Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

Celem tej metody jest identyfikacja DNA w żelach agarozowych za pomocą oranżu tiazolowego (TO) do wykrywania fluorescencji. Ze względu na niski koszt i korzystny profil bezpieczeństwa, oranż tiazolowy może być szczególnie korzystny w laboratoriach dydaktycznych i laboratoriach badawczych wykonujących biologię molekularną, zwłaszcza ligacje i klonowanie.

Bromek etydyny pozostaje najpowszechniejszym barwnikiem do wykrywania DNA w żelach agarozowych. Dzieje się tak przede wszystkim dlatego, że można go uzyskać bardzo tanio, a do wykrycia wymaga jedynie wzbudzenia światłem UV. Zarówno bromek etydyny, jak i oranż tiazolowy są niedrogie, z niskimi granicami wykrywalności (1-2 ng/tor)¹. Istnieją jednak dwie główne wady bromku etydyny, które oranż tiazolowy poprawia.

Po pierwsze, bromek etydyny jest mutagenem² o specjalnych wymaganiach dotyczących obsługi, wysyłki i utylizacji, podczas gdy oranż tiazolowy jest mniej mutagenny (3-4 razy mniej mutagenny w teście Amesa)^3,4 i może być zazwyczaj utylizowany razem ze zwykłymi odpadami chemicznymi.

Po drugie, bromek etydyny wymaga światła UV do wykrywania. Oranż tiazolowy może w razie potrzeby podobnie wykorzystywać światło UV, ale może być również wykrywany za pomocą światła niebieskiego. Światło UV, choć powszechnie stosowane, ma kilka istotnych wad. Po pierwsze, jest szkodliwy dla ludzkiej skóry i oczu. Podczas gdy światło UV może być bezpiecznie używane przez przeszkolonych specjalistów, przypadkowe uszkodzenie skóry lub oczu (funkcjonalnie podobne do oparzeń słonecznych) spowodowane laboratoryjnym światłem UV nie jest rzadkością, szczególnie w przypadku niedoświadczonych naukowców. Po drugie, światło UV jest niezwykle szkodliwe dla próbek DNA⁵, co zmniejsza powodzenie dalszych eksperymentów (takich jak ligacja i transformacja)^1,6,7. TO umożliwia detekcję światłem niebieskim (λ_{ex, max} = 510 nm (488 nm i 470 nm również wykazują silne wzbudzenie)), które nie powoduje uszkodzenia skóry ani uszkodzenia DNA (chociaż każde intensywne światło może być nadal szkodliwe dla oczu), znacznie zmniejszając ryzyko zarówno dla naukowca, jak i próbki.

TO nie jest jedyną alternatywą dla bromku etydyny jako barwnika fluorescencyjnego; jego zaletą jest koszt. TO został odkryty w latach osiemdziesiątych XX wieku jako barwnik retikulocytów⁸ i znalazł zastosowanie w wielu eksperymentach fluorescencyjnych opartych na DNA9^,10,11,12,13. Obecnie jest sprzedawany przez wielu dostawców. TO jest związkiem macierzystym dodatkowych, droższych, wykrywalnych przez niebieskie światło barwników komercyjnych i zachowuje się podobnie podczas elektroforezy, wykorzystując UV lub niebieskie światło do wykrywania¹. Ponadto, podczas gdy inne barwniki są bardziej wrażliwe na bardzo niskie stężenia DNA niż EtBr lub TO, w przypadku ogólnych eksperymentów elektroforetycznych takie barwniki są w wielu kontekstach zbyt drogie.

1. Przygotowanie żelu

UWAGA: Ogólne protokoły elektroforezy żelowej można znaleźć także w P.Y. Lee, et al. ¹⁴.

1. Wymieszaj agarozę (~1% w/v, zawartość procentowa może być różna dla poszczególnych rozmiarów) w buforze (około 70 ml dla mini-żelu (8 x 7 cm)). to zwykle TAE (tris-octan-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM octan, 1 mM EDTA, pH około 8,6) lub TBE (tris-boran-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boran, 2 mM EDTA, pH około 8,3)).
2. Dodać oranż tiazolowy do końcowego stężenia 1,3 μg/ml.
   1. Rozpuść oranż tiazolowy w DMSO, aby uzyskać 10 000 x roztwór podstawowy (13 mg / ml). Chociaż nie jest szczególnie wrażliwy na światło, przechowuj TO w ciemności, gdy nie jest używany. To rozwiązanie jest stabilne w temperaturze pokojowej przez ~ miesiące; długotrwałe przechowywanie można osiągnąć poprzez zamrożenie porcji (DMSO zamrozi się w standardowej lodówce). Pamiętaj, aby całkowicie stopić i ponownie zawiesić zamrożony roztwór przed użyciem.
      UWAGA: Żel można również zabarwić TO po elektroforezie (patrz krok 2.6). Chociaż TO ma lepszy profil bezpieczeństwa w porównaniu z bromkiem etydyny, należy utrzymać standardowe laboratoryjne środki ostrożności w zakresie biologii molekularnej.
3. Mieszaninę agarozy, buforu i oranżu tiazolowego należy podgrzać w kuchence mikrofalowej w celu rozpuszczenia agarozy (około 60 s). Ten etap jest powszechnie określany jako "topnienie". Zawirować (5 s), aby w razie potrzeby wspomóc rozpuszczenie.
   UWAGA: TO można również dodać po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej, jeśli wolisz.
4. Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia na krótko przed wlaniem do aparatu do odlewania żelu zawierającego odpowiedni grzebień.
5. Poczekaj, aż roztwór agarozy zestali się w żel.

2. Ładowanie i uruchamianie żelu

1. Umieść żel w aparacie do elektroforezy, jeśli nie jest jeszcze obecny.
2. Dodać bufor do biegania (TAE lub TBE jak powyżej), aby pokryć powierzchnię żelu.
3. Załaduj próbki DNA (zwykle 10 μl) za pomocą barwnika ładującego. Dołącz drabinkę do wymiarowania DNA w celach informacyjnych.
4. Załóż pokrywę i elektrody (żel powinien być prowadzony w kierunku czerwonej anody (dodatniej)).
5. Przyłóż napięcie (zwykle ~100 V dla mini-żelu, chociaż rozmiar żelu może wymagać zmodyfikowanego napięcia, aby zapobiec uszkodzeniu żelu), aż ładowanie barwnika przebędzie odpowiednią odległość (około 4-7 cm w przypadku mini-żelu, chociaż odległość może się różnić w zależności od precyzyjnej aplikacji).
   UWAGA: Podobnie jak bromek etydyny i wiele innych barwników wiążących DNA, oranż tiazolowy jest naładowany dodatnio. W konsekwencji barwniki te będą migrować w kierunku przeciwnym do elektroforezacji DNA. W przypadku próbek, które są spływane daleko w dół żelu w celu lepszej separacji, w końcu barwnik oddzieli się od mniejszych fragmentów DNA, co spowoduje słabe barwienie. W takich przypadkach żel należy zabarwić jak w kroku 2.6. Ta sytuacja nie jest wyjątkowa dla TO, każdy dodatnio naładowany barwnik, który odwracalnie oddziałuje z DNA, będzie wykazywał takie zachowanie (w tym bromek etydyny, TO i inne).
6. Jeśli TO nie zostało dodane przed odlaniem żelu (krok 1.2), wybarwić przez zanurzenie żelu w buforze zawierającym oranż tiazolowy.
   1. Przygotować wystarczającą ilość buforu (TAE lub TBE) zawierającego 1,3 μg/ml oranżu tiazolowego, aby całkowicie pokryć żel i namoczyć żel delikatnym mieszaniem, aż pasma zostaną w pełni wykryte (około 20 min).

3. Wizualizacja tiazolowo-pomarańczowego żelu agarozowego (transilluminator UV)

1. Usuń żel z aparatu do elektroforezy i umieść go na transiluminatorze UV.
   UWAGA: Światło UV jest szkodliwe dla skóry i oczu. Pamiętaj, aby nosić odpowiednią ochronę oczu (gogle) i twarzy (osłona twarzy). Ręce powinny być w rękawiczkach i należy nosić długie rękawy.
2. W razie potrzeby wytnij z żelu pożądane pasma DNA (na przykład w celu dalszego trawienia lub podwiązania). Wystaw żel na działanie światła UV tak krótko, jak to możliwe podczas wycinania. Światło UV (niezależnie od barwnika DNA) uszkadza DNA.
3. Wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą łatwo dostępnego zestawu lub protokołu¹⁵.

4. Wizualizacja tiazolowego żelu agarozowego pomarańczowego (transiluminator światła niebieskiego lub latarka)

1. Usuń żel z aparatu do elektroforezy i umieść na transiluminatorze światła niebieskiego (maksymalna długość fali emisji ~470 nm). Alternatywnie na żel można skierować niebieską latarkę LED (~470 nm) (zarówno od góry, jak i od dołu).
   UWAGA: Podczas gdy czułość jest niższa przy użyciu transiluminatora światła niebieskiego z bromkiem etydyny, DNA barwione bromkiem etydyny można wykryć za pomocą tego protokołu światła niebieskiego.
2. Użyj bursztynowego filtra emisyjnego (~560 nm długiego przepustu, gogle lub kwadrat) do filtrowania niebieskiego światła, umożliwiając wizualizację fluorescencji z kompleksów DNA:tiazol pomarańczowy.
   UWAGA: Bez bursztynowego filtra emisyjnego bardzo trudno jest wykryć prążki DNA ze względu na intensywność źródła wzbudzenia światła niebieskiego.
   UWAGA: Chociaż niebieskie światło nie ma zdolności do ostrego uszkadzania tkanek (kontrastujące promieniowanie UV), długotrwała ekspozycja na intensywne niebieskie światło może uszkodzić oczy i należy używać bursztynowych okularów emisyjnych lub filtra.
3. W razie potrzeby wytnij z żelu pożądane pasma DNA do dalszych zastosowań.
   UWAGA: Ponieważ niebieskie światło nie uszkadza DNA, nie jest konieczne szybkie wycinanie prążków (tak jak w przypadku stosowania wzbudzenia UV w kroku 3.2).
4. Wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą łatwo dostępnego zestawu lub protokołu¹⁵.

5. Przechwytywanie obrazu

1. Dobierz odpowiednie ustawienia wzbudzenia i emisji w aparaturze do obrazowania żelowego. Wzbudzenie i emisja oranżu tiazolowego (λ_ex,max = 510 nm (488 nm i 470 nm wykazują również silne wzbudzenie, oprócz silnego wzbudzenia przy długościach fal UV); λ_em = 527 nm) są prawie identyczne z powszechnie dostępnymi barwnikami komercyjnymi wykrywającymi światło niebieskie, więc instrumenty mogą mieć wstępnie ustawione ustawienia filtra, które można zastosować.
   UWAGA: Niektóre ustawienia filtrów dla barwników komercyjnych wykrywalnych przez światło niebieskie w rzeczywistości wykorzystują szkodliwe światło UV do wzbudzenia, dlatego należy zachować ostrożność podczas obrazowania przed wycięciem pasm. Jeśli to możliwe, użyj źródła wzbudzenia światłem niebieskim, gdy prążki DNA zostaną wycięte po obrazowaniu.
2. W przypadku braku systemu obrazowania z odpowiednimi filtrami, należy umieścić filtr bursztynowy między kamerą a źródłem wzbudzenia światła żelowego/niebieskiego.

Thiazol pomarańczowy umożliwia wykrywanie DNA, bez użycia bromku etydyny i bez użycia światła UV uszkadzającego DNA. Bromek etydyny jest dobrze znany z tego, że jest mutagenny, więc wyeliminowanie go z laboratorium może być korzystne. Światło UV uszkadza DNA i znacznie obniża wydajność przemiany, podczas gdy światło niebieskie nie uszkadza DNA. Granice wykrywalności są podobne między bromkiem etydyny, oranżem tiazolowym i powszechnym, wykrywalnym przez niebieskie światło komercyjnym barwnikiem DNA (Rysunek 1, patrz Tabela Materiałów), przy czym granica wykrywalności dla wszystkich trzech barwników wynosi ~ 1-2 ng / linię w klasie mini-żel1.

Do typowych zastosowań, takich jak wycinanie pasma trawionego enzymem restrykcyjnym, szczególnie dobrze nadaje się oranż tiazolowy. Wykrywanie DNA ze wzbudzeniem światłem niebieskim jest solidne i proste, a naukowiec nie musi się spieszyć z wycinaniem DNA, tak jak w przypadku wykrywania za pomocą światła UV. Plazmid został przecięty enzymami restrykcyjnymi w celu wyizolowania wstawki (Ryc. 2, jeden żel jest obrazowany na trzy różne sposoby). Wkładka jest łatwo wykrywalna za pomocą TO z niebieskim światłem oprócz UV, co pozwala na dalsze aplikacje bez obawy o uszkodzenie DNA w wyniku ekspozycji na promieniowanie UV.

Rysunek 1. Wykrywanie DNA za pomocą oranżu tiazolowego, popularnego komercyjnego barwnika DNA wykrywalnego w świetle niebieskim, oraz bromku etydyny przy użyciu światła niebieskiego lub UV. Obrazy plastrów żelu reprezentują dwukrotne rozcieńczenie 120-ngowego pasma DNA w poprzek żelu (pasmo to pasmo 3,0 kb z drabiny 2-logarytmicznej). Ten rysunek został zmodyfikowany z O'Neil, et al.1, reprodukowany za zgodą. Zobacz O'Neil, et al.1, aby uzyskać pełne szczegóły eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wiele obrazów tego samego tiazolowego żelu agarozowego barwionego pomarańczowo o trawieniu restrykcyjnym. (A) Wzbudzenie za pomocą transiluminatora UV. (B) Wzbudzenie za pomocą transiluminatora światła niebieskiego. (C) Pobudzenie latarką o niebieskim świetle (której końcówka jest lekko widoczna, nieostra, na zdjęciu na dole). Tor 1: drabina 2-logarytmiczna, 1 μg całkowitego DNA (znakowane są główne prążki 3,0 kb, 1,0 kb i 0,5 kb). Tor 2: 0,5 μg plazmidowego DNA pEF-GFP (5,1 kb) trawionego za pomocą HindIII (oczekiwany rozmiar 5,1 kb). Tor 3: 0,5 μg pEF-GFP strawione za pomocą HindIII i EcoRI (oczekiwane rozmiary: 3,7 kb, 1,3 kb). Żel prowadzono z 1,3 μg/ml oranżu tiazolowego w żelu. Wszystkie zdjęcia wykonane przy użyciu standardowego filtra emisyjnego (590/110 nm), ekspozycja zoptymalizowana pod kątem intensywnych pasm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.