CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Sprawdzić żelowanie kolagenu i przenieść płytkę hodowlaną na czystą ławkę.
    UWAGA: Potwierdź żelowanie, przechylając płytkę hodowlaną.
  6. Delikatnie wylać 150 μl K110 na żele za pomocą pipety wzdłuż ścianki studzienki, umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przenieść płytkę hodowlaną na czystą ławkę. Przed hodowlą komórkową delikatnie wyrzuć K110 za pomocą pipety.
    UWAGA: Aby chronić żele, końcówka pipety powinna dotykać ścianki studzienki.

3. Przygotowanie niewłóknistej formy kolagenu typu I

UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych.

  1. Dodaj 4 μl kolagenu do 1,2 ml 1 mM kwasu solnego (HCl) w probówce o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety.
    UWAGA: Kolagen należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Przechowuj kolagen i HCl w chłodzie do czasu użycia.
  2. Wlej 100 μl kolagenu do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą pipety. Delikatnie potrząśnij płytką hodowlaną ruchami od lewej do prawej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    UWAGA: Upewnij się, że cała powierzchnia studzienek jest pokryta roztworem.
  3. Po inkubacji wyrzucić roztwór kolagenu i dwukrotnie przemyć studzienki PBS (-) za pomocą pipety.
  4. Wlać 150 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej/PBS (-) (1% BSA) do dołka na 96-dołkowej płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przed hodowlą komórkową wyrzucić 1% BSA.
    UWAGA: Upewnij się, że cała powierzchnia studzienek jest pokryta roztworem.

4. Hodowla komórek FEPE1L-8

UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych.

  1. Utrzymać komórki FEPE1L-8 w K110 w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do częściowego zrębu.
  2. Przygotować K110, trypsynę i inhibitor trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Ostrożnie wyjąć pożywkę z naczynia hodowlanego, dodać 3 ml 0,05% trypsyny za pomocą pipety, umieścić naczynie w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po inkubacji sprawdzić oderwanie komórek od powierzchni szalki hodowlanej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Morfologia odłączonych komórek staje się okrągła. Jeśli komórki się rozprzestrzenią, inkubować przez dodatkowy okres 5 minut.
  4. Dodać 3 ml inhibitora trypsyny i zebrać oderwane komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Odwirować komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przy 200 x g przez 5 minut.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml K110 za pomocą pipety. Policz komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu i przygotuj stężenie komórek przy 5,0 x 104 komórek/ml przez odpowiednie rozcieńczenie K110.
  6. Delikatnie wysiewać 0,1 ml K110 z komórkami w każdym dołku płytki hodowlanej za pomocą pipety wzdłuż ścianki studzienki. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze z użyciem CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez wskazany czas (2 godziny, 1 dzień, 3 dni).
    UWAGA: Aby chronić żele, końcówka pipety powinna dotykać ścianki studzienki.

5. Oszacowanie liczby żywotnych komórek

  1. Inkubować K110 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Zmieszać 130 μl soli tetrazolowej, 2-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H tetrazolium, sól monosodową (WST-8) i 1,3 ml K110 w probówce o pojemności 2 ml za pomocą pipety.
  2. Przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę i delikatnie wyrzuć K110 za pomocą pipety. Delikatnie zmyj nieprzylegające komórki za pomocą K110 za pomocą pipety
  3. Dodać 110 μl K110 zmieszanego z WST-8 do każdej studzienki za pomocą pipety, umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  4. Przenieś płytkę hodowlaną na czystą ławkę, zbierz 100 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i przenieś ją do studzienki z inną 96-dołkową płytką hodowlaną. Zmierz absorbancję przy długości fali 450 nm (OD450) za pomocą czytnika mikropłytek i oszacuj liczbę żywotnych komórek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie obróbki powierzchni naczyń hodowlanych przy użyciu kolagenu typu I jest przedstawione w Rysunek 1. Morfologie komórek obserwowane w formach niewłóknistych i fibrylowych są przedstawione odpowiednio na lewym i prawym panelu Rysunek 2. Komórki FEPE1L-8 hodowano przez 2 godziny (górne panele) i 3 dni (dolne panele). W ciągu pierwszych 2 godzin hodowli komórki przylegały i rozprzestrzeniały się na obu formach kolagenu (Ryc. 2, górne panele). Trzy dni po wysiewie komórki w formie niewłóknistej nadal się rozprzestrzeniały, a liczba komórek wzrosła (Rysunek 2, lewy dolny panel). W przeciwieństwie do tego, komórki w formie fibrylowej wykazywały ograniczone rozprzestrzenianie się (Ryc. 2, prawy dolny panel). Komórki FEPE1L-8 kontynuowały namnażanie się na niewłóknistej formie kolagenu typu I (Ryc. 3, ciągła linia, zamknięte czarne kółka) i na nieleczonych powierzchniach naczyń (Figura 3, przerywana szara linia, zamknięte szare kółka). W przeciwieństwie do tego, komórki nie namnażały się w formie fibrylowej (Ryc. 3, przerywana linia, otwarte okręgi). Rysunek 2 i Rysunek 3 zostały zmodyfikowane z Fujisaki et al11.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienia powierzchni naczyń hodowlanych potraktowanych kolagenem typu I. W warunkach kwaśnych cząsteczki kolagenu typu I są adsorbowane na powierzchni naczynia w postaci niewłóknistej (lewy panel). W warunkach obojętnych w temperaturze 37 °C cząsteczki kolagenu typu I są ponownie składane w włókienka i adsorbowane na powierzchni naczyń w postaci żelu (prawy panel). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Morfologia komórek FEPE1L-8. Komórki FEPE1L-8 w K110 hodowano przy użyciu formy niewłóknistej (10 μg/ml; lewe panele) lub fibrylowej (1 mg/ml; prawe panele) kolagenu typu I przez 2 godziny (górne panele) lub 3 dni (dolne panele). Białe słupki wskazują 100 μm. Rysunek 2 został zmodyfikowany z Fujisaki et al. w Rysunek 1E–H11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Proliferacja komórki FEPE1L-8. Liczbę żywotnych komórek oszacowano na formie niewłóknistej (linia ciągła, czarne wypełnione koła) lub na formie fibrylowej (linia przerywana, koło otwarte) kolagenu typu I lub na nieleczonych powierzchniach naczyń (szara linia przerywana, szare wypełnione koła) przez 2 godziny, 1 dzień i 3 dni. Doświadczenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a wartości przedstawiono jako średnie + SD. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Fujisaki et al. w Rysunek 1J11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre składniki ECM, w tym kolagen typu I, tworzą trójwymiarowe struktury in vivo1. Hodowla na takim trójwymiarowym, żelowym podłożu zapewnia więcej warunków fizjologicznych in vitro niż na dwuwymiarowej, plastycznej powierzchni 1,2,3,4. Opisano liczne protokoły dotyczące metody hodowli żelowej, takie jak stosowanie kolagenu typuI 1,2,3,4,6,7,11, kolagenu typu IV14,15 i Matrigel16. Kolagen typu I jest dobrze zdefiniowanym i szeroko stosowanym materiałem ze względu na jego obfitość i łatwość obsługi. Cechy oczyszczonego kolagenu typu I zależą od gatunku zwierzęcia, wieku i metod oczyszczania 5,17. Kolagen typu I można oczyszczać za pomocą kwasu octowego i/lub proteaz, takich jak pepsyna, papaina i proktaza 5,17. Kolagen rozpuszczalny w kwasach utrzymuje amino-telopeptydy, a kolagen rozpuszczalny w proteazie to rozszczepione amino-telopeptydy 5,17. Zarezerwowana długość amino-telopeptydów zależy od rodzaju proteaz, a obecność telopeptydów wpływa na morfologię włókienek i wytrzymałość żelu 5,17. Lepkość rozpuszczalnych w kwasach włókien kolagenowych jest większa niż kolagenów traktowanych proteazą17. W tym badaniu użyliśmy rozpuszczalnego w kwasach kolagenu bydlęcego typu I. Kolagen rozpuszczalny w pepsynach może być również stosowany w tym protokole hodowli żelu; Jednak siła żelu jest słabsza17. Te różnice w materiałach mogą powodować różnice w zachowaniu komórek, ale obecnie nie są one dobrze poznane.

Protokół hodowli żelowej opisany w tym badaniu jest bardzo prosty. Zgłoszono wiele modyfikacji tej metody. Jedną z możliwych modyfikacji hodowli keratynocytów jest naśladowanie błony podstawnej. Żele kolagenowe typu IV mogą być lepsze do utrzymania struktury substratu przypominającej błonę podstawną in vitro15,18. Jednak do przygotowania żeli kolagenowych typu IV wymagany jest długi okres inkubacji 14,15,18. Zamiast tego mieszanie kolagenu typu IV z żelami kolagenowymi typu I może wytworzyć nowe substraty hodowlane (żele hybrydowe kolagenu typu I/typu IV)19. Te hybrydowe żele są łatwe w obsłudze, wymagają krótkiego czasu żelowania i dają więcej warunków przypominających błonę podstawną dla keratynocytów. W hybrydowych żelach kolagenowych typu I/typu IV keratynocyty przeżywają, tworzą kolonie i indukują końcowe różnicowanie19. Ta hybrydowa metoda ma wszechstronne zastosowanie.

Hodowla na żelu z użyciem kolagenu typu I wpływa na komórki rakowe. W postaci fibrylowej kolagenu typu I aktywacja Akt i wzrost komórek Caco-2 (linia komórkowa raka jelita grubego) są hamowane7. Ponadto wzrost ludzkich komórek czerniaka (M24met) w postaci włókienki zostaje zatrzymany w punkcie kontrolnym G1/S20. Ponadto obserwuje się znaczny wzrost poziomu reaktywnych form tlenu w mysich preadipocytach 3T3-L1 hodowanych na formie fibrylowej. Ponadto proliferacja i migracja komórek są stymulowane w przeciwnych kierunkach przez niewłókniste i fibrylowe formy kolagenu typu I21.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Dr. K. Sekiguchi (Instytut Badań nad Białkami, Uniwersytet w Osace), Dr. M. Yamada (Instytut Badań nad Białkami, Uniwersytet w Osace), Dr. T. Ikejima (Chińsko-Japoński Instytut Badawczy Nauk Medycznych i Farmaceutycznych, Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University) i T. Hayashi (Chińsko-Japoński Instytut Badawczy Nauk Medycznych i Farmaceutycznych, Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University) za pomocną pomocną Komentarze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)Merck KGaAA4503
1 % BSA Merck KGaAA4503Rozpuścić 1 g proszku BSA w 100 ml PBS (-) i przefiltrować 
Zestaw do liczenia komórek-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.347-07621Sól tetrazolowa, 2-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H  tetrazoli, sól monosodowa (WST-8) 
Kolagen typu I (kolagen rozpuszczalny w kwasach)Nippi Inc.ASC-1-100-20z bydła (każdy inny dostępny gatunek, stężenie wynosi 3,0 mg / ml
jednorazowa membranowa jednostka filtrująca octan celulozy DISMICADVANTEC Co., LTD.25CS020AS0,2 &mikro; M Wielkość porów
ludzka komórka liniowa keratynocytu  FEPE1L-8  Darowizna Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)     
K-1Kyokuto Seiyaku Inc.28204dodatek uzupełniający zawierający 500 mg BSA, 500 mg ekstraktów z przysadki mózgowej bydła, 2,5 mg insuliny, 0,05 i mikro; g h-EGF i 5 mg heparyny
K110 Type-II mediumKyokuto Seiyaku Inc.28204Pożywka do hodowli podstawowych keratynocytów 
Pożywka K110 typu II z K-1 i penicyliną-streptomycyną (K110)Kyokuto Seiyaku Inc.28204Dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny i 10 ml dodatku (K-1) do 500 ml podstawowej pożywki hodowlanej keratynocytów K110 typu II 
PBS (-) Merck KGaAP-5368Rozpuść 1 saszetkę proszku PBS (-) w 1000 ml wody dejonizowanej i przefiltrować 
10x PBS (-)Merck KGaAP-5368Rozpuść 1 saszetkę proszku PBS (-) w 100 ml wody dejonizowanej i przefiltruj 
Penicylina-StreptomycynaMP Biomedicals, LLC167004910000 jednostek/ml penisyliny G i 10 000 μm; g/ml siarczanu streptmycyny w soli fizjologicznej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem BioPerformance CertiCertified, pH 7,4Merck KGaAP-5368-10
Trypsyna z trzustki świniMerck KGaAT4799
0,05 % trypsyna Merck KGaAT4799Rozpuścić 0,25 g trypsyny i  0,186 g EDTA.2Na w 500 ml PBS (-)  i przefiltrować 
Inhibitor trypsyny z soiFUJIFILM Wako Pure Chemical corporation202-20123
Inhibitor trypsyny FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation202-20123Rozpuścić 50 mg inhibitora trypsyny i 500 mg BSA w 500 ml PBS (-) i przefiltrować 
Opakowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
  2. Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
  3. Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
  4. Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
  5. Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
  6. Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
  7. Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
  8. Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
  9. Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
  10. Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784(2013).
  11. Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
  12. Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
  13. Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
  14. Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
  15. Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
  16. Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922(2014).
  17. Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
  18. Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
  19. Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
  20. Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
  21. Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla dwuwymiarowahodowla tr jwymiarowaprzygotowanie pod o a kolagenowegotest adhezji kom rektest ywotno ci WST 8mikroskopia kontrastowakom rki FEPE1L 8metoda hodowli w elu

Powiązane artykuły