Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Summary

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Abstract

Kurczliwość komórkowa jest niezbędna w różnych aspektach biologii, napędzając procesy od ruchliwości i podziału, po kurczenie się tkanek i stabilność mechaniczną, i stanowi kluczowy element wielokomórkowego życia zwierząt. W komórkach przylegających skurcz aktoomiozyny obserwuje się w siłach trakcyjnych, które komórki wywierają na swoje podłoże. Rozregulowanie kurczliwości komórek pojawia się w niezliczonych patologiach, co sprawia, że kurczliwość jest obiecującym celem w różnych podejściach diagnostycznych wykorzystujących biofizykę jako metrykę. Co więcej, nowe strategie terapeutyczne mogą opierać się na korygowaniu pozornej nieprawidłowej kurczliwości komórek. Zastosowania te wymagają jednak bezpośredniego określenia ilościowego tych sił.

Opracowaliśmy mikroskopię siły trakcyjnej (TFM) na bazie elastomeru silikonowego w równoległym formacie wielodołkowym. Zastosowanie kauczuku silikonowego, a konkretnie polidimetylosiloksanu (PDMS), zamiast powszechnie stosowanego hydrożelu poliakryloamidu (PAA), umożliwia nam wytwarzanie wytrzymałych i obojętnych podłoży o nieograniczonych terminach przydatności do spożycia, które nie wymagają specjalistycznych warunków przechowywania. W przeciwieństwie do podejść opartych na filarze PDMS, które mają moduł w zakresie GPa, zastosowany tutaj PDMS jest bardzo zgodny, w zakresie od około 0,4 kPa do 100 kPa. Tworzymy platformę o wysokiej przepustowości dla TFM, dzieląc te duże monolityczne podłoża przestrzennie do biochemicznie niezależnych studzienek, tworząc wielodołkową platformę do przesiewania siły pociągowej, która jest kompatybilna z istniejącymi systemami wielodołkowymi.

W tym manuskrypcie używamy tego wielodołkowego systemu siły trakcyjnej do badania przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT); indukujemy EMT w komórkach NMuMG poprzez wystawienie ich na działanie TGF-β, oraz do ilościowego określenia zmian biofizycznych podczas EMT. Kurczliwość mierzymy w funkcji stężenia i czasu trwania ekspozycji na TGF-β. Nasze odkrycia pokazują użyteczność równoległego TFM w kontekście biofizyki chorób.

Introduction

Kurczliwość akto-miozyny jest niezbędnym elementem aktywnej mechaniki komórek, wpływając na zachowanie komórek, od ruchliwości i proliferacji po różnicowanie komórek macierzystych. W tkankach kurczliwość napędza aktywność od separacji biegunowej w embriogenezie, do zwężenia dróg oddechowych i aktywności serca. Krytycznie, aby wytworzyć napięcie, komórki muszą najpierw przylegać do swojego środowiska zewnątrzkomórkowego. W ten sposób ta kurczliwość generuje siły trakcyjne na ich otoczenie. Mikroskopia sił trakcyjnych (TFM) pojawiła się w wielu formach jako sposób na ilościowe określenie tych sił z różnych komórek w różnych warunkach.

Dziedzina TFM doczekała się wyjątkowego zakresu innowacji i zastosowań, a wyniki utorowały drogę dla nowych perspektyw w biologii, które obejmują mechanikę i siły fizyczne. Zaczynając od marszczonych substratów silikonowych¹, naukowcy zastosowali różne techniki do pomiaru sił ciągnięcia komórek. Podejścia te były stale ulepszane i obecnie osiągnęły poziom rozdzielczości rzędu kilku mikronów². Pojawił się jednak jeden zasadniczy problem, jakim jest trudność w tworzeniu podłoży o odpowiednio niskich modułach przy użyciu dostępnych silikonów. Aby obejść ten problem, poliakrylamid został przyjęty jako zamiennik ze względu na łatwość tworzenia podłoży rzędu 1-20 kPa³. Niedawno wdrożyliśmy bardzo zgodne silikony w TFM⁴, co pozwoliło nam wytwarzać ten sam zakres modułów co poliakrylamid, ale z zaletami obojętnego i wytrzymałego silikonu.

Podejścia TFM umożliwiły cenne odkrycia mechano-biologiczne, jednak uporczywym mankamentem jest ich złożoność, często ograniczająca ich zastosowanie do badaczy z dyscyplin inżynieryjnych lub fizycznych. Wynika to w dużej mierze ze szczegółowych kalibracji i trudnych obliczeń, które są wymagane do ilościowego określenia kurczliwości. Innym istotnym wyzwaniem jest to, że metody TFM są w dużej mierze niskoprzepustowe, a zatem nie nadają się do jednoczesnego badania wielu różnych schorzeń lub populacji⁵. Stworzyło to wąskie gardło, które utrudniło transfer TFM ze specjalistycznego środowiska biofizycznego do szerszych zastosowań biologicznych i farmakologicznych.

Niedawno opracowaliśmy wielodołkową płytkę TFM, która pozwala badaczom na równoległe pomiary TFM w celu szybszej kwantyfikacji wskaźników kurczliwości, jednocześnie badając wpływ różnych związków i zużywając mniej odczynników⁴. Metodologia ta ma szerokie zastosowanie w różnych badaniach mechanobiologicznych, od oceny wpływu związków na aktywność komórkową, po ilościowe określanie zmian kurczliwości w różnicowaniu lub chorobie.

Jednym z obszarów badań biomedycznych, który bardzo skorzysta z TFM, jest badanie wpływu fizycznych sygnałów na złośliwe fenotypy komórek nowotworowych. Przerzuty, odpowiedzialne za 90% zgonów związanych z rakiem, charakteryzują się tym, że komórki rakowe opuszczają swoje pierwotne miejsce guza i kolonizują miejsce wtórne. Aby komórki mogły migrować przez tkankę i przechodzić do i z układu naczyniowego, muszą radykalnie zmienić swoje kształty, aby przecisnąć się przez te fizyczne bariery, generując jednocześnie znaczne siły, które ciągną się wzdłuż macierzy zewnątrzkomórkowej lub przemieszczają się między innymi komórkami. Siły te są przenoszone na podłoże poprzez ogniskowe interakcje adhezyjne^2,3 i można je określić ilościowo za pomocą TFM. Chociaż nowotwory są biochemicznie wyjątkowo zróżnicowane, z rosnącym repertuarem znanych mutacji i zmian w białkach, zaobserwowano pewne powszechne zmiany fizyczne; Wykazano, że w różnych nowotworach, w tym raku piersi, prostaty i płuc, komórki przerzutowe wywierają 2-3 razy większe siły pociągowe niż komórki bez przerzutów^6,7,8. Wyniki te sugerują, że może istnieć silna korelacja między progresją przerzutów a siłami trakcyjnymi wywieranymi przez komórki; Jednak szczegółowe, zależne od czasu zmiany kurczliwości są trudne do zbadania.

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) to proces, w którym komórki redukują adhezję komórka-komórka za pośrednictwem przylegania i ścisłego połączenia, stając się bardziej migrujące i inwazyjne. Oprócz funkcji fizjologicznych, które obejmują gojenie się ran i procesy rozwojowe, EMT jest również procesem wykorzystywanym podczas przerzutów, co czyni go użytecznym systemem modelowym do badania tego procesu. Korzystając z TGF-β, możemy indukować EMT w mysich komórkach nabłonka sutka (NMuMG) ⁹, aby bezpośrednio określić ilościowo zmiany fizyczne podczas tej transformacji i scharakteryzować zależne od czasu i dawki efekty TGF-β na EMT i kurczliwość komórek. W tym artykule pokazujemy użyteczność tego podejścia, mierząc zmiany kurczliwości podczas indukowanego EMT.

Protocol

UWAGA: Poniższy protokół pomoże badaczom w wytwarzaniu i używaniu wielodołkowej płytki TFM pokazanej w Rysunek 1.

1. Przygotowanie podłoży silikonowych PDMS

1. Przygotowanie mieszanki kauczuku silikonowego PDMS na bazie mieszanki kompozytowej dwóch dostępnych na rynku zestawów.
   1. Dodaj część A i część B zestawu PDMS (np. GEL-8100, patrz tabela materiałów) w stosunku wagowym 1:1 do probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Mieszaninę miesza się na rotatorze z prędkością wystarczająco wolną, aby mieszanina przepływała tam iz powrotem podczas obrotu, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
   2. Dodać wymaganą ilość utwardzacza dla pożądanego modułu podłoża.
      UWAGA: Ilość utwardzacza, którą należy dodać do mieszaniny, zależy od pożądanego modułu podłoża i może zwykle wynosić od 0,1% do 1,8%. Zapoznaj się z Tabelą 1 i Rysunek 3, aby zapoznać się z przewodnikiem po konkretnych stężeniach środków sieciujących i wynikających z nich modułach.
   3. Mieszaj preparat na rotatorze przez 30-45 minut; upewnij się, że obroty są wystarczająco wolne, aby można było dokładnie wymieszać.
2. Warstwa dolna: powlekanie podłoży PDMS na szkiełku
   1. Umieść specjalnie skonstruowany uchwyt wiertarski pokazany w Rysunek 2 na maszynie do powlekania. Wyczyść szklankę etanolem lub izopropanolem i osusz niestrzępiącą się chusteczką. Umieść szklane szkiełko w uchwycie i włącz podciśnienie, aby utrzymać szkiełko na miejscu.
   2. Nałóż nieutwardzony PDMS około 1 cm od krawędzi i wmasuj w kierunku środka. Nałóż wystarczającą ilość (3-4 ml) PDMS, aby upewnić się, że cała powierzchnia zostanie pokryta.
      UWAGA: Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie PDMS na powierzchni szkła, pomocna może być końcówka pipety do rozprowadzenia mieszaniny PDMS od środka do krawędzi.
   3. Odwirować szklankę z mieszaniną PDMS na wirowniku zgodnie z następującym protokołem.
      1. Aby rozprowadzić nieutwardzony PDMS na suwaku, przyspiesz z prędkością 50 obr./min od 0 do 200 obr./min; przytrzymaj przy 200 obr./min przez 1 min.
      2. Aby uzyskać warstwę PDMS o grubości 100 μm, przyspiesz z prędkością 50 obr./min do 300 obr./min i przytrzymaj przez 1 minutę przy 300 obr./min. Różne pożądane grubości inne niż 100 μm będą wymagały określonych wartości prędkości.
      3. Aby usunąć, zwolnij z 50 obr./min do 0 obr./min. Wyłącz odkurzanie i wyjmij powlekane szkiełko, uważając, aby nie dotknąć powlekanej powierzchni.
         UWAGA: Ważne jest, aby uwzględnić kroki przyspieszania i zwalniania, aby zapewnić gładką, ciągłą powierzchnię.
         UWAGA: Aby upewnić się, że próbka nie wyleci z uchwytu, do przytrzymania szkiełka należy użyć wykonanego na zamówienie uchwytu, a nie polegać tylko na próżni i istniejącym płaskim uchwycie. Szczegóły i specyfikacje tego uchwytu są podane w Rysunek 2.
   4. Umieścić wirującą próbkę w piecu w temperaturze zalecanej przez producenta (100 °C) przez 2 godz.
      UWAGA: Powierzchnia pieca, w której umieszcza się próbkę, powinna być solidna (tj. nie jest rusztem) i płaska powierzchnia, aby zapewnić równomierne nagrzewanie i grubość próbki. Płyta ceramiczna lub stalowa tworzy idealną powierzchnię.
3. Górna warstwa ściegu
   1. Dodać roztwór kulek w odpowiednim stosunku do pozostałej mieszaniny PDMS.
      UWAGA: Stosunek ten zależy od stężenia roztworu kulek podstawowych i pożądanej gęstości kulek w próbce. Typowe wartości końcowe to 9,2 x 10¹¹ kulek/ml i 0,05-0,2 kulek/μm², a nadmiar kulek jest na ogół lepszy niż nieodpowiednia ilość.
   2. Wymieszaj roztwór kulki z nieutwardzonym PDMS. Można to osiągnąć poprzez umieszczenie rurki na rotatorze na około 30 minut, wirowanie przez 1-2 minuty lub sonikację przez 30 minut. Metody te można łączyć.
      UWAGA: W naszej aplikacji stwierdzamy, że sonikacja jest skuteczna w rozbijaniu agregatów kulkowych, a rotacja jest skuteczna w mieszaniu. Zsyntetyzowane koraliki fiducjarne mogą gromadzić się w magazynie. Przed użyciem można je ponownie zawiesić w heksanie i poddać działaniu sonikacji. W przypadku znacznych dużych agregatów można przefiltrować zawiesinę kulek przez filtr strzykawkowy 5 μm. Ten etap filtracji jest opcjonalny; Pomaga pokryć próbkę monorozproszonymi kulkami, ale znaczna część kulek może zostać utracona w filtrze.
   3. Wyjmij szkiełko z piekarnika, pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej i umieść je na wirówce.
   4. Dodać 3-4 ml mieszaniny kulki i nieutwardzonej mieszaniny PDMS na powierzchnię powlekanej próbki.
      UWAGA: Mieszanina z dodanymi kulkami jest mniej lepka ze względu na heksan. Należy uważać, aby nie dotykać powierzchni podłoża, ponieważ może to spowodować uszkodzenie już pokrytego podłoża PDMS. Dodatkowo mieszanka ściegów może początkowo nie zwilżać powierzchni; należy uważać, aby mieszanina nie spływała natychmiast z utwardzonej powierzchni PDMS.
   5. Zakręć próbkę zgodnie z następującym protokołem.
      1. Aby rozprowadzić ścieg i nieutwardzoną mieszaninę PDMS, przyspiesz z prędkością 100 obr./min od 0 do 500 obr./min; przytrzymaj przy 500 obr./min przez 1 min.
      2. Aby uzyskać cienką warstwę PDMS zatopionego w kulkach (~1 μm), przyspiesz z prędkością 200 obr./min od 500 do 5000 obr./min; przytrzymaj przy 5000 obr./min przez 10 s.
      3. Aby usunąć, zwolnij od 100 obr./min do 0 obr./min. Wyłącz odkurzanie i zdejmij powlekane szkiełko, uważając, aby nie dotknąć powlekanej powierzchni.
   6. Umieścić wirującą próbkę w piecu w temperaturze 100 °C przez 1 godz.
      UWAGA: Temperatury powyżej 100 °C lub czas trwania dłuższy niż 1 godzina mogą zmniejszyć fluorescencję kulki. Upewnij się, że temperatura piekarnika jest ustawiona na 100 °C i nie wyższą.
   7. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Aby przechowywać próbkę, przykryj powierzchnię, aby uniknąć narażenia na kurz i światło. Upewnij się, że nic nie dotyka powierzchni. Próbka jest stabilna na półce w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.
4. Montaż płyty
   1. Do probówki o pojemności 50 ml dodać część A (baza) i część B (utwardzacz, np. Sylgard) zestawu elastomerów PDMS w stosunku wagowym 10:1.
   2. Mieszaj mieszaninę na rotatorze przez 30-45 min.
      UWAGA: Na jedną płytkę wymieszaj 5 ml bazy z 0,5 ml utwardzacza. Można dodać do 1 ml heksanu, aby zmniejszyć lepkość mieszaniny.
   3. Nałóż mieszaninę na dno przegrody i rozprowadź mieszaninę.
      UWAGA: Przegrodę należy ustawić do góry nogami.
   4. Połóż podłoże na przegrodzie do góry nogami.
   5. Umieścić próbkę do góry nogami w suszarce w temperaturze 65 °C na 2 godziny.
   6. Wyjmij próbki z piekarnika i wyczyść dno szklanki 70% etanolem lub izopropanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości PDMS.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Aby przechowywać próbkę, umieść pokrywkę na podłożu i owiń urządzenie folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Próbka jest stabilna na półce w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony. Dzielnik stosowany w tej metodzie jest w formacie 96-dołkowym; Badacze mogą jednak stosować inne formaty (384-dołkowe, 2-dołkowe, 4-dołkowe, 8-dołkowe itp.) w zależności od pożądanych konfiguracji eksperymentu i dostępności struktur dzielących. Może być wymagana dalsza optymalizacja.

2. Funkcjonalizacja powierzchni

1. Rozpuścić 80 μl podwielokrotności sulfo-SANPAH w 40 ml 0,1 M buforu HEPES (pH 7-9).
   UWAGA: Przygotować podwielokrotności Sulfo-SANPAH rozpuszczając 100 mg proszku Sulfo-SANPAH w 2 ml sterylnego dimetylosulfotlenku (DMSO). Przygotować 0,1 M bufor HEPES, rozcieńczając 50 ml HEPES w 450 ml sterylnej wody dejonizowanej i przefiltrować przez filtr porowy 0,22 μm.
2. Dodać 200 μl rozcieńczonego roztworu Sulfo-SANPAH do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
3. Wystaw płytkę na działanie światła UV (300-460 nm) w odpowiedniej odległości i czasie trwania.
   UWAGA: Po ekspozycji na promieniowanie UV kolor roztworu powinien być ciemniejszy. Odległość i czas trwania ekspozycji na promieniowanie UV zależą od mocy lampy UV. W naszej aplikacji naświetlamy na 10-15 min w odległości 5 cm.
4. Usuń roztwór Sulfo-SANPAH ze studzienek i dodaj 200 μl 5 μg/ml roztworu fibronektyny do każdej studzienki.
   UWAGA: Białko określone przez badacza może być używane do powlekania powierzchni. Niektóre powszechnie stosowane białka to kolagen, fibronektyna i laminina. Odkryliśmy, że Sulfo-SANPAH jest najskuteczniejszą metodą, a czyszczenie plazmowe, choć czasami stosowane w PDMS, jest odradzane, ponieważ tworzy warstwę dwutlenku krzemu i widocznie uszkadza powierzchnię.
5. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: W zależności od białka użytego do powlekania można zastosować różne metody inkubacji.
6. Usunąć roztwór fibronektyny i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
7. Nałożyć pokrywkę na próbkę.
8. Dodać 200 μl PBS do każdej studzienki.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki pokryte fibronektyną można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.

3. Sterylizacja UV

1. Sterylizuj próbkę w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 min.
   UWAGA: Dłuższe czasy ekspozycji na promieniowanie UV mogą negatywnie wpłynąć na fluorescencję koralików. Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach.

4. Hodowla komórkowa

1. Usunąć PBS z każdej studzienki i dodać 200 μl komórek zawieszonych w pożywkach hodowlanych do każdej studzienki.
   1. Pokryj komórki płytką o żądanej gęstości komórek. Gęstość komórek zależy od pożądanego eksperymentu. W przypadku badań jednokomórkowych komórki powinny być oddalone od siebie o co najmniej 50 μm, a komórki znajdujące się w pobliżu krawędzi okna obrazowania nie powinny być uwzględniane w pomiarze TFM. W przypadku komórek jednowarstwowych okno obrazowania powinno mieć pole widzenia pokryte zlewającą się warstwą komórek.
   2. Przygotuj kompletną pożywkę do hodowli wzrostu dla komórek NMuMG, uzupełniając DMEM 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg / ml insuliny, 1% penicyliny-streptomycyny, 1 mM L-glutaminy i 0,5 μg / ml amfoterycyny B.
   3. Przygotować zapas insuliny, rozpuszczając go w zakwaszonej wodzie (2,5 ml lodowatego kwasu octowego w 130 ml wody dejonizowanej) do stężenia 10 mg/ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C. Poczekaj, aż roztwór będzie klarowny, a następnie przefiltrować przez filtr porowy 0,22 μm.
2. Dodawanie TGF-β
   1. Aby przygotować wywar TGF-β, rozpuść 2 μg TGF-β w 100 μl 10 mM kwasu cytrynowego (pH 3,0) i wysterylizuj filtrem z porami 0,22 μm. Zwiruj probówkę i podwielokrotność do żądanych objętości. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
   2. Dodać 1,5 μl roztworu podstawowego TGF-β do 10 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych, aby utworzyć pożywkę do hodowli komórkowych o końcowym stężeniu TGF-β wynoszącym 3 ng/mL.
      UWAGA: Aby uzyskać 10 mM pH 3,0 kwasu cytrynowego, rozcieńczyć kwas w wodzie i dostosować pH do 3,0, dodając HCl.

5. Akwizycja danych

1. Dla każdej pozycji uzyskaj co najmniej jeden obraz cząstek i komórek odniesienia. Skoncentruj się na warstwie ściegu.
   UWAGA: Rozmiar piksela powinien być zoptymalizowany w oparciu o rozmiar cząstek odniesienia i używaną metodę przetwarzania obrazu. W tej aplikacji autorzy używają obiektywu 10x 0,4 NA, a obrazy pozyskiwane są w rozdzielczości 1024 x 1024, przy 455 nm/piksel. Ogólnie rzecz biorąc, pomocne jest zachowanie rozdzielczości co najmniej około 1-5 pikseli na koralik; Tutaj kulki są polidyspersyjne i mają indywidualny rozmiar 300-500 nm. Bardzo ważne jest, aby fluorescencyjne koraliki powiernicze były ostre dla obrazów, które mają być używane do obliczeń TFM. Ostrość i jakość obrazowania kulek powinny być traktowane priorytetowo niż obrazowanie samych komórek. Nie powinno być przesłuchów między różnymi kanałami, w szczególności fluorescencji spoza kulek powierniczych, która pojawia się w widmach obrazowania kulek.
2. Po zarejestrowaniu wszystkich interesujących pozycji dodaj roztwór odłączający do każdej studzienki, aby uzyskać wolne od siły obrazy referencyjne cząstek odniesienia.
   1. Aby przygotować roztwór do oddzielania komórek, należy zmieszać roztwór wodny zawierający 2% TritonX-100, 50 mM azydku sodu i 500 mM wodorotlenku potasu.
      UWAGA: Powyższe informacje są przedstawione jako przykład skutecznego rozwiązania do odłączania. Różne roztwory odłączania według uznania badaczy mogą być stosowane do odłączania komórek od powierzchni podłoża.

6. Analiza obrazu

1. Wykonaj odpowiednią analizę obrazu zgodnie z potrzebami.
   UWAGA: Oprogramowanie analityczne zostało opracowane wewnętrznie. Analiza obrazu może być wykonana za pomocą specjalnego oprogramowania lub oprogramowania dostępnego online.

7. Synteza koralików

UWAGA: Poniższy protokół jest oparty na metodzie syntezy opisanej przez Klein et al.¹⁰.

1. Pod wyciągiem przygotować kolbę z trzema szyjkami ze skraplaczem zwrotnym chłodzonym wodą.
   UWAGA: Ustawić syntezę w dobrze wentylowanym okapie oparów chemicznych.
2. Dodać 0,5 ml stabilizatora PDMS i fluoroforu do kolby.
3. Wyposaż jedną szyję w gumową przegrodę z igłą wlotową azotu i igłą wylotową, a drugą szyjkę wyposaż w gumową przegrodę do dodawania odczynnika za pomocą strzykawki.
4. Dodać 100 ml bezwodnego heksanu w 250 ml do kolby i dodać małe mieszadło magnetyczne.
5. Umieścić kolbę w łaźni oleju mineralnego w temperaturze 75 °C i przepłukać ją azotem gazowym przez 1 godzinę.
6. Dodać 6 ml metakrylanu metylu do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml.
7. Dodać 0,100 g 2,2'-azobisisobutyronitrylu (AIBN) do kolby okrągłodennej i przepłukać mieszaninę azotem gazowym przez 1 h.
   UWAGA: Przed użyciem przepłukać metakrylan metylu przez wstępnie zapakowaną kolumnę, aby usunąć inhibitory. Dodać mieszaninę metyloakrylanu i AIBN do kolby z trzema szyjkami.
8. Roztwór początkowo staje się mętny i zmienia kolor na mleczny. Pozwól reakcji toczyć się przez 3 godziny po tym, jak roztwór stanie się mętny.
9. Po 3 godzinach umieścić kolbę w lodowatej łaźni wodnej.
10. Przefiltruj próżniowo roztwór gruboziarnistą bibułą filtracyjną.
11. Odwirować filtrat i ponownie zawiesić cząstki w heksanie.
    UWAGA: Objętość dodawanego heksanu zależy od pożądanego stężenia roztworu kulki. Sonikacja ułatwia ponowne rozproszenie cząstek kulek w roztworze heksanu. Produkowane przez autorów kulki mają średnice polidyspersji około 300-500nm. Ze względu na zastosowanie śledzenia wzorca korelacji krzyżowej do określania przemieszczeń, koraliki monodyspersyjne nie są wymagane.

8. Protokół pomiaru reologii

UWAGA: Reologia nie jest wymagana dla każdego badacza czy eksperymentu, ale jest niezbędna do ilościowego określenia modułów dla nowych preparatów PDMS. W tym protokole stosujemy reometr ścinający do pomiaru wpływu środka sieciującego, częstotliwości i odkształcenia na moduły próbek PDMS. W zależności od dostępnych narzędzi i wiedzy specjalistycznej, moduły mogą być również mierzone przy użyciu wielu innych podejść do analizy mechanicznej. Dodatkowo, badacze korzystający z tego protokołu mogą zdecydować się na użycie opublikowanych przez nas modułów przedstawionych w Tabeli 1, Rysunek 3 i Rysunek 4.

1. Użyj reometru z równoległą geometrią płytki o średnicy 25 mm. Mogą być stosowane inne geometrie.
2. Zainicjuj system i skalibruj urządzenie oraz układ pomiarowy (płytka równoległa, d = 25 mm). Po zmierzeniu szczeliny zerowej rozpocznij ładowanie próbki PDMS.
3. Jak tylko elastomer PDMS i środek sieciujący zostaną wymieszane, odpipetuj mieszaninę na dolną płytkę reometru.
   1. Przesuń wrzeciono w dół, aby całkowicie zetknąć się z górną częścią próbki PDMS.
   2. Ostrożnie odciąć nadmiar załadowanej próbki od dolnej płyty.
4. W teście przemiatania odkształceń należy zastosować rosnące odkształcenia dla każdej kompozycji o różnej gęstości usieciowania, aby zapewnić, że struktura polimeru pozostanie w liniowym reżimie lepkosprężystym podczas wszystkich pomiarów ścinania.
   UWAGA: Wartości odkształceń istotne dla badań komórkowych mieszczą się zwykle w zakresie 0,1-10%. Odkryliśmy, że PDMS jest liniowy do około 100% odkształcenia.
5. Zmierzyć dynamiczny moduł magazynowania przy ścinaniu (G') i moduł stratności (G′′) sieci PDMS w teście przemiatania w czasie z częstotliwością 1 Hz i oscylacyjnym odkształceniem ścinającym 0,5% w temperaturze 100 °C.
6. Aby określić lepkosprężystość i zależność czasową końcowej sieci PDMS, należy zastosować test przemiatania częstotliwości z częstotliwością w zakresie 0,1-100 Hz i oscylacyjnym odkształceniem ścinającym 0,5%.

Results

Przed dodaniem TGF-β, zlewająca się monowarstwa komórek ma kształt przypominający bruk i jest ciasno upakowana. Po leczeniu TGF-β komórki stają się bardziej wydłużone pod względem morfologii, powiększając obszar komórki i uzyskując bardziej mezenchymalny fenotyp. Wykorzystując urządzenie wielodołkowe wykonane z miękkich elastomerów PDMS, zbadano właściwości fizyczne komórek w łącznie 17 różnych warunkach. Komórki potraktowano czterema różnymi stężeniami TGF-β (0,5, 1, 2 i 4 ng / ml) i czt...

Discussion

Dla powodzenia tej metody kluczowe znaczenie ma uzyskanie równomiernie pokrytej próbki o stałej grubości około 100 μm. Moduł powinien być starannie dobrany, aby zbadać fizyczne znaczenie systemu biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania. Podczas wytwarzania warstwy wierzchniej należy zoptymalizować stężenie fiducial fluorescencyjnych cząstek w celu dokładnej analizy przemieszczenia i naprężeń trakcyjnych. Analiza izolowanych pojedynczych komórek wymaga gęstszej warstwy powierniczej niż pomiar zlewających się mon...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plate
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	Dielektryk o wysokiej czystości, zestaw miękkiego żelu silikonowego
Dow Corning Sylgard 184 Silikonowa kapsułka bezbarwna 0,5 kg Zestaw	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg	utwardzacz
Szkło cięte na zamówienie		Naukowa Hausser	109,6 mm± x 72,8 mm± x 1mm grubości
Nylonowy filtr strzykawkowy Target 2TM	ThermoFisher Scientific	F2513-4
96-dołkowy uchwyt na jajka	Stripwell Corning	2572
Polistyrenowa uniwersalna pokrywka na mikropłytki z wycięciem narożnym	Corning	3099
Alkohol etylowy	Greenfield Global	P016EA95	0,95
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	odczynnik ACS, ≥ 99,5%
Powłoka powierzchniowa
sulfo-SANPAH Środek sieciujący	Proteochem	c1111-100mg
Fibronektyna osocze bydlęce	roztwór Sigma-Aldrich	F1141-1MG	, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
PBS, 1X	Żubr	319-005-CL	pH 7,4, bez wapnia i magnezu
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
Cell Culture
DMEM, 1X	Żubr	319-005-CL	4,5g/L glukozy, z L-glutaminą, pirogronianem sodu i czerwienią fenolową
FBS (Płodowa Surowica Bydlęca)	Żubr	080-150	Jakość Premium,  Endotoksyna < 1, hemoglobina < 25
HEPES	Żubr	330-050-EL	1M, wolny kwas
Ludzki rekombinowany	żubel	511-016-CM
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Żubr	450-201-EL	100 X, sterylny filtrowany do hodowli komórkowych
Roztwór L-glutaminy	Żubr	609-065-EL	200mM, sterylny filtrowany do hodowli komórkowych
Amfoterycyna B	Żubr	450-105-QL	250μ g/ml, sterylny, przefiltrowany do hodowli komórkowych
Rekombinowany ludzki TGF-β 1	Peprotech	100-21	HEK293 Pochodny
kwasu octowego	Sigma-Aldrich	537020	Glacial, ≥ 99,85%
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275	odczynnik ACS, ≥ 99,5%
NMuMG	ATCC	CRL-1636	Linia komórkowa mysiego gruczołu sutkowego
Azydek sodu	Fisher Schientific	AC190385000	99%, ekstra czysty, ACROS Organics
Wodorotlenek potasu	Sigma-Aldrich	221473	odczynnik ACS, ≥ 85%, granulki
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	klasa laboratoryjna
Synteza kulek
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanina nadchloran (DiI)	Sigma-Aldrich	468495-100MG	97%
Metakrylan metylu	Sigma-Aldrich	M55909-500ML	zawiera ≤ 30  ppm MEHQ jako inhibitor, 99%
Inhibitor Remover	Sigma-Aldrich	306312-1EA	Wstępnie zapakowana kolumna do usuwania hydrochinonu i eteru monometylowego hydrochinonu
Żel polidimetylosiloksanu zakończony metakrylopropylem		DMS-R31 (25 000 g / mol)	Stabilizator polidimetylosiloksanu, 25 000 g / mol, 1 000 cSt
2,2′-Azobis(2-metylopropionitryl) (AIBN)	Sigma-Aldrich	441090-25G	98%
heksan	Sigma-Aldrich	296090-2L	bezwodny, 95%
Heksan, mieszanina izomerów	Sigma-Aldrich	227064-1L	bezwodny, ≥ 99%
Whatman  bibuła filtracyjna jakościowa, klasa 1	Sigma-Aldrich	WHA1001055	kręgi, średnica 55  mm,
Sprzęt
Laurell WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
Model UVGL-58	VWR	21474-622
Reometr	Anton Paar	MCR 302 WESP