Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59359

⸱

25 kwietnia 2019

 ,  , 
1Department of Life Science Frontiers, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University, 2Department of Clinical Application, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Streszczenie

W odpowiedzi na sygnały takie jak WNTs, białka morfogenetyczne kości (BMP) i sonic hedgehog (SHH) wydzielane z otaczających tkanek, somity (SM) dają początek wielu typom komórek, w tym miotom (MYO), sklerotomowi (SCL), dermatomowi (D) i syndetom (SYN), które z kolei rozwijają się odpowiednio w mięśnie szkieletowe, szkielet osiowy, grzbietową skórę właściwą i osiowe ścięgno/więzadło. W związku z tym wytwarzanie SM i ich pochodnych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) ma kluczowe znaczenie dla uzyskania pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) do zastosowania w medycynie regeneracyjnej i badaniach nad chorobami w dziedzinie chirurgii ortopedycznej. Chociaż protokoły indukcji MYO i SCL z PSC były wcześniej zgłaszane przez kilku badaczy, żadne badanie nie wykazało jeszcze indukcji SYN i D z iPSC. W związku z tym skuteczne wprowadzenie w pełni kompetentnych SM pozostaje dużym wyzwaniem. W tym miejscu podsumowujemy wzorce ludzkiego SM z ludzkimi iPSC in vitro, naśladując środowisko sygnalizacyjne podczas rozwoju SM piskląt / myszy i przedstawiamy metody systematycznej indukcji pochodnych SM (Myo, SCL, D i SYN) z ludzkich iPSC w chemicznie zdefiniowanych warunkach przez mezodermę presomityczną (PSM) i stany SM. Wiedza na temat rozwoju SM u piskląt i myszy została z powodzeniem zastosowana do indukcji SM za pomocą ludzkich iPSC. Metoda ta może być nowatorskim narzędziem do badania ludzkiej somitogenezy i wzorców bez użycia embrionów oraz do terapii komórkowej i modelowania chorób.

Wprowadzenie

Opracowanie metody ukierunkowanego różnicowania pożądanego typu komórek z PSC jest niezbędnym krokiem do przełożenia badań nad komórkami pochodzącymi z PSC na zastosowania kliniczne. Wymuszona ekspresja kluczowych genów jest obiecującą strategią różnicowania komórek narządowych z PSC i poszerzyła naszą wiedzę na temat genetycznej regulacji determinacji losu komórek, morfogenezy i organizacji narządów podczas embriogenezy1. Ponadto uważa się, że rekapitulacja endogennych środowisk sygnalizacyjnych, wykorzystująca rozwój zarodków myszy i piskląt jako mapę drogową, ma zasadnicze znaczenie dla ukierunkowanego różnicowania PSC. Jednak biorąc pod uwagę zastosowanie komórek pochodzących z PSC w badaniach klinicznych, takich jak terapie komórkowe, ta druga strategia jest bardziej odpowiednia, ponieważ nie wymaga manipulacji genami.

Kilka badań donosiło o indukcji mezodermy z ludzkich i mysich PSC w chemicznie zdefiniowanych warunkach. Zazwyczaj metody te opierały się na sygnalizacji aktywiny/węzłowej/transformującego czynnika wzrostu β (TGFβ) i sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (BMP), które uważa się za odpowiedzialne za różnicowanie mezo-endodermy i mezodermy, co skutkuje niską wydajnością indukcji mezodermy przyosiowej (około 20%)2. Innymi słowy, mezoderma pochodząca z PSC indukowana przez te szlaki sygnałowe była głównie mezodermą płytki bocznej, a nie mezodermą przyosiową. Ostatnio kilka badań wykazało wydajną produkcję mezodermy przyosiowej pochodzącej z PSC w oparciu o różne strategie3,4,5,6,7,8. W tych badaniach PSC hodowano ze stosunkowo wysokimi stężeniami inhibitorów kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK3) (aktywatorów sygnalizacji WNT), w wyniku czego skuteczność indukcji mezodermy przyosiowej osiągnęła 70%–95%6,7.

W somitogenezie, mezoderma przyosiowa najpierw tworzy mezodermę presomityczną (PSM) z tyłu, a następnie tworzy somity (SMs) w przedniej części poprzez przejście mezenchymiczne do nabłonkowego9,10. Wiadomo, że ligand Notch Delta-like 1 (DLL1) odgrywa kluczową rolę podczas somitogenezy, ponieważ oscylacyjna kontrola ekspresji DLL1, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka, reguluje segmentację SM. SM ostatecznie dzielą się na dwie części, dając początek dermomyotomowi (DM) grzbietowo i sklerotomowi (SCL) brzusznie11. Następnie cukrzyca różnicuje się na dermatom (D), prekursor skóry właściwej i miotom (MYO), prekursor mięśni szkieletowych; dodatkowo brzuszna część SCL tworzy syndetom (SYN), prekursor ścięgien i więzadeł12 (Rysunek 1). Niektórzy badacze donosili o indukcji pochodnych SM pochodzących z PSC, takich jak MYO4,13 i SCL14; Istnieje jednak kilka ograniczeń w tych badaniach. Warto zauważyć, że ponieważ nasza wiedza na temat środowisk sygnalizacyjnych D i SYN jest fragmentaryczna, protokoły indukcji dla D i SYN nie zostały jeszcze systematycznie ustalone. Aby wykazać pełną kompetencję SM indukowanych z PSC, konieczne jest wykazanie zdolności do wieloróżnicowania indukowanych SM na wszystkie cztery pochodne (D, MYO, SCL i SYN), podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się tylko na określonych pochodnych SM. W tym miejscu opisujemy, jak wygenerować wszystkie cztery pochodne SM, w tym D i SYN, za pomocą losów PSM i SM z ludzkich iPSCs15. Uważamy, że opracowanie metody etapowej in vitro, która modeluje proces rozwoju SM, może przyczynić się do badania tego, jak ludzka postać mięśniowa rozwija się podczas embriogenezy, bez użycia zarodków.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne z udziałem ludzkich iPSC zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Wydziału Medycyny i Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Kioto.

1. Przygotowanie ludzkich iPSC przed indukcją

UWAGA: Hodowla ludzkich iPSC (201B7-PAX3-GFP) na komórkach zasilających SNL16 z pożywką dla komórek ES naczelnych uzupełnioną rekombinowanym ludzkim podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF2) o stężeniu 4 ng/ml oraz 0,5% penicyliny i streptomycyny (zwanej dalej pożywką hESC, patrz Tabela 1). Gdy współczynnik konfluencji osiągnie 70%–80%, przejdź przez komórki zgodnie z wcześniejszym opisem17.

  1. Pasażowanie ludzkich iPSC na komórkach zasilających SNL17
    1. W celu pasażowania dodaj PBS do naczynia do hodowli komórek i wypłucz komórki. Następnie usuń PBS (dalej proces ten będzie określany jako mycie PBS).
    2. Dodać 1 ml roztworu CTK (patrz Tabela 1) w temperaturze pokojowej (RT) i poczekać, aż komórki podajnika SNL zaczną odłączać się od dna naczynia.
    3. Usunąć roztwór CTK, a następnie przemyć dwukrotnie PBS.
    4. Dodać 1 ml pożywki hESC (patrz Tabela 1) do naczynia, a następnie zeskrobać komórki za pomocą skrobaka i zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Delikatnie odpipetować zawartość pięć razy za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl, a następnie przenieść do nowego naczynia wypełnionego pożywką hESC. Użyj współczynnika podziału od 1:4 do 1:10, w zależności od współczynnika konfluencji przed przejściem. Zmieniaj również objętość pożywki hESC w zależności od skali naczynia (np. 3 ml dla naczynia o średnicy 6 cm, 8 ml dla naczynia o średnicy 10 cm).
    6. Inkubować ludzkie iPSC w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    7. Zmieniaj pożywkę codziennie (z wyjątkiem dnia po pasażu) i hoduj komórki do następnej procedury pasażowania.
  2. Hodowla ludzkich iPSC bez dopływu przed indukcją PSM
    UWAGA:     Aby zminimalizować wpływ czynników wzrostu wydzielanych z komórek zasilających SNL, należy hodować ludzkie iPSC w warunkach wolnych od karmienia za pomocą pożywki do hodowli komórkowych bez karmienia (patrz Tabela 1) na roztworach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (patrz Tabela 1) powlekanej misce przez 3 dni przed indukcją PSM.
    1. Dzień -4 (4 dni przed rozpoczęciem indukcji PSM)
      1. Aby przygotować naczynie pokryte roztworem ECM, należy przez noc dodać 4 ml roztworu ECM do naczynia o średnicy 10 cm w temperaturze 4 °C.
        nuta: Umieść roztwór ECM na lodzie podczas przygotowywania.
    2. Dzień -3
      1. Najpierw wyjmij roztwór ECM z naczynia i dodaj 8 ml pożywki do hodowli komórkowych bez podajnika.
      2. Aby rozpocząć hodowlę bez karmienia, umyj raz PBS, aby wypłukać hodowane komórki.
      3. Dodaj 1 ml roztworu CTK w temperaturze pokojowej, aż komórki zasilające SNL zaczną odłączać się od dna naczynia.
        nuta: Użyj mikroskopii, aby potwierdzić, że wszystkie komórki zasilające są odłączone od dna.
      4. Usunąć roztwór CTK i dwukrotnie przemyć PBS, tak aby wszystkie komórki zasilające SNL zostały całkowicie usunięte.
      5. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych bez podajnika do naczynia, a następnie zeskrobać komórki za pomocą skrobaka i zebrać je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      6. Delikatnie odpipetować zawartość trzykrotnie za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl, a następnie przenieść do nowego naczynia pokrytego roztworem ECM o średnicy 10 cm (przygotowanego w kroku 1.2.1). Użyj proporcji podziału około 1:2 do 1:4, w zależności od współczynnika konfluencji przed hodowlą bez karmienia.
      7. Inkubować ludzkie iPSC w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 dni, zmieniając pożywkę w dniu -1.

2. Różnicowanie i izolacja PSM za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

  1. Różnicowanie PSM (dzień 0–dzień 4)
    1. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych bez pożywki i dodać 8 ml pożywki indukcyjnej PSM (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 10 μM SB431542, 10 μM CHIR99021, 2 μM DMH1 i 20 ng/ml FGF2, patrz Tabela 1).
      nuta: Zbieg komórek na początku różnicowania PSM ma kluczowe znaczenie dla wydajności indukcji. Użyj mikroskopii, aby potwierdzić, że stosunek zlewania wynosi około 30%.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 przez 4 dni, zmieniając pożywkę w dniu 3.
    3. Pobrać komórki pod kątem FACS w dniu 4 (sekcja 2.2 poniżej).
  2. Izolacja komórek PSM z dodatnim DLL1 metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
    UWAGA:     Poniżej znajduje się procedura przygotowania komórek przed sortowaniem komórek DLL1 dodatnich metodą FACS. Sortowanie FACS należy przeprowadzić za pomocą cytometru przepływowego, zgodnie z protokołem producenta.
    1. Odessać pożywkę, a następnie przemyć PBS. Następnie dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek i pozostawić na 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Dodać 4 ml podłoża podstawowego CDM, zeskrobać komórki za pomocą skrobaka i zebrać je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, a następnie odwiruj przy 280 x g przez 3 minuty.
    4. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (patrz Tabela 1) w stężeniu 1,0 x 107 komórek/ml. W przypadku ujemnej próbki kontrolnej (kontrola izotypowa lub, w konwencji, bez przeciwciała), przenieść 50 μl do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie zawiesić na 450 μl buforu FACS.
    5. Dodać przeciwciało DLL1 (patrz tabela materiałów) w stosunku 1/200. Chroń probówkę przed światłem i trzymaj na lodzie przez 30 minut.
    6. Wirować przy 280 x g przez 3 min.
    7. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w buforze FACS (1,0 x 107 komórek/ml) uzupełnionym 1 mg/ml DAPI.
    8. Przenieść do probówki zbiorczej, wbudowanej w nasadkę nylonową siatką o grubości 35 μm w celu przefiltrowania, a następnie umieścić probówkę na lodzie do momentu zakończenia sortowania. Przeprowadzić tę samą procedurę z ujemną próbą kontrolną (etap 2.2.4).
    9. Sortowanie należy przeprowadzić za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z protokołem producenta.
    10. Zebrać posortowane komórki dodatnie DLL1 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zawierającej 4 ml pożywki podstawowej CDM uzupełnionej 10 μM Y27632. W celu ekstrakcji całkowitego RNA odwirować przy 280 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić w buforze do lizy RNA i przechowywać w temperaturze -30 °C. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje, zobacz procedury ekstrakcji RNA, odwrotnej transkrypcji i RT-qPCR (sekcja 5.1).
    11. Przeprowadź różnicowanie SM przy użyciu posortowanych komórek zgodnie z poniższym protokołem (sekcja 3).

3. Odróżnienie SM od PSM

  1. Różnicowanie SM z posortowanych komórek PSM DLL1 dodatnich (dzień 4–dzień 8)
    UWAGA:     Przygotować 12-dołkowe płytki pokryte roztworem ECM na dzień przed sortowaniem FACS. Aby przygotować 12-dołkową płytkę pokrytą roztworem ECM, dodać 1 ml roztworu ECM do każdej studzienki w temperaturze 4 °C i pozostawić na noc. Podczas przygotowywania roztwór ECM należy trzymać na lodzie.
    1. Postępując zgodnie z krokiem 2.2.10, odwirować przy 280 x g przez 3 minuty.
    2. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki indukcyjnej SM (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 10 μM SB431542 i 5 μM CHIR99021, patrz Tabela 1).
    3. Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
    4. Zasiać 1,0 x 105 komórek na każdym dołku 12-dołkowych płytek pokrytych roztworem ECM zawierających 1 ml pożywki indukcyjnej SM uzupełnionej 10 μM Y27632.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 dni do dnia 8. Zmień podłoże niezawierające Y27632 w dniu 5 (dzień po sortowaniu FACS) i dniu 7.
    6. Przeprowadź różnicowanie pochodnych SM za pomocą indukowanych komórek SM zgodnie z poniższymi protokołami. W celu ekstrakcji całkowitego RNA z indukowanych komórek SM należy zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 280 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić w buforze do lizy RNA i przechowywać w temperaturze -30 °C.

4. Pochodne SM (DM, MYO, D, SCL, SYN) Odróżnienie od SM

UWAGA: Aby zademonstrować pełną kompetencję komórek SM, najpierw wykonaj odpowiednio indukcję DM (dermomyotome) i SCL (sklerotom) przy użyciu komórek SM pochodzących z iPSC. Następnie wykonaj indukcję MYO (miotom) i D (dermatomu) za pomocą komórek DM oraz przeprowadź indukcję SYN (syndetom) za pomocą komórek SCL. Poniżej znajdują się protokoły indukcji każdej pochodnej (DM, MYO, D, SCL i SYN) z indukowanych komórek SM in vitro.

  1. Różnicowanie DM z komórek SM (dzień 8–dzień 11)
    1. Odessać pożywkę, a następnie dodać 1 ml pożywki indukcyjnej DM (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 5 μM CHIR99021 i 10 ng/ml BMP4, patrz Tabela 1).
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 przez 3 dni, aż do dnia 11. Zmień pożywkę w dniu 10 (dzień 2 indukcji DM).
    3. Przeprowadź różnicowanie MYO i D za pomocą indukowanych komórek DM zgodnie z poniższymi protokołami.
  2. Różnicowanie MYO z komórek DM (dzień 11–dzień 41)
    1. Odessać pożywkę, a następnie dodać 1 ml pożywki indukcyjnej MYO (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 5 μM CHIR99021, patrz Tabela 1).
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 , przez 30 dni do dnia 41. Zmieniaj podłoże co 3 dni.
  3. Różnicowanie D z komórek DM (dzień 11–dzień 20)
    1. Odessać pożywkę, a następnie dodać 1 ml pożywki indukcyjnej D (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 5 μM CHIR99021 i 10 ng/ml BMP4, patrz Tabela 1).
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 , przez 9 dni do dnia 20. Zmieniaj podłoże co 3 dni.
  4. Różnicowanie SCL z komórek SM (dzień 8–dzień 11)
    1. Odessać pożywkę, a następnie dodać 1 ml pożywki indukcyjnej SCL (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 100 nM SAG i 0,6 μM LDN193189, patrz Tabela 1)14.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 przez 3 dni. Zmienić podłoże w dniu 10 (dzień 2 indukcji SCL).
    3. Przeprowadź różnicowanie SYN za pomocą indukowanych komórek SCL zgodnie z poniższym protokołem.
  5. Różnicowanie SYN z komórek SCL (dzień 11–dzień 32)
    UWAGA:     Przygotować 24-dołkowe płytki pokryte roztworem ECM na dzień przed rozpoczęciem indukcji SYN. Aby przygotować 24-dołkową płytkę pokrytą roztworem ECM, dodać 0,5 ml roztworu ECM do każdej studzienki w temperaturze 4 °C i pozostawić na noc. Podczas przygotowywania roztwór ECM należy trzymać na lodzie.
    1. Odessać pożywkę, a następnie przemyć PBS, a następnie dodać 0,2 ml odczynnika do dysocjacji komórek do każdej studzienki i pozostawić na 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Dodaj 0,8 ml podłoża podstawowego CDM do każdej studzienki, a następnie zeskrob i zbierz wszystkie komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy 280 x g przez 3 min.
    4. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki indukcyjnej SYN-1 (pożywka podstawowa CDM uzupełniona 20 ng/ml FGF8, patrz Tabela 1), a następnie policzyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
    5. Zasiać 5,0 x 104 komórki do każdego dołka 24-dołkowych płytek pokrytych roztworem ECM zawierających 1 ml pożywki indukcyjnej SYN-1.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 przez 3 dni.
    7. W dniu 14 (dzień 3 indukcji SYN) zastąp pożywkę pożywką indukcyjną SYN-2 (podstawowa pożywka CDM uzupełniona 10 ng/ml BMP7 i 10 ng/ml TGFβ3, patrz Tabela 1).
    8. Inkubować w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 przez 18 dni, aż do dnia 32. Zmieniaj podłoże co 3 dni.

5. Charakterystyka produktów pochodzących z iPSC

UWAGA: Po różnicowaniu, scharakteryzuj pochodne ludzkich iPSC za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR), immunocytochemii (ICC), testów immunoenzymatycznych (ELISA) i testów mechanicznej stymulacji rozciągania, odpowiednio.

  1. Pobieranie komórek, ekstrakcja całkowitego RNA, odwrotna transkrypcja i ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
    1. Pobrać próbki komórek (procedury 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie odwirować przy 280 x g przez 3 minuty.
    2. Usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić w 350 μl buforu do lizy RNA, dostarczonego przez odpowiedni zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA.
    3. Za pomocą zestawu należy wyekstrahować całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta.
    4. Odwrotna transkrypcja wyizolowanego 1 μg całkowitego RNA do cDNA, zgodnie z protokołem producenta.
    5. Wykonaj RT-qPCR przy użyciu odpowiednich enzymów, odczynników i starterów zgodnie z protokołem producenta. Sekwencje starterów użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 2.
  2. Immunocytochemia (ICC)
    1. Przed wykonaniem immunocytochemii z przeciwciałami utrwalić komórki 2% paraformaldehydem w temperaturze 4 °C przez 10 minut i dwukrotnie przemyć PBS.
    2. W celu permeabilizacji inkubować z 0,2% metanolem lub 0,2% polisorbatem 20/PBS (zwanym dalej PBS-T) w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    3. Usunąć odczynniki do permeabilizacji i poddać komórki działaniu odpowiedniego buforu blokującego lub 1% albuminy surowicy bydlęcej/PBS w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
    4. Dodać pierwsze przeciwciało rozcieńczone 10% buforem blokującym w PBS-T i umieścić na noc w maszynie do wytrząsania w temperaturze 4 °C.
    5. Umyć trzykrotnie PBS-T (dodać PBS-T i umieścić na wytrząsarce w temperaturze RT na 10 min).
    6. Dodać drugie przeciwciało, rozcieńczone 10% buforem blokującym w PBS-T i umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 60 minut. Pierwsze i drugie przeciwciała przeciwko ICC użyte w tym badaniu wymieniono w tabeli 3.
      nuta: Począwszy od tego etapu, chroń talerz/naczynie przed światłem, zawijając je w folię.
    7. Umyj dwukrotnie za pomocą PBS-T.
    8. W celu barwienia przeciwprądowego dodać 1/5000 DAPI rozcieńczonego PBS i umieścić na wytrząsarce w temperaturze RT na 5 minut.
    9. Usuń roztwór DAPI i dodaj PBS do każdej studzienki.
    10. Obserwuj barwienie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Alternatywnie talerz/naczynie można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Test immunoenzymatyczny (ELISA) do analizy funkcjonalnej D
    pochodzącego z iPSC UWAGA:     Ludzkie komórki fibroblastów skóry (HDF) są dostępne w handlu. Posiew HDF w DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (patrz Tabela 1).
    1. Wysiew 1,0 x 105 komórek D i HDF pochodzących z iPSC na 24-dołkowych płytkach zawierających 1 ml każdej pożywki hodowlanej (pożywka indukcyjna D: D, HDF: DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą).
    2. Po 3 dniach hodowli komórek należy zebrać 100 μl każdej pożywki, umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Wykonaj szereg procedur, takich jak dodawanie przeciwciał wykrywających i przeciwciał drugorzędowych, zgodnie z instrukcją producenta, i określ ilościowo liczbę celów, generując krzywą wzorcową w zależności od stężenia próbek analitu kontrolnego.
  4. Test mechanicznej stymulacji rozciągania do analizy funkcjonalnej SYN
    pochodzącego z iPSC UWAGA:     Dorosłe ludzkie tenocyty są dostępne w handlu (patrz Tabela materiałów). Hodowla ludzkich SYN pochodzących z iPSC i tenocytów dorosłego człowieka na urządzeniu do rozciągania komórek w celu wykonania testu mechanicznej stymulacji rozciągania, jak opisano poniżej18,19. Użyj pożywki indukcyjnej SYN-2 i pożywki wzrostowej tenocytów (patrz tabela materiałów) jako pożywki hodowlanej odpowiednio dla każdego tenocytów SYN pochodzącego z iPSC i dorosłego człowieka.
    1. Po 24 godzinach przed rozciąganiem rozszczepić 1,0 x 105 komórek SYN pochodzących z iPSC i ludzkich tenocytów na pokrytych roztworem ECM wielodołkowych komorach z kauczuku silikonowego, z których każda ma powierzchnię hodowli 1,5 cm x 1,5 cm (patrz tabela materiałów).
    2. Ustaw komory na urządzeniu do rozciągania komórek i wymuszaj jednoosiowe cykliczne odkształcenie (0,5 Hz, 5%) przez 12 godzin.
    3. W celu ekstrakcji całkowitego RNA dodać 350 μl buforu do lizy RNA, a następnie zeskrobać i zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml w celu ekstrakcji całkowitego RNA, a następnie analizy RT-qPCR (patrz procedura 5.1).

Wyniki

Wszystkie rysunki w niniejszym raporcie zostały wykonane z użyciem iPSC 201B7-PAX3-GFP, w których EGFP zastępuje jeden allel sekwencji kodującej PAX3 w eksonie 1. Utworzenie iPSC 201B7-PAX3-GFP zostanie opisane w innej publikacji (H. Sakurai, komunikacja osobista). Istotność statystyczną oceniono przy użyciu oprogramowania statystycznego. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za istotne.

Charakterystyka ludzkich komórek PSM i SM pochodzących z iPSC
Aby ocenić różnicowanie ludzkich iPSC w kierunku SM poprzez stan PSM (Rysunek 2A), przeprowadzono analizę FACS, analizę ICC oraz analizę RT-qPCR. Jak pokazano na Rysunku 2B, po 4 dniach indukcji PSM z ludzkich iPSC ponad 85% komórek było pozytywnych w kierunku DLL1, markera PSM, ale negatywnych w kierunku PAX3, markera SM. Następnie, po 4 dniach indukcji SM, populacja ta stała się komórkami SM pozytywnymi w kierunku PAX3. Przejście PSM-SM potwierdzono również za pomocą ICC (Rysunek 2C) i RT-qPCR (Rysunek 2D). Markery PSM: TBX6, MSGN1 i WNT3A były ekspresjonowane w stanie PSM (dzień 4), ale nie były ekspresjonowane w stanie SM (dzień 8). Markery SM: PARAXIS, MEOX1 i PAX3 były ekspresjonowane w SM, ale nie w PSM. Ponadto barwienie CDH11, markera uprzestroniczonego SM, kumulowało się wyłącznie w złączach międzykomórkowych po dodaniu SB431542 wraz z CHIR99021 (Rysunek 2E).

Charakterystyka pochodnych SM indukowanych z ludzkich komórek SM pochodzących z iPSC
Aby ocenić potencjał różnicowania ludzkich komórek SM pochodzących z iPSC, oceniono różnicowanie w kierunku DM, MYO, D, SCL oraz SYN (Rysunek 3A) za pomocą analizy ICC i fluorescencji PAX3 (GFP). Jak pokazano na Rysunku 3B, różnicowanie DM potwierdzono barwieniem ALX4 i EN1 oraz fluorescencją PAX3 (GFP); różnicowanie MYO potwierdzono barwieniem MYOD, MYOG i ciężkiego łańcucha miozyny (MHC); różnicowanie D potwierdzono barwieniem EN1 i PDGFRa; różnicowanie SCL potwierdzono barwieniem PAX1, PAX9 i NKX3.2; a różnicowanie SYN potwierdzono barwieniem SCX, MKX, COL1A1 i COL1A2.

Charakterystyka indukowanych D i SYN
1. Test ELISA do analizy funkcjonalnej D pochodzących z iPSC
W organizmie człowieka jedną z głównych funkcji fibroblastów skóry właściwej jest wydzielanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takich jak kolagen i kwas hialuronowy, które nawilżają skórę i pomagają utrzymać jej strukturę. Aby wykazać, że w pożywce hodowlanej D pochodzących z iPSC oraz HDF wydzielano porównywalną ilość kolagenu typu 1 i białek kwasu hialuronowego, przeprowadzono test ELISA, jak pokazano na Rysunku 4A.

2. Test stymulacji rozciąganiem mechanicznym do analizy funkcjonalnej SYN pochodnych z iPSC
Jak zgłoszono w kilku badaniach, stymulacja mechaniczna wpływa na rozwój ścięgien przed i po urodzeniu oraz promuje różnicowanie tenocytów z komórek prekursorowych18,19. Z tego względu wiadomo, że reaktywność na stres mechaniczny jest jedną z charakterystyk tenocytów. Aby wykazać porównywalną reaktywność ludzkich SYN pochodnych z iPSC i ludzkich dorosłych tenocytów, przeprowadzono test stymulacji rozciąganiem mechanicznym, jak pokazano na Ryc. 4B.

figure-results-1
Rycina 1: Schematyczny widok hierarchicznego różnicowania mezo-dermy paraksjalnej. Mezoderma presomityczna to populacja komórek, która pojawia się przejściowo podczas wczesnej embriogenezy i ulega segmentacji w celu utworzenia somitów. Somity stanowią przejściową populację komórek macierzystych, z których powstaje wiele typów komórek, takich jak komórki sklerotomu, dermomiotomu, syndetomu, dermatomu i miotomu, które ostatecznie różnicują się w komórki ścięgien/więzadeł, kości/chrząstki, mięśni szkieletowych oraz skóry właściwej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Analiza FACS, RT-qPCR i ICC ludzkich komórek PSM i SM pochodzących z iPSC. (A) Schematyczny widok protokołu różnicowania SM poprzez PSM. (B) Reprezentatywny wykres kropkowy barwienia DLL1 i fluorescencji PAX3 (GFP) w 4. dniu indukcji PSM oraz w 4. dniu (8. dzień od iPSC) indukcji SM. (C) Reprezentatywne obrazy immunocytochemiczne i fluorescencja PAX3 (GFP) w 4. dniu indukcji PSM oraz w 4. dniu (8. dzień od iPSC) indukcji SM. Komórki barwiono przeciwciałami anty-TBX6, PARAXIS i MEOX1 (czerwony) oraz współbarwiono DAPI (niebieski) lub wykrywano za pomocą fluorescencji PAX3 (GFP) (zielony). (D) Analiza RT-qPCR markerów PSM i SM w etapach iPSC, PSM i SM. Przedstawiono średnie ± błąd standardowy (S.E.) z trzech serii eksperymentów. (E) Reprezentatywne obrazy immunocytochemiczne w 4. dniu (8. dzień od iPSC) SM, hodowanych w warunkach S10I10 (połączenie SB431542 i IWR1, inhibitora sygnałowania WNT), S10 (SB431542) i S10C5 (połączenie SB431542 i CHIR99021). Komórki barwiono przeciwciałem anty-CDH11 (czerwony) oraz współbarwiono DAPI (niebieski). iPS, indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta; PSM, mezoderma presomityczna; SM, somity; S10, SB431542 10 μM; C5, CHIR99021 5 μM; I10, IWR1 10 μM; Paski skali = 50 μm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Nakajima i wsp. (2018)15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza ICC dla DM, MYO, D, SCL i SYN zróżnicowanych z ludzkich iPSC-pochodnych SM. (A) Schematyczne przedstawienie protokołów różnicowania pochodnych SM. (B) Reprezentatywne obrazy immunocytochemiczne i fluorescencja PAX3 (GFP) w dniu 3 (dzień 11 od iPSC) indukcji DM, dniu 30 (dzień 41 od iPSC) indukcji MYO, dniu 9 (dzień 20 od iPSC) indukcji D, dniu 3 (dzień 11 od iPSC) indukcji SCL oraz dniu 21 (dzień 32 od iPSC) indukcji SYN. DM, komórki barwiono przeciwciałami anty-ALX4 i EN1 (czerwony) oraz współbarwiono DAPI (niebieski) lub wykrywano za pomocą fluorescencji PAX3 (GFP) (zielony); MYO, komórki barwiono przeciwciałami anty-MYOD, MYOG (czerwony) i MHC (cyjan), a także współbarwiono DAPI (niebieski); D, komórki barwiono przeciwciałami anty-EN1 (czerwony) i PDGFRa (cyjan) oraz współbarwiono DAPI (niebieski); SCL, komórki barwiono przeciwciałami anty-PAX1, PAX9 i NKX3.2 (czerwony) oraz współbarwiono DAPI (niebieski); SYN, komórki barwiono przeciwciałami anty-SCX, MKX, COL1A1 i COL1A2 (czerwony) oraz współbarwiono DAPI (niebieski). DM, dermomiotom; MYO, miotom; D, dermatom; SCL, sklerotom; SYN, syndetom; Paski skali = 50 μm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Nakajima et al. (2018)15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza funkcjonalna indukowanych D i SYN. (A) Ilość kolagenu typu 1 oraz kwasu hialuronowego w pożywce hodowlanej przeanalizowano metodą ELISA. (B) Wpływ stymulacji rozciąganiem mechanicznym na indukowane SYN oraz ludzkie dorosłe tenocyty oceniono za pomocą RT-qPCR. Przedstawiono średnie ± błąd standardowy (S.E.) z trzech serii eksperymentów. *p < 0.05; **p < 0.01; *** p < 0.001 testem t Dunnetta dla porównań wielokrotnych w odniesieniu do grupy Stretch (-); n.s, brak istotności statystycznej, HDF, ludzkie dorosłe fibroblasty skóry. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Nakajima et al. (2018)15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pożywka/roztwórOdczynnikStężenie
podłoże podstawowe CDMmodyfikowana pożywka Dulbecco’s/Ham’s F12 według Iscove’a1:1
Penicylina/Streptomycyna0.5 %
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy1 %
Apotransferyna15 mg/ml
Monotioglicerol450 mM
Serylowa albumina bydlęca5 mg/ml
Insulina7 mg/mL
roztwór CTKWoda-
Trypsyna0.25 %
Kolagenaza IV0,1 mg/ml
Chlorek wapnia1 mM
Nokaut SR20 %
pożywka indukcyjna Dpodłoże podstawowe CDM-
CHIR990215 µM
BMP410 ng/mL
pożywka indukująca DMpodłoże podstawowe CDM-
CHIR990215 µM
BMP410 ng/mL
roztwór ECMSztuczna macierz pozakomórkowa0,3 mg/ml
DMEM/F12-
bufor FACSPBS-
Seryjowa albumina wołowa0.1 %
Bezzasilaczowe pożywka do hodowli komórekmTeSR1-
Penicylina/Streptomycyna0.5 %
pożywka do hodowli HDFDMEM-
Płodowa surowica bydlęca10 %
pożywka do hESCPoziomka dla naczyń ES naczelnych-
Penicylina/Streptomycyna0.5 %
FGF24 ng/mL
pożywka indukująca MYOpodłoże podstawowe CDM-
CHIR990215 µM
pożywka indukcyjna PSMpodłoże podstawowe CDM-
SB43154210 µM
CHIR9902110 µM
DMH12 µM
FGF220 ng/mL
pożywka indukcyjna SCLpożywka podstawowa CDM-
SAG100 nM
LDN1931890.6 µM
pożywka indukcyjna SMpodłoże podstawowe CDM-
SB43154210 µM
CHIR990215 µM
pożywka indukcyjna SYN-1podłoże podstawowe CDM-
FGF820 ng/mL
pożywka indukcyjna SYN-2podłoże podstawowe CDM-
BMP710 ng/mL
TGFβ310 ng/mL

Tabela 1: Składy pożywek i roztworów.

NAZWAForwardReverse
ACTBCACCATTGGCAATGAGCGGTTCAGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
COL1A1GGACACAGAGGTTTCAGTGGTGCACCATCATTTCCACGAGC
MEOX1GAGATTGCGGTAAACCTGGAGAACTTGGAGAGGCTGTGGA
MSGN1GGAGAAGCTCAGGATGAGGAGTCTGTGAGTTCCCCGATGT
PARAXISTCCTGGAGAGCTGTGAGGATCACACCCTGTCACCAACAGT
PAX3AGGAAGGAGGCAGAGGAAAGCAGCTGTTCTGCTGTGAAGG
SCXCCCAAACAGATCTGCACCTTCGCGAATCGCTGTCTTTCTGTC
TBX6AGCCTGTGTCTTTCCATCGTAGGCTGTCACGGAGATGAAT
TNMDCCCTTCATGCTGAAGCCACTTCTCACTTTCAGCAGAATTGGGG
WNT3ACAAGATTGGCATCCAGGAGTATGAGCGTGTCACTGCAAAG

Tabela 2: Sekwencje starterów do analizy RT-qPCR.

Stężenie
1.
Przeciwciało		ALX4_Koza1/50
CDH11_Mysz1/1000
COL1A1_Królik1/100
COL2A1_Mysz1-2 μg/mL
EN1_Królik1/50
MEOX1_Królik1/50
MHC_Królik1/200
MKX_Królik1/50
MYOD_Królik1/500
MYOG_mysz1/400
NKX3.2_Królik1/50
PARAXIS_Królik1/50
PAX1_Królik1/50
PAX9_Królik1/50
PDGFRa_Koza1/100
SCX_Królik1/50
TBX6_Koza1/50
2.
Przeciwciało		przeciwciało wtórne osioł anty-kozia IgG(H+L) 5551/500
wtórne przeciwciało osioł anty-kozia IgG(H+L) 6471/500
kozi przeciwciało wtórne anty-mysie IgG(H+L) 5551/500
wtórne przeciwciało kozie przeciwko królikiemu IgG(H+L) 5551/500
wtórne przeciwciało kozie anty-królicze IgG(H+L) 6471/500

Tabela 3: Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe do ICC.

Dyskusja

Dobrze znaną metodą indukcji SM pochodzącego z PSC przez PSM jest połączenie CHIR99021 + A83-01 (inhibitor TGFβ) podczas indukcji PSM z PSC, ale nie podczas procesu dojrzewania PSM6. W niniejszym badaniu sygnalizacja WNT / beta-kateniny została zahamowana za pomocą C59 w celu indukcji SM z PSM. Wprowadziliśmy jednak zastosowanie CHIR99021 do aktywacji szlaku WNT podczas różnicowania SM. Decyzja ta została podjęta na podstawie stwierdzenia, że kilka WNT ulega ekspresji w otaczających tkankach SM oraz biorąc pod uwagę fakt, że reportery WNT są aktywne w SM20. W rezultacie zaobserwowaliśmy nabłonkowanie, charakterystyczne dla SM in vivo, tylko w warunkach z CHIR99021, w oparciu o akumulację CDH11 w połączeniach komórka-komórka (ryc. 2E). Ta obserwacja wskazuje na krytyczne zaangażowanie sygnalizacji WNT podczas różnicowania PSM i nabłonkowania SM, dlatego nasz protokół może lepiej podsumować endogenne środowisko sygnalizacyjne. Jednak oznacza to również dalszą możliwość dostrojenia szlaku sygnałowego WNT / beta-kateniny podczas różnicowania, ponieważ wytrzymałość i skuteczność różnicowania może się znacznie różnić w zależności od typów komórek, linii komórkowych i różnych związków chemicznych induktorów WNT używanych przez każdego badacza.

Ta metoda pozwala nam również wygenerować wszystkie cztery pochodne SM, MYO, D, SCL i SYN, z ludzkich iPSC. Nasze protokoły krokowe wykorzystujące CDM mogą być wykorzystane do identyfikacji wymagań sygnalizacyjnych podczas ludzkiej somitogenezy/wzorca somitów i dostarczają ważnych informacji na temat rozwoju SM u ludzi. Na przykład, nasze metody mogą być przydatne do badania mechanizmów zegara segmentacyjnego, systemu oscylacji molekularnej, który reguluje powstawanie SM. Został dokładnie przebadany na myszach, pisklętach i danio pręgowanym, ale nie na ludziach ze względu na brak odpowiednich narzędzi eksperymentalnych.

Co więcej, nasza metoda może znaleźć zastosowanie w przyszłych klinicznych terapiach komórkowych. Na przykład ludzki D lub SYN pochodzący z iPSC może zostać przeszczepiony do poważnie uszkodzonej skóry lub zerwanych ścięgien w celu regeneracji i leczenia. Jednak zanim ta metoda będzie mogła być praktycznie zastosowana, należy rozwiązać kilka ograniczeń. Chociaż w niniejszym badaniu użyliśmy komórek zasilających SNL do utrzymania iPSC i roztworu ECM, który jest ekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm, jako powłoka powierzchniowa na szalce podczas indukcji, te odczynniki pochodzenia zwierzęcego niepochodzące od ludzi powinny zostać usunięte w celu poprawy jakości klinicznej. Ponadto należy również poprawić ilość i jakość komórek, w tym czystość i dojrzewanie pożądanych komórek. Co więcej, nie tylko liczba komórek, ale także siła komórek jest ważną cechą regeneracji ścięgien/więzadeł. Ponadto opracowanie markerów powierzchniowych do oczyszczania i nowatorskiej metody rekonstytucji 3D jest niezbędne do rozwoju naszych protokołów klinicznych terapii opartych na komórkach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Junya Toguchida (CiRA) za pomoc w administrowaniu projektem i pozyskiwaniu funduszy, Panu Mitsuaki Shibata (CiRA) i Pani Mei Terashima (CiRA) za pomoc techniczną, Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) i Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) za korektę manuskryptu, oraz Panu Masaya Todani (CiRA) za dostarczenie ilustracji (Rysunek 1). Dziękujemy również wszystkim członkom laboratoriów Ikeya i Toguchida (CiRA) za ich wsparcie podczas tego badania. Praca ta była wspierana przez granty na badania naukowe z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) (26670661), Program Badań nad Chorobami Nieuleczalnymi z wykorzystaniem komórek iPS specyficznych dla choroby z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) oraz Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED), Główne Centrum Badań nad Komórkami iPS Sieci Ośrodków Badawczych na rzecz Realizacji Medycyny Regeneracyjnej (JST/AMED), oraz Fundusz Badań nad Komórkami iPS (częściowo dla Makoto Ikeya i Junya Toguchida). Makoto Ikeya otrzymał również wsparcie w ramach programu Grants-in-aid for Scientific Research (JSPS) (16H05447) oraz Acceleration Program for Intractable Diseases Research z wykorzystaniem komórek iPS specyficznych dla choroby (AMED).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ALX4_Goat przeciwciałoSantacruzsc-22066
Apo-transferynaSigmaT1147
BMP4R& D314-BP-010
BMP7R& D354-BP-010
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA8806
Chlorek wapniaNacalai tesque067730-15
Przeciwciało CDH11_MouseSygnalizacja komórkowa13577
Urządzenie do strechingu komórekStrexSTB-140
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyGibco11905-031
CHIR99021Przeciwciało COL1A1_Rabbit Axon1386
Przeciwciało Abcamab34710
COL2A1_Mouse ThermoscientificMS-235
Kolagenaza IVThermofisher17104019
DLL1 Przeciwciało APC-conjugated_MouseR& DFAB1818ADla FACS
DMEMSigmaD6046
DMEM / F12Gibco11320-082
DMH1Tocris4126
EN1_Rabbit przeciwciałoAbcamab70993
Płodowa surowica bydlęcaNichirei171012
FGF2Wako060-04543
FGF8Peprotech100-25
Ludzki fibroblast skórnyZastosowania komórkowe160-05a
Ludzki tenocytAngio proteomiacAP-0041
Insulina Wako090-06474
Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s średni/Szynka" s F12Gibco21056023
Knockout SRGibco10828028
LDN193189Axon1509
MatrigelBD bioscience354230Sztuczna macierz zewnątrzkomórkowa
MEOX1_Rabbit przeciwciałoAbcamab75895
MHC_Rabbit przeciwciałoSantacruzsc-20641
Przeciwciało MKX_RabbitPrzeciwciała AtlasA83377
MonotioglycerolSigmaM6145
mTeSR1Stemcell tech85850
Wielodołkowa komora z gumy silikonowejStrexSTB-CH-4W
MYOD_Rabbit przeciwciałoAbcamab133627
MYOG_Mouseprzeciwciało Santacruzsc-12732
NKX3.2_Rabbit przeciwciałoSigmaHPA027564
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko koziej IgG(H+L) Novex Donkey555InvitrogenA21432
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko kozom IgG(H+L) Novex Donkey647InvitrogenA21447
Przeciwciało drugorzędowe Novex Goat anty mysie IgG(H+L)555InvitrogenA21422
Przeciwciało drugorzędowe Novex Goat przeciwko królikowi IgG(H+L)555 Przeciwciało drugorzędoweInvitrogenA21428
Przeciwciało drugorzędowe Novex Goat przeciwko IgG(H+L)647Przeciwciało PARAXIS_Rabbit InvitrogenA21245
Santacruzsc-98796
PAX1_RabbitAbcamab95227
PAX9_Rabbit przeciwciałoGene texGTX104454
PBS--PDGFRa_Goat
R& DAF307
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-122
Pożywka dla komórek ES naczelnychReprocellRCHEMD001
SAGCalbiochem566661
SB431542SelleckchemPrzeciwciało SCX_Rabbit
Abcamab58655
TBX6_GoatR& DAF4744
Pożywka do wzrostu komórek ścięgnistychAngio-proteomiacAP-40Pożywka wzrostowa tenocytów
TGF i beta; 3R& D243-B3-200
TrypsynaGibco15090046
Przeciwciało drugorzędowe przeciwciało

Bibliografia

  1. Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), e61540(2013).
  2. Sakurai, H., et al. In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), e47078(2012).
  3. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocl. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  4. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
  5. Umeda, K., et al. Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 2, 455(2012).
  6. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  7. Xi, H., et al. In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Reports. 18 (6), 1573-1585 (2017).
  8. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  9. Tam, P. P., Beddington, R. S. The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development. 99 (1), 109-126 (1987).
  10. Aulehla, A., Pourquie, O. Signaling gradients during paraxial mesoderm development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a000869(2010).
  11. Christ, B., Scaal, M. Formation and differentiation of avian somite derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 638, 1-41 (2008).
  12. Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
  13. Sakurai, H., et al. Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium. Stem Cell Research. 3 (2-3), 157-169 (2009).
  14. Zhao, J., et al. Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells. Development. 141 (20), 3848-3858 (2014).
  15. Nakajima, T., et al. Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells. Development. 145 (16), (2018).
  16. McMahon, A. P., Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell. 62 (6), 1073-1085 (1990).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Suzuki, H., et al. targeting of the transcription factor Mohawk in rats causes heterotopic ossification of Achilles tendon via failed tenogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7840-7845 (2016).
  19. Marturano, J. E., Arena, J. D., Schiller, Z. A., Georgakoudi, I., Kuo, C. K. Characterization of mechanical and biochemical properties of developing embryonic tendon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6370-6375 (2013).
  20. Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukcja mezodermy presomitycznejizolacja metod cytometrii przep ywowejanaliza immunocytochemicznawarunki chemicznie zdefiniowanemarker bia ka Delta like 1detekcja fluorescencyjna PAX3protok r nicowania syndetomuprodukcja kolagenu przez dermatom
Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.