Artykuł metodologiczny

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59370

⸱

17 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department, University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Streszczenie

Pozaustrojowa fotochemioterapia (ECP) jest szeroko stosowaną immunoterapią nowotworów w leczeniu chłoniaka skórnego z komórek T (CTCL), działającą w ponad 350 ośrodkach uniwersyteckich na całym świecie. Podczas gdy skuteczność kliniczna ECP i wzorowy profil bezpieczeństwa przyczyniły się do jego powszechnego stosowania, wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska pozostaje wyzwaniem, częściowo ze względu na brak laboratoryjnego modelu ECP. Aby pokonać tę przeszkodę i stworzyć prostą, przyjazną dla użytkownika platformę do badań ECP, opracowaliśmy pomniejszoną wersję klinicznego urządzenia do przetwarzania leukocytów ECP, nadającą się do pracy zarówno z modelami mysimi, jak i małymi próbkami krwi ludzkiej. To urządzenie jest nazywane komorą lub płytką Transimmunization (TI). W serii przełomowych eksperymentów zminiaturyzowane urządzenie wykorzystano do wyprodukowania szczepionki komórkowej, która regularnie inicjowała terapeutyczną odporność przeciwnowotworową w kilku syngenicznych modelach guzów myszy. Usuwając poszczególne czynniki z systemu eksperymentalnego i ustalając ich wkład w odpowiedź przeciwnowotworową in vivo, wyjaśniliśmy następnie kluczowe mechanistyczne czynniki potencjału immunizacyjnego ECP. Podsumowując, nasze wyniki ujawniły, że przeciwnowotworowe działanie ECP jest inicjowane przez komórki dendrytyczne (DC), fizjologicznie generowane przez interakcję monocytów krwi z płytkami krwi w płytce TI i naładowane antygenami z komórek nowotworowych, których apoptotyczna śmierć komórki jest drobno miareczkowana przez ekspozycję na fotoaktywowany czynnik sieciujący DNA 8-metoksypsoralen i światło UVA (8-MOPA). Po powrocie do myszy ta szczepionka komórkowa prowadzi do specyficznej i zbywalnej odporności przeciwnowotworowych limfocytów T. Sprawdziliśmy, że komora TI nadaje się również do przetwarzania krwi ludzkiej, wytwarzając ludzkie DC w pełni porównywalne pod względem stanu aktywacji i profilu do tych pochodzących z klinicznej komory ECP. Przedstawione tutaj protokoły są przeznaczone do badań ECP na myszach i ludziach, kontrolowanego generowania apoptotycznych komórek nowotworowych z 8-MOPA oraz szybkiej produkcji fizjologicznych DC pochodzących z ludzkich i mysich monocytów do różnych zastosowań.

Wprowadzenie

Pozaustrojowa fotochemioterapia (ECP) to uznana immunoterapia, która jest szeroko stosowana w ośrodkach uniwersyteckich na całym świecie. Jego zastosowanie było napędzane wyjątkową selektywnością, bezpieczeństwem i dwukierunkową skutecznością terapii ECP, cechami, które ECP dzieli z samym fizjologicznym układem odpornościowym, z którym wydaje się współpracować. ECP selektywnie uodparnia przeciwko komórkom nowotworowym w chłoniaku skórnym z komórek T (CTCL)1,2 i selektywnie toleruje dla docelowych antygenów w ustawieniach przeszczepu, autoimmunizacji i choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)3,4. Immunogenność ECP jest podkreślona przez jego zależność od nienaruszonego przedziału limfocytów T CD8 w CTCL5, podczas gdy swoistość znajduje odzwierciedlenie w bardzo korzystnym profilu działań niepożądanych ECP, bez supresji immunologicznej poza celem w warunkach przeszczepu lub GvHD i bez zwiększonej podatności na infekcje oportunistyczne w CTCL, gdzie niepatogenne klony komórek T mogą potencjalnie zostać utracone wraz ze złośliwymi limfocytami T.

Biorąc pod uwagę kliniczne znaczenie ECP, nadzieja, że lepsze zrozumienie jego mechanizmów może rozszerzyć zasięg terapeutyczny ECP na szersze spektrum nowotworów i zaburzeń immunologicznych, pobudziła międzynarodowe zainteresowanie. Przeprowadzono i zrelacjonowano dwa usankcjonowane przez kraj warsztaty, sympozjum National Institutes of Health (NIH) State-of-the-Science6 oraz konferencję konsensusu American Society for Apheresis7, w celu przyspieszenia identyfikacji głównych komórkowych czynników przyczyniających się do przeciwnowotworowego i tolerogennego działania ECP.

Do tej pory, pomimo licznych opublikowanych raportów próbujących rozwiązać problem mechanizmu ECP, dwie główne przeszkody utrudniły postęp naukowy. Po pierwsze, badania mechanizmów ECP w eksperymentalnych warunkach laboratoryjnych były ograniczone ze względu na brak miniaturowego urządzenia ECP, które w pełni odzwierciedlałoby efekty komórkowe i in vivo ECP oraz miałoby zastosowanie do modeli zwierzęcych. Po drugie, dogłębna analiza laboratoryjna próbek ECP w warunkach klinicznych została ograniczona przez ograniczoną dostępność komórek odpornościowych pacjentów przetwarzanych w ECP, które wymagają dostępu do ośrodków leczenia, a dodatkowo są uzależnione od czasu infuzji pacjenta, a także etycznego zapotrzebowania na bezkompromisowe zestawy leukocytów podawanych pacjentowi w infuzji.

Aby rozwiązać przeszkody utrudniające postęp badań nad ECP, postanowiliśmy opracować miniaturowy aparat ECP, który jak najwierniej naśladowałby kluczowe elementy terapii. Standardowe leczenie ECP polega na przejściu leukocytów pacjenta wzbogaconych w leukaferezę przez przezroczystą w świetle ultrafioletowym (UVA) płytkę z tworzywa sztucznego o grubości 1 mm6,8. Na płytce leukocyty są wystawione na działanie 8-metoksypsoralenu (8-MOP), czynnika fotoaktywowanego, który po ekspozycji na promieniowanie UVA jest przejściowo przekształcany w formę reaktywną (8-MOPA), zdolną do sieciowania DNA poprzez jego dwuwartościowe wiązanie z zasadami pirymidynowymi na siostrzanych niciach DNA9,10. Przetworzone, leczone 8-MOPA leukocyty są pobierane i zwracane pacjentowi dożylnie.

Ponieważ samo ECP jest terapią dwukierunkową, uodparniającą na raka i tolerującą w warunkach transplantacji, autoimmunizacji i GvHD, dla wyjaśnienia nazwaliśmy tryb immunizacji modelu ECP "transimmunizacją", a tryb tolerogenny "transtolerancją". Najpierw skupiliśmy się na modalności transimmunizacji. Nasze niedawno zgłoszone zminiaturyzowane, skalowalne urządzenie ECP typu mysz-człowiek, komora lub płytka do transimmunizacji (TI) i odpowiedni protokół, odtwarzają zarówno efekty komórkowe, jak i in vivo ludzkiego urządzenia ECP w warunkach nowotworowych11.

Aby model transimmunizacji in vivo był jak najbardziej klinicznie istotny, rozpoczęliśmy immunoterapię po tym, jak podskórnie wstrzyknięte syngeniczne guzy myszy stały się wyczuwalne, testując w ten sposób skuteczność protokołu w ustalonym raku. Podobnie jak w przypadku ECP w CTCL, protokół szczepień transimmunologicznych typu proof-of-principle w modelu czerniaka YUMM1.7 wykorzystuje komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od zwierząt z nowotworem. Komórki są przepuszczane przez płytkę TI pod przepływem. Chociaż możliwe jest poddanie się działaniu 8-MOPA komórek w miniaturowej komorze, zaleca się przeprowadzenie go oddzielnie, aby upewnić się, że tylko pożądany typ komórek jest narażony na działanie 8-MOPA. Wcześniejsze badania wskazują, że tolerogenny efekt ECP jest pośredniczony przez komórki prezentujące antygen uszkodzony przez 8-MOPA12, podczas gdy efekt immunizujący wymaga uszkodzenia docelowych komórek nowotworowych 8-MOPA11. W protokole transimmunizacji zarówno komórki nowotworowe, jak i komórki odpornościowe mogą być selektywnie wystawione na działanie 8-MOPA w razie potrzeby. Ponieważ wykazano, że maksymalizacja czasu kontaktu między komórkami nowotworowymi uszkodzonymi przez 8-MOPA a komórkami dendrytycznymi (DC) indukowanymi przez ECP znacznie zwiększa zdolność immunoterapeutyczną klinicznej klasy ECP13, włączyliśmy do naszego protokołu etap koinkubacji przez noc. Po całonocnej inkubacji leczone komórki są zwracane zwierzęciu z nowotworem.

Ten system niezawodnie zmniejszył wzrost guza i zainicjował specyficzną odporność przeciwnowotworową u myszy z ustalonymi guzami syngenicznymi11, i pozwolił nam przeanalizować mechanizm klinicznej skuteczności przeciwnowotworowej ECP. W kilku badaniach wykazaliśmy, że odporność ECP jest inicjowana poprzez aktywację płytek krwi ex vivo w TI plate14,15. Aktywowane płytki krwi sygnalizują następnie dojrzewanie komórek monocytów do komórek dendrytycznych14, co prowadzi do produkcji fizjologicznych DC. Nowo utworzone DC pochodzące z monocytów są w stanie krzyżować zinternalizowane antygeny z komórek nowotworowych uszkodzonych przez 8-MOPA, aby aktywować odpowiedzi limfocytów T specyficzne dla antygenu16. Jak zasugerowano wcześniej12,17, jednakże, wywołane przez 8-MOPA uszkodzenia powstających DC mogą przeciwdziałać lub nawet odwrócić efekt przeciwnowotworowy11, zapewniając mechanistyczne powiązanie z tolerancją ECP.

Płytka TI została również użyta do produkcji fizjologicznie aktywowanych DC z ludzkiego PBMC. Podobnie jak w badaniach na myszach, ludzkie DC pochodzące z TI są zależne od pasażu płytki w obecności płytek krwi do ich wytwarzania, wydają się fenotypowo identyczne z tymi wytwarzanymi na klinicznej płytce ECP i są zdolne do wydajnego przetwarzania i krzyżowej prezentacji ludzkich antygenów nowotworowych w celu aktywacji ludzkich limfocytów T11,16.

Odkrywając mechanizm immunoterapii ECP, odkryliśmy metodę szybkiego generowania fizjologicznych mysich i ludzkich komórek dendrytycznych o pożądanej swoistości antygenowej, które mogą być funkcjonalnie modulowane. Innowacyjne urządzenie i protokół TI mają duże potencjalne znaczenie w dziedzinie badań i terapii ECP oraz szerzej immunoterapii nowotworów, a także w każdej innej dziedzinie zainteresowanej fizjologicznymi, funkcjonalnymi komórkami dendrytycznymi zarówno w trybie immunizacji, jak i tolerancji. Mamy nadzieję, że niniejsza publikacja dostarczy niezbędnych narzędzi osobom zainteresowanym takimi obszarami badawczymi.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody myszy zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Yale, w porozumieniu z National Institutes of Animal Healthcare Guidelines. Wszystkie badania na ludziach przeprowadzono z krwią oddaną przez zdrowych ochotników, za pisemną świadomą zgodą. Badania nad krwią ludzką zostały przeprowadzone zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi (np. Deklaracją Helsińską, CIOMS, Raportem Belmonta, Wspólnymi Regułami Stanów Zjednoczonych) i zostały zatwierdzone przez Yale Human Investigational Review Board na podstawie protokołu numer 0301023636.

UWAGA: Poniżej znajduje się protokół opisujący transimmunizację w terapii przeciwnowotworowej mysich guzów syngenicznych.

1. Implantacja guza syngenicznego YUMM1.7

  1. Postępuj zgodnie z ustalonymi protokołami, aby wszczepić guzy syngeniczne w boki myszy, zgodnie z interesującą linią komórek nowotworowych.
    nuta: Poniższy protokół opisuje mysi model czerniaka YUMM1.7 C57BL/6. Komórki czerniaka YUMM1.7 zostały dzięki uprzejmości dr Bosenberga, Yale18.
  2. Rozmrozić zamrożoną porcję komórek i użyć komórek po jednym pasażu komórkowym. Hodowla świeżo rozmrożonych komórek YUMM1.7 w zmodyfikowanej pożywce F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych, w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2 ).
    1. Zbierz komórki YUMM1.7 w zbiegu 60-70%, dodając tyle trypsyny-EDTA, aby pokryć dno płytki lub kolby do hodowli komórkowej (np. 4 ml dla kolby T75).
    2. Odpocznij naczynia do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej przez 3–4 minuty, delikatnie stukając od czasu do czasu w dno lub boki naczynia, aby pomóc w odłączeniu komórek.
    3. Dodać 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 4 ml kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby zatrzymać reakcję po odłączeniu większości komórek. Zebrać komórki, pipetując do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać kolbę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodać płukanie do tej samej probówki zbiorczej. Napełnij probówkę do 15 ml PBS.
    4. Wyjmij małą porcję i policz komórki.
    5. Wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do hodowli tkankowych, aby zebrać komórki nowotworowe.
  3. Ponownie zawiesić komórki YUMM1.7 w PBS o gęstości 1 x 106 komórek/ml.
  4. Wstrzyknąć 1 x 105 komórek nowotworowych YUMM1.7 podskórnie w 100 μl PBS w prawe boki biorcy 4 do 6-tygodniowego samca C57BL/6J myszy typu dzikiego C57BL/6J, znieczulonego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. 3\u20125% gaz wziewny izofluranu, znieczulenie potwierdzone brakiem odruchu szczypania tylnej łapy).
  5. Monitoruj objętość guza za pomocą dwutygodniowych pomiarów prostopadłych średnic i wysokości guza za pomocą suwmiarki. Obliczać YUMM1.7 (objętość guza jako długość guza x szerokość x wysokość)/2.
  6. Rozpocznij terapię transimmunizacyjną, gdy guzy stają się po prostu wyczuwalne; w przypadku guzów YUMM1.7 jest to zwykle dzień 7-10 po implantacji guza.

2. Pobieranie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do transimmunizacji

  1. Zbierz 100\u2012150 μl krwi od każdej myszy z guzem poprzez krwawienie z policzka.
  2. Podczas pobierania krwi należy zebrać krew z każdej grupy leczonej myszami (każde 5 myszy eksperymentalnych + 5 myszy kontrolnych) w jednej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5000 U/ml heparyny. Użyj 10 μl 10% heparyny na 100 μl pobranej krwi.
    nuta: Często mieszaj probówkę podczas pobierania, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Podczas gdy myszy kontrolne z guzem mogą być wykrwawiane w tym samym czasie co myszy eksperymentalne, aby zapewnić równe warunki z grupą badaną, krew "kontrolna" może zostać albo odrzucona, albo połączona z krwią grupy leczonej w celu zapewnienia dodatkowego eksperymentalnego PBMC dla grupy leczonej, według uznania badaczy.
  3. Ustaw jedną probówkę o pojemności 15 ml z 4 ml pożywki do izolacji limfocytów (patrz tabela materiałów) na 5\u201210 wykrwawionych myszy. Powoli nakładaj warstwę krwi (pobranej od myszy z nowotworem) na wierzchu pożywki. Wiruj komórki przez 20 minut w temperaturze 1,000-500 x g, aby oddzielić PBMC od czerwonych krwinek.
  4. Pod koniec wirowania zebrać górną warstwę osocza, pozostawiając ~0,5 ml pozostałego nad kożuchem i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (krok 7.1).
  5. Zebrać warstwę kożucha do czystej probówki o pojemności 15 ml, napełnić PBS do 15 ml i wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do hodowli tkankowych, aby zebrać PBMC.
  6. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad, przesuwając rurkę. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać utracony. Dodać 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek ACK (patrz Tabela Materiałów) do probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe czerwone krwinki z PBMC. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
  7. Napełnij probówkę PBS do 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do kultur tkankowych w celu zebrania PBMC.
  8. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad przez strzepnięcie. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać zgubiony.
    nuta: Na tym etapie oczyszczony PBMC może być modyfikowany tak, jak najlepiej pasuje do eksperymentu. Różne składniki PBMC (płytki krwi, monocyty, inne typy komórek odpornościowych) mogą być zubożone lub wyizolowane z PBMC w razie potrzeby. Również sam PBMC może być narażony na działanie 8-MOPA, przed lub po sekcji 4 (przed lub po przejściu płytki - po sekcji 2 lub przed sekcją 5), postępując zgodnie z krokami protokołu 3.3\u20123.8 i podstawiając PBMC na komórki YUMM1.7. Spowoduje to zmniejszenie zdolności immunogennej leczenia i zamiast tego będzie promować tolerancję immunologiczną.
  9. Dla każdej grupy badanej (każde 5 myszy eksperymentalnych + 5 myszy kontrolnych) ponownie zawiesić osad PBMC w 300 μl FBS.

3. Leczenie komórek nowotworowych metodą 8-MOP/UVA

  1. Hoduj i zbieraj komórki nowotworowe YUMM1.7 zgodnie z opisem w krokach 1.2–1.3, aby przygotować źródło antygenu komórek nowotworowych narażone na 8-MOPA.
  2. Przygotuj 2,5 x 106 komórek nowotworowych YUMM1,7 na grupę leczoną 5 myszy. Dla każdej grupy leczonej ponownie zawieś osad komórek nowotworowych w FBS w temperaturze 2,5 x 106 komórek/300 μL (~8,33 x 106 komórek/ml).
  3. Przy wyłączonych światłach okapu do hodowli tkankowej dodać 8-MOP (patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórek nowotworowych YUMM1.7, aby uzyskać końcowe stężenie 8-MOP 100 ng / mL.
    UWAGA: 8-MOP jest fotoaktywowanym środkiem uszkadzającym DNA i rakotwórczym. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się i dozowania, unikaj kontaktu z odsłoniętą skórą i odpowiednio wyrzuć.
  4. Dobrze wymieszać komórki, owinąć pojemnik na komórki folią aluminiową i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Wstępnie pokryj 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, wypełniając jedną studzienkę dla każdej grupy 5 myszy poddanych działaniu substancji (2,5 x 106 komórek nowotworowych YUMM1,7) 1 ml FBS i przechowuj wypełnioną płytkę w lodówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Włącz źródło światła UVA, aby je wstępnie ogrzać.
    ostrożność: Światło UVA jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas pracy ze źródłami światła UVA pracuj szybko i ostrożnie, chroń skórę przed ekspozycją i używaj osłon twarzy lub okularów do ochrony twarzy i oczu.
  7. Po 20 minutach przenieś schłodzoną 12-dołkową płytkę (krok 3.5) do okapu do hodowli tkankowej, usuń FBS z dołków i dodaj 300 μl (2,5 x 106 komórek/dołek) komórek nowotworowych narażonych na MOP (od kroku 3.4) do dołka.
  8. Wystawić płytkę zawierającą ogniwa na działanie wstępnie ogrzanego źródła światła UVA, aby uzyskać całkowite napromieniowanie 4 J/cm2.
    nuta: Opisane tutaj stężenie 8-MOP i dawka UVA są skalibrowane dla linii komórek nowotworowych YUMM1.7. Miareczkowanie dawki 8-MOP/UVA, wystarczającej do spowodowania 100% śmierci komórek nowotworowych w ciągu 1 tygodnia od ekspozycji, powinno być przeprowadzone dla każdej eksperymentalnej linii komórek nowotworowych, w celu określenia skutecznej dawki zabijającej. Jest to niezwykle ważne dla eksperymentów TI in vivo na myszach, ponieważ komórki są ponownie wstrzykiwane po orbicie (krok 6.1), a zatem wszelkie nieuszkodzone komórki nowotworowe mogą w przeciwnym razie tworzyć guzy oka u leczonego zwierzęcia. Jako wskazówkę, 4\u20128 J/cm2 UVA, 100\u2012200 ng/mL 8-MOP, jest typowym efektywnym zakresem dla większości linii komórek nowotworowych.
  9. Zbierz komórki nowotworowe poddane działaniu8-MOP A z każdej studzienki, obracając płytką i ostrożnie pipetując, aby zapewnić całkowite odzyskanie komórek.

4. Płyta TI Przejście komórek

  1. Dla każdej grupy leczonej 5 myszy połączyć w jednej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml 300 μl odpowiedniego PBMC (z kroku 2.11) i 300 μl komórek nowotworowych traktowanych 8-MOPA (z kroku 3.9). Wymieszaj komórki.
  2. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby napełnić zestawy "wejściowe" i "wyjściowe" rurki TI (patrz
    Tabela materiałów) z FBS. Otwórz rurkę clamps, aby napełnić rurki, i zamknij zaciski po napełnieniu rurek przed odłączeniem strzykawki, aby utrzymać FBS wewnątrz rurki.
  3. Użyj pipety P1000, aby dodać mieszaninę PBMC i komórek nowotworowych (z kroku 4.1) do płytki TI (patrz Tabela materiałów). Trzymaj płytkę pod kątem 45°, umieść końcówkę pipety bezpiecznie we wlocie płytki TI i powoli napełniaj płytkę, unikając pęcherzyków.
  4. Wyjąć końcówkę pipety z wlotu przed zwolnieniem tłoka pipety. Płytka mieści 450 μl; Pozostałe komórki umieścić z powrotem w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.
  5. Inkubować rurkę wypełnioną FBS, płytkę TI wypełnioną komórkami i stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Po inkubacji opróżnij rurkę TI grawitacyjnie, zwalniając zaciski.
  6. Użyj pipety P1000, aby usunąć komórki z płytki TI, wkładając końcówkę pipety z tłokiem wciśniętym w port płytki. Trzymaj płytkę pod kątem 45° i napełnij końcówkę pipety P1000. Umieść komórki z powrotem w ich oryginalnej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.
  7. Aby uruchomić płytę TI, podłącz rurkę wyjściową do płyty i przymocuj płytę TI do systemu jezdnego płyty.
  8. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 600 μl mieszaniny PBMC i komórek nowotworowych z stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml, pozbyć się wszelkich pęcherzyków ze strzykawki, przymocować strzykawkę do rurki wejściowej z otwartym zaciskiem i powoli napełniać, aż płyn dotrze do końca rurki.
  9. Przymocuj wolny koniec rurki wejściowej do płyty TI i kontynuuj delikatne ładowanie pozostałej objętości. Zamknij wejście clamp.
  10. Odłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml i podłączyć rurkę wejściową do pompy strzykawkowej. Przymocuj rurkę wyjściową do czystej stożkowej rurki o pojemności 1.5 ml w celu pobrania komórek.
  11. Wyreguluj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,09 ml/min, ale nie uruchamiaj jeszcze pompy. Przechylić płytkę TI o ~30° w kierunku strony pompy strzykawkowej, używając platformy do biegania z płytką TI lub w dowolny inny sposób (np. mały płaski przedmiot pod jednym końcem płytki).
  12. Ostrożnie zwolnij zacisk na wężu wejściowym. Uruchomić pompę strzykawkową, uważnie obserwując, jak napełnia się płytka TI i w razie potrzeby przesunąć rurkę lub płytkę, jeśli pęcherzyki powietrza utrudniają przepływ.
  13. Gdy płyta TI zostanie całkowicie napełniona, przechyl ją o ~30° w przeciwnym kierunku podczas opróżniania. Gdy wszystkie komórki i płyn znajdą się w stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml, zatrzymaj pompę.
  14. Aby umyć płytkę TI, odłącz rurkę wejściową od pompy strzykawkowej, podłącz do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 600 μl FBS i postępuj zgodnie z procedurą dla kroków 4.8\u20124.9.
  15. Wyreguluj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0.49 ml/min, zwolnij wejście clamp i uruchom płytkę TI zgodnie z opisem w krokach 4.12\u20124.13, zbierając płyn do tej samej stożkowej probówki o pojemności 1.5 ml. Delikatnie przesuwaj lub stukaj w płytkę TI przez cały czas, aby pomóc w odłączeniu i elucji wszelkich przylegających komórek.
  16. Obracać stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml w laboratoryjnym mikrofugowaniu o sile 250 x g przez 8 minut. Wyrzucić supernatant.

5. Przygotowanie autologicznej surowicy mysiej do nocnego podłoża hodowlanego

  1. Pobrać krew od 10-12-tygodniowych myszy C57BL/6J dowolną metodą zatwierdzoną przez instytucję (np. krwawienie z oka, krwawienie z żyły ogonowej, krwawienie z policzka lub końcowe wykrwawienie przez nakłucie serca), bez żadnych antykoagulantów. Oszacuj pobranie 1 ml krwi na każde potrzebne 300 μl surowicy.
    nuta: Potrzeba 300 μl surowicy na każdą grupę leczoną 5 myszy w eksperymencie.
  2. Pozostawić krew do krzepnięcia przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Odwirowywać zakrzepłą krew w ilości 3 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie zebrać wierzchnią warstwę zawierającą surowicę
    nuta: Surowicę można natychmiast wykorzystać do przygotowania pożywki do inkubacji komórek przez noc (krok 6.1) lub zachować do przyszłych eksperymentów. Aby zachować surowicę, zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C.

6. Nocna koinkubacja PBMC z antygenem

  1. Ponownie zawiesić PBMC i osad komórek nowotworowych (krok 4.5) w 2 ml przezroczystego RPMI z 15% autologiczną surowicą myszy (przygotowaną w kroku 5). Płytkę umieścić w sterylnym naczyniu o średnicy 35 mm bez hodowli tkankowej i inkubować przez noc w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2 ).
    nuta: Jeśli PBMC jest używany z antygenem niekomórkowym (peptyd, nanocząstka, białko itp.), należy pominąć sekcję 3 protokołu i przejść z sekcji 2 bezpośrednio do sekcji 4, dodając pożądany antygen do PBMC przepuszczonego przez płytkę TI w celu koinkubacji przez noc w kroku 6.1.
  2. Następnego dnia ostrożnie odłącz wszelkie przylegające komórki od dna naczynia za pomocą skrobaka do kultur tkankowych, obracając naczynie podczas skrobania, aby zapewnić równomierne zbieranie komórek. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml.
  3. Dodaj 2 ml PBS do naczynia i powtórz etap skrobania, zbierając komórki do tej samej probówki. Opłucz naczynie o średnicy 35 mm 1 ml PBS i dodaj płukankę do tej samej probówki.
  4. Wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do kultur tkankowych w celu zebrania komórek. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad, przesuwając probówkę. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać utracony.

7. Ponowna iniekcja komórek leczonych TI myszom z nowotworem

  1. Odwirowywać autologiczne osocze (przygotowane w kroku 2.4) w temperaturze 750 x g przez 15 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek. Zawiesić osad komórkowy (z kroku 6.4) w 600 μl osocza autologicznego lub PBS.
  2. Wstrzyknąć komórki w dawce 100 μl na mysz do splotu zaoczodołowego odpowiednio znieczulonych (np. 3\u20125% gaz wziewny izofluranu, znieczulenie potwierdzone brakiem odruchu szczypania tylnej łapy) myszy eksperymentalnych z nowotworem. Jeśli jest to pożądane, należy ponownie wstrzyknąć myszom z grupą kontrolną nowotwór 100 μl samego osocza autologicznego lub PBS.
  3. W przypadku myszy z guzem YUMM1.7 należy powtarzać zabieg (kroki 2–7.2) dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie, co daje w sumie 6 zabiegów. Zbieraj i przetwarzaj PBMC od myszy z nowotworem co tydzień (sekcje protokołu 2-4) w poniedziałki i czwartki, a następnie ponownie wlewaj po całonocnej inkubacji (sekcje protokołu 5-7) we wtorki i piątki.
    nuta: Ten schemat leczenia został opracowany z myślą o specyficznej kinetyce wzrostu guzów YUMM1.7 u myszy. Może być konieczne miareczkowanie dla innych układów nowotworowych o wolniejszym lub szybszym tempie wzrostu guza - odpowiednio zwiększając lub zmniejszając liczbę zabiegów.
  4. Monitoruj objętość guza za pomocą dwutygodniowego pomiaru - najlepiej w momencie podawania terapii (wtorek i piątek) - prostopadłych średnic i wysokości guza za pomocą suwmiarki. Zakończ eksperyment, gdy kontrolne objętości guza osiągną maksymalny rozmiar dozwolony przez wytyczne i protokoły instytucjonalne.

8. Adaptacja protokołu do leczenia małych objętości krwi ludzkiej

  1. Dostosuj protokół do stosowania z komórkami ludzkimi, najpierw izolując PBMC od ludzkiej krwi. Stosuj heparynę jako antykoagulant, z dowolnym preferowanym protokołem izolacji PBMC.
  2. Upewnij się, że wyizolowana frakcja PBMC zawiera fizjologiczną liczbę płytek krwi, aby uzyskać najlepsze wyniki protokołu. Monitoruj liczbę płytek krwi przed i po izolacji PBMC za pomocą dowolnego standardowego licznika hematologicznego.
  3. W przypadku korzystania ze źródła ludzkiego antygenu komórkowego należy traktować ludzkie komórki antygenowe zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3 dla komórek YUMM1.7. Miareczkować odpowiednio dawki 8-MOP i UVA.
  4. Wykonać etapy przejścia płytki opisane w rozdziale 4, używając do 3 x 107 PBMC na płytkę TI.
  5. Hodowla PBMC przez noc z komórkowym/innym wybranym antygenem, jak opisano w punkcie 6, ale zastąp 15% ludzką surowicę AB autologicznym osoczem myszy pożywką do hodowli przez noc w kroku 6.1.
  6. Użyj otrzymanych komórek w dowolnym teście. Na przykład współhodowla z limfocytami T reagującymi na antygen w celu obserwacji odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu zainicjowanych przez komórki traktowane TI.

Wyniki

Opracowaliśmy niedawno skalowalne miniaturowe urządzenie ECP do transferu od myszy do człowieka, płytkę TI (Rysunek 1A), oraz zaprojektowaliśmy odpowiednie protokoły leczenia. Urządzenie i protokół odtwarzają kluczowe cechy komórkowe i in vivo immunizującego ECP, określanego mianem „transimmunizacji”.

Protokół dowodowy mysiej transimmunizacji1 (Rysunek 1B) polega na pozacielesznym przejściu przez płytkę TI mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z myszy z nowotworem wraz z apoptotycznymi komórkami nowotworowymi eksponowanymi na 8-MOPA. Warto zaznaczyć, że komora TI jest przezroczysta i ma rozmiary odpowiadające standardowemu formatowi szkiełka mikroskopowego, co umożliwia łatwą wizualizację oddziaływań komórkowych wewnątrz płytki TI na każdym etapie protokołu (Wideo 1). Komórki odpornościowe aktywowane na płytce TI są inkubowane przez noc z apoptotycznymi komórkami nowotworowymi eksponowanymi na 8-MOPA, co ułatwia pobieranie komórek nowotworowych, ich przetwarzanie oraz przekazywanie antygenów nowotworowych do komórek dendrytycznych (DCs). Następnego dnia współinkubowana mieszanina komórek jest wprowadzana z powrotem do krwiobiegu zwierzęcia z nowotworem. Zwierzęta kontrolne przechodzą identyczne procedury pobierania krwi, aby znormalizować wszelkie efekty limfodeplecji na wzrost guza, ale zamiast tego otrzymują reinfuzje PBS. Wzrost nowotworu u wszystkich zwierząt jest monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu.

W badaniach z wykorzystaniem syngenicznego mysiego modelu czerniaka YUMM1.718 protokół transimmunizacji powtarzano dwa razy w tygodniu przez trzy tygodnie, co łącznie dało sześć zabiegów u każdego zwierzęcia (Rysunek 1B). Terapia wydawała się dobrze tolerowana u wszystkich leczonych zwierząt (>10) i konsekwentnie wykazywała zahamowanie wzrostu guza YUMM1.7 u zwierząt leczonych w porównaniu z grupą kontrolną, co zaobserwowano w 9 niezależnych eksperymentach przeprowadzonych w ciągu 2 lat (Rysunek 2A,B). Wyniki przedstawiają skumulowane dane dotyczące wzrostu guza u zwierząt poddanych transimmunizacji oraz w grupie kontrolnej ze wszystkich przeprowadzonych eksperymentów (Rysunek 2A), a także reprezentatywne krzywe wzrostu guzów dla poszczególnych zwierząt w ramach jednego eksperymentu, aby zobrazować zmienność w systemie (Rysunek 2B).

Stwierdzono, że sukces protokołu krytycznie zależy od obecności monocytów w traktowanych PBMC, obecności płytek krwi w frakcji PBMC oraz etapu przejścia płytek przez TI. W przypadku pominięcia przejścia płytek lub gdy płytki krwi lub monocyty zostaną usunięte z frakcji PBMC, efekt terapeutyczny nie jest już obserwowany (Rycina 3A). Leczenie wymaga również obecności apoptotycznych komórek nowotworowych. Jest ono nieskuteczne w przypadku braku komórek odpornościowych lub źródła antygenu, a także w obecności niedopasowanego antygenu, na przykład gdy myszy z nowotworami YUMM1.7 są leczone z wykorzystaniem komórek raka jelita grubego MC38 (Rycina 3B). Dla uzyskania efektu immunizacyjnego krytyczne jest również unikanie ekspozycji PBMC na 8-MOPA. PBMC eksponowane na 8-MOPA nie tylko znoszą, a być może nawet odwracają odporność przeciwnowotworową (Rycina 3C), ale także hamują potencjał immunizacyjny komórek nieeksponowanych, co wykazano w eksperymencie, w którym zastosowano równą liczbę PBMC eksponowanych na 8-MOPA i chronionych przed 8-MOPA, nie obserwując efektu przeciwnowotworowego (Rycina 3C).

W przypadku ludzkich PBMC, komora TI oraz protokół transimmunizacji prowadzą do skutecznej aktywacji monocytów do postaci DC, która pod względem markerów aktywacji powierzchniowej i wewnątrzkomórkowej jest nieodróżnialna od tej osiągniętej za pomocą klinicznej płytki ECP (Tabela 1). Podobnie jak w badaniach na myszach, aktywacja DC (Rysunek 4A) oraz zdolność DC wygenerowanych w procesie transimmunizacji do przetwarzania i prezentowania antygenu (Rysunek 4B,C) krytycznie zależą od obecności płytek krwi w PBMC oraz od przejścia przez płytkę TI. Aktywowane przez transimmunizację ludzkie DC mogą skutecznie przetwarzać i prezentować krzyżowo albo antygeny peptydowe (Rysunek 4B), albo antygeny z całych ludzkich komórek nowotworowych eksponowanych na 8-MOPA, w celu aktywacji ludzkich linii limfocytów T specyficznych dla antygenu w testach in vitro (Rysunek 4C), w sposób zależny od TI i płytek krwi (Rysunek 4B,C).

Płytka polistyrenowa do transimmunizacji oraz schemat leczenia TI w procesie guzów syngenicznych myszy.
Rysunek 1: Schematy komory i protokołu transimmunizacji (TI). (A) Schemat i specyfikacja komory do leczenia metodą transimmunizacji (płyta TI). (B) Schematyczny opis przebiegu eksperymentu z zastosowaniem leczenia metodą transimmunizacji. W skrócie: zwierzęta poddaje się podskórnej (s.c.) inokulacji syngenicznymi komórkami nowotworowymi; zwierzęta z wyczuwalnymi guzami są leczone dwa razy w tygodniu poprzez pobranie krwi, izolację PBMC z krwi, przepływ PBMC przez autologiczną płytkę TI pokrytą płytkami krwi w obecności komórek nowotworowych traktowanych 8-MOP/UVA, nocną koinkubację PBMC i komórek nowotworowych oraz ponowne wstrzyknięcie komórek dożylnie tym samym zwierzętom z guzami. Objętość guza jest mierzona przez cały czas trwania eksperymentu. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie11. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres porównania objętości guza, PBS vs. transimmunizacja; wpływ leczenia przedstawiony w okresie 30 dni.
Rysunek 2: Transimmunizacja hamuje wzrost syngenicznych guzów czerniaka YUMM1.7. (A) objętość guza YUMM1.7 w czasie wykreślona dla myszy C57BL/6 zaszczepionych 1 x 105 komórki nowotworowe YUMM1.7, które poddano albo sześciu zabiegom transimmunizacji (linia czarna), albo sześciu zabiegom kontrolnym (linia szara). Dane stanowią sumę wyników z dziewięciu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w ciągu dwóch lat. (B) Dane z jednego reprezentatywnego eksperymentu transimmunizacji YUMM1.7, gdzie każda linia przedstawia wzrost guza u poszczególnych myszy. (A i B) Myszy z grupy „kontrolnej PBS” we wszystkich eksperymentach poddawano pobraniu krwi według tego samego harmonogramu co zwierzęta doświadczalne, jednak otrzymywały one sześć reinfuzji sterylnego PBS. Słupki błędów reprezentują SEM, wartości p obliczono dla każdego punktu czasowego przy użyciu testu wielu porównań Sidaka; **, p = 0,0013; ****, p < 0,01. Rycina została zmodyfikowana na podstawie11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykresy wzrostu objętości guza; eksperyment z immunizacją, deplecją i grupą kontrolną; analiza YUMM1.7.
Rycina 3: Transimmunizacja wymaga monocytów i płytek krwi w frakcji PBMC przepuszczonej przez płytkę TI, a także 8-MOPA traktowanie komórek nowotworowych dopasowanych antygenowo i 8-MOPA oszczędzanie PBMC. (A) Objętość guza YUMM1.7 w czasie wykreślona dla myszy C57BL/6 zaszczepionych 1*105 komórki guza YUMM1.7, które otrzymały sześć zabiegów transimmunizacji (ciągłe czarne linie), sześć zabiegów kontrolnych (ciągłe szare linie) lub sześć zabiegów TI, w których monocyty lub płytki krwi zostały usunięte z PBMC przed etapem pasażowania na płytkach (z użyciem odpowiednio zestawów do usuwania α-CD11b i α-CD41), lub w których pominięto pasażowanie na płytkach (linie przerywane).B) Zależność objętości guza od czasu dla myszy C57BL/6 inokulowanych dawką 1 x 105 komórki nowotworowe YUMM1.7, otrzymujące odpowiednio sześć zabiegów transimmunizacji (ciągłe czarne linie), sześć zabiegów kontrolnych (ciągłe szare linie), same PBMC (linia przerywana), 8-MOPAsame komórki YUMM1.7 poddane działaniu samego TI lub TI z zastosowaniem 8-MOPA-poddane działaniu komórki nowotworowe MC38 (linie przerywane). (C) Zależność objętości guza od czasu wykreślona dla myszy C57BL/6 zaszczepionych dawką 1 x 105 komórki nowotworowe YUMM1.7, które otrzymały odpowiednio sześć zabiegów transimmunizacji (ciągłe czarne linie), sześć zabiegów kontrolnych (ciągłe szare linie) lub sześć zabiegów TI, w których PBMC zostały równomiernie poddane działaniu 8-MOPA bezpośrednio przed pasażowaniem na płytki, sześć wariantów traktowania TI, w których PBMC były równomiernie eksponowane na 8-MOPA bezpośrednio po pasażu na płytce, lub sześć wariantów, w których komórki TI po pasażu na płytce wymieszano w stosunku 1:1 z równą liczbą PBMC, które zostały jednolicie poddane działaniu 8-MOPA naświetlanie (linie przerywane). (A, B i C) Myszy z grupy „kontrolnej PBS” we wszystkich eksperymentach poddawano pobraniu krwi w tym samym harmonogramie co zwierzęta doświadczalne, jednak otrzymały one sześć sterylnych reinfuzji PBS. Przedstawiono dane z reprezentatywnych eksperymentów. Słupki reprezentują SEM, wartości p obliczono dla każdego punktu czasowego za pomocą testu wielokrotnych porównań Sidaka; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,01; ****, p < 0,01; NS = różnice nieistotne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie11. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe poziomów ICAM1, PLAUR, CCL2, CCL5 i IFNγ; badanie wpływu deplecji płytek krwi.
Rycina 4: Protokół TI z zastosowaniem komory TI szybko indukuje dojrzewanie komórek DC, unikalny profil aktywacji oraz zdolność do aktywacji limfocytów T w ludzkich PBMC, w zależności od pasażu płytki oraz obecności płytek krwi.
AAnaliza FACS wskazanych markerów w CD1c+ komórki spośród świeżo izolowanych ludzkich PBMC („kontrola”), PBMC poddanych protokołowi TI („TI”) lub PBMC poddanych protokołowi TI, w których pominięto pasażowanie na płytkach, usunięto płytki krwi przy użyciu zestawu kulek α-CD41 przed pasażowaniem na płytkach lub wykonano obie powyższe czynności. Dane stanowią podsumowanie sześciu niezależnych eksperymentów z udziałem trzech dawców krwi. Słupki reprezentują wartości średnie, a słupki błędów reprezentują SEM. Wartości p dla każdego porównania obliczono za pomocą sparowanego testu t; *, p < 0,05; **, p < 0.01. Panele zostały zmodyfikowane z11. BTraktowane TI ludzkie PBMC, zawierające płytki krwi lub pozbawione płytek krwi, inkubowano wspólnie przez noc z nieistotnym peptydem (SIINFEKL) lub długim peptydem białka HPV E7 związanego z płaskonabłonkowym rakiem głowy i szyi. Następnie PBMC wykorzystano do stymulacji ludzkiej linii komórek T CD8 wykazujących specyficzną reaktywność wobec peptydu E7. Stymulację komórek T mierzono poprzez produkcję IFNg po 5 dniach hodowli.C) Pobrane od ludzi monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMC) traktowane TI, zawierające płytki krwi lub pozbawione płytek krwi, inkubowano wspólnie przez noc z 8-MOPAlinia komórkowa raka płaskonabłonkowego głowy i szyi SCC61 poddana działaniu [czegoś], albo wykazująca ekspresję (SCC61 HPV E6/7), albo niewykazująca ekspresji (SCC61 no HPV) antygenowych białek HPV E6 i E719Następnie PBMC wykorzystano do stymulacji ludzkiej linii komórek T CD8 wykazujących specyficzną reaktywność wobec peptydydu E7. Stymulację komórek T mierzono na podstawie produkcji IFNg po 5 dniach hodowli.B i C) Dane przedstawiają reprezentatywne eksperymenty z trzema powtórzeniami w każdym. Słupki reprezentują wartości średnie, natomiast słupki błędów reprezentują SEM. Wartości p dla każdego porównania obliczono przy użyciu testu wielokrotnych porównań Sidaka; ***, p < 0,01; ****, p < 0.0001. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

markerparametrniepoddany leczeniuPłytka ECP z protokołem TIPłytka TI z protokołem TIwartość p ECP vs TI
HLA-DRΔ MFI100.1 ± 42.4439.8 ± 152.5417.7 ± 152.2NS
CD80Δ %3.9 ± 1.122.3 ± 7.224.5 ± 7.2NS
CD83Δ MFI0.3 ± 0.253.3 ± 9.751.4 ± 17.4NS
CD86Δ MFI10.8 ± 1.7103.9 ± 23.487.1 ± 17.6NS
PLAURΔ MFI54.5 ± 12721.4 ± 183.6528.7 ± 135.5NS
ICAM1Δ MFI12.2 ± 1.6179.6 ± 28.5192.5 ± 25.4NS
ITGB5Δ MFI53.6 ± 25.797.1 ± 31.6103.8 ± 32.8NS
CCL2 (MCP-1)Δ %0.6 ± 0.570.1 ± 6.755.2 ± 8.9NS
CXCL5Δ %0.7 ± 0.439.1 ± 7.241.5 ± 4.7NS
CXCL16Δ %0.3 ± 0.228.0 ± 8.835.3 ± 11.7NS
CD105 (endoglina)Δ MFI3.6 ± 0.3124.3 ± 25.4141.8 ± 33.2NS
CD12 (nektyna 2)Δ MFI10.9 ± 1.847.3 ± 5.250.9 ± 9.2NS
CD120a (TNFR-1)Δ MFI10.1 ± 2.62.2 ± 1.41.8 ± 1.1NS
CD137L (4-1BBL)Δ MFI2.9 ± 1.51.0 ± 0.41.2 ± 0.6NS

Tabela 1: Protokół TI z zastosowaniem komory TI szybko indukuje dojrzewanie DC w stopniu równoważnym do dojrzewania indukowanego protokołem TI z zastosowaniem klinicznej komory ECP. Analiza FACS zmian wskazanych markerów względem odpowiednich kontroli IgG w żywych ludzkich komórkach CD11c+ wśród świeżo wyizolowanych PBMC („nieleczone”), PBMC przepuszczonych przez kliniczną płytkę ECP zgodnie z protokołem TI („płytka ECP z protokołem TI”) i analizowanych po inkubacji przez noc, lub PBMC poddanych działaniu protokołu TI („płytka TI z protokołem”) i analizowanych po inkubacji przez noc. Dla markerów, takich jak HLA-DR, w których zmieniła się cała populacja komórek, dane wyrażono jako zmiana średniej intensywności fluorescencji (MFI). Dla markerów, w których tylko podgrupa komórek wykazuje ekspresję markera, takich jak CCL2, przedstawiono zamiast tego różnicę w procencie komórek PBMC CD1c+ dodatnich pod względem markera. Dane podsumowują sześć niezależnych eksperymentów z trzema dawcami krwi. Dane dla każdego markera wyrażono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Wartości p dla każdego porównania obliczono za pomocą sparowanego testu t; NS = różnice nieistotne. Tabela została zmodyfikowana na podstawie 1.

Obraz mikroskopowy osadzania płytek krwi; ekspozycja początkowa, inkubacja statyczna, badanie rozmieszczenia komórkowego.
Film 1: Obrazowanie na żywo interakcji płytek krwi i komórek odpornościowych w płycie TI.
PBMC przygotowano zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu i poddano działaniu płytki do transimmunizacji zgodnie z opisem w sekcji 4, z wyjątkiem czasu inkubacji statycznej w kroku 4.2.3, który skrócono z 1 h do 30 min. Podczas protokołu TI płytkę TI, która ma takie same wymiary jak standardne szkiełko przedmiotowe, umieszczono w uchwycie do szkiełek systemu obrazowania fluorescencyjnego, a zawarte w niej komórki obrazowano przy powiększeniu 40x i przy 37 °C podczas etapów napełniania płytek (4.2.2), inkubacji płytek (4.2.3) oraz przepływu na płytkach (4.3.5). Obrazy były pozyskiwane w sposób ciągły, a filmy zostały utworzone przy użyciu oprogramowania „Automated Scanning Routine”. Podpisy pod filmem wskazują etap protokołu, na którym rejestrowano komórki. Strzałki i okręgi w filmie wraz z powiązanymi z nimi podpisami wskazują komórki i obszary zainteresowania. 10 μM Pasek skali znajduje się w prawym dolnym rogu przez cały czas trwania filmu. Prosimy kliknąć tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Zminiaturyzowane urządzenie i opisany powyżej protokół po raz pierwszy pozwalają na efektywne badanie laboratoryjne mechanizmów ECP w mysich układach doświadczalnych oraz w małych próbkach krwi ludzkiej. To wielki postęp; Na przykład pozwoliło nam to po raz pierwszy zademonstrować skuteczność transimmunizacji przeciwko guzom litym w mysim modelu 11, otwierając przyszłą możliwość podobnego zastosowania w onkologii u ludzi.

Przed opracowaniem opisanego tutaj urządzenia i metody transimmunizacji niemożliwe było pełne zbadanie wszystkich aspektów ECP. W modelach mysich, chociaż aspekt terapii 8-MOPA można było nieco odtworzyć poprzez traktowanie komórek na szalce Petriego12,20, nie było zdolności do zintegrowania z metodą pasażu płytki, która, jak wykazano, zapewnia dynamiczne interakcje płytek krwi, które są krytycznie ważne dla fizjologicznej aktywacji ECP DC14. W badaniach na ludziach, alternatywnie, składnik przepływu był w pełni obecny, ale brakowało zdolności do selektywnego wystawiania określonych składników komórkowych na działanie 8-MOPA lub ochrony przed nim21,22. Uniemożliwiało to pełne zrozumienie mechanizmu ECP i jego optymalizację pod kątem odporności czy tolerancji. Ponadto ilość krwi potrzebna do pracy z klinicznym aparatem ECP jest duża, co utrudnia badania naukowe. Opisane tutaj po raz pierwszy zminiaturyzowane urządzenie i protokół ECP pozwalają na wydajne, w pełni elastyczne i przestrajalne laboratoryjne modelowanie ECP. Ponadto płytka TI pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym i monitorowanie interakcji komórek w płytce za pomocą mikroskopii.

Aby protokół zakończył się sukcesem przy użyciu zarówno systemów in vivo, jak i ex vivo, niezwykle ważne jest, aby leczony PBMC zawierał monocyty, które mogą być aktywowane do funkcjonalnych DC. Aby ta aktywacja mogła przebiegać, konieczne jest również upewnienie się, że frakcja PBMC zawiera fizjologiczną liczbę zdrowych, aktywowanych płytek krwi oraz że protokół pasażu płytki TI jest ściśle przestrzegany. Aby skierować nowo aktywowane DC w kierunku określonej reaktywności, należy je zaopatrzyć w antygen. Odkryliśmy, że najbardziej efektywną metodą dostarczania antygenu w celu uzyskania odporności przeciwnowotworowej jest nocna koinkubacja nowo aktywowanych DC z komórkami nowotworowymi zawierającymi antygen 8-MOPA. Ma to tę dodatkową zaletę, że jest w stanie stworzyć immunogenną odpowiedź przeciwnowotworową bez konieczności wcześniejszej wiedzy na temat antygenów nowotworowych, umożliwiając DC ich selekcję. Jednak w przypadkach, gdy antygen jest znany, odnieśliśmy pewien sukces w systemach ex vivo, gdy używaliśmy wolnych peptydów jako antygenów we wspólnej inkubacji. W przypadku zastosowań immunogennych same DC powinny być chronione przednarażeniem na 8-MOP A. Wreszcie, w eksperymentach in vivo, ważne jest, aby pracować z modelem zwierzęcym, który jest zdolny do odporności przeciwnowotworowej. Transimmunizacja działa poprzez tworzenie aktywowanych, specyficznych dla antygenu DC , które działają w organizmie w celu zainicjowania wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Upośledzona aktywność lub brak limfocytów T NK, CD4 lub CD8 u leczonej myszy wpłynie na skuteczność protokołu 5,11.

Chociaż opisany tutaj protokół jest dowodem słuszności zasady, który został zoptymalizowany dla mysiego modelu guza syngenicznego litego, niemniej jednak ujawnia wiele możliwości. Mechanizmy ECP w onkologii dopiero się wyjaśniają i wciąż jest wiele miejsca na lepsze zrozumienie. W szerszym ujęciu, zdolność do generowania fizjologicznie aktywowanych mysich i ludzkich DC oraz selektywnego kierowania ich w kierunku odporności specyficznej dla antygenu ma wiele potencjalnych zastosowań poza rakiem. Zdolność do zrobienia tego samego, ale zamiast tego skierowania DC w kierunku tolerancji specyficznej dla antygenu, jak sugeruje tolerancyjna skuteczność samego ECP, ma również szerokie implikacje medyczne. Mamy nadzieję, że dzięki tej metodzie dostarczymy narzędzi i otworzymy produktywną ścieżkę badań dla każdego, kto jest zainteresowany fizjologicznymi terapiami DC.

Oświadczenia

Uniwersytet Yale jest właścicielem patentów wywodzących się z badań nad komórkami dendrytycznymi prof. Richarda Edelsona, które zostały licencjonowane przez start-up z Yale, Transimmune AG. Richard Edelson i Michael Girardi są konsultantami naukowymi Transimmune AG, a Olga Sobolev jest pracownikiem Transimmune AG. Firma Transimmune AG nie posiada obecnie żadnych produktów komercyjnych, jednak we współpracy produkuje płytki Transimmune użyte w tym artykule. Niewykluczone, że ci trzej autorzy mogliby potencjalnie skorzystać na komercjalizacji tych odkryć w przyszłości.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); Dotacja na wsparcie Centrum Onkologii NIH 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); stypendium szkoleniowe Instytutu Medycznego Howarda Hughesa (A. Vassall); oraz NY Cardiac Foundation (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Częściowego wsparcia udzielił M. Bosenbergowi R01 CA196660-01.

Autorzy są wdzięczni dr Robertowi Tigelaarowi za jego mentoring, wskazówki i eksperymentalne spostrzeżenia. Dziękujemy naszym kolegom z Fraunhofer IBMT, w szczególności dr Thorstenowi Knollowi, za opracowanie i dostarczenie komory TI odpowiadającej ECP. Nicholas Theodosakis uprzejmie pomógł w początkowych etapach eksperymentów YUMM. Dziękujemy naszym wolontariuszom krwiodawcom, Inger Christensen i jej profesjonalnemu personelowi w Yale ECP Treatment Center, za pomoc w ochotniczym pobieraniu krwi. Dr Wendell Yarbrough i dr Natalia Issaeva uprzejmie podzielili się z nami liniami komórkowymi SCC61 i SCC61-E6/7. Za pomoc techniczną w projekcie dziękujemy dr Julii Lewis za porady dotyczące protokołu FACS oraz E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote z Yale FACS Core. Obrazy filmowe komórek wewnątrz płytki TI zostały uzyskane z pomocą dr Felixa Rivery-Moliny z Wydziału Biologii Komórki i Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Produkcja filmu była nadzorowana przez Andrew Osborne'a, starszego producenta wideo w Biurze Komunikacji w Yale School of Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)Therakos, IncTylko Rx, NDC nr 64067-0216-01Kroki protokołu 3 i 8 - mysie i ludzkie leczenie komórek 8-MOP/UVA
Surowica ABLonza BioWhittaker14-498EProtokół krok 8.5 - nocna hodowla ludzkiego PBMC
ACK bufor do lizy czerwonych krwinekLonza BioWhittaker10-548EProtokół krok 2 - przygotowanie
PBMC u myszyAnestezjologiczny system stołowy V1 z aktywnym oczyszczaniemVetEquip901820Kroki protokołu 1 i 7 - wprowadzenie guza sc myszy i podanie TI
Autologiczne osocze myszyprzygotować w laboratoriumn/aPrzygotuj się zgodnie z krokiem protokołu 2.4, użyj w  7.1 - podawanie leczenia TI u myszy
Autologiczna surowica myszyprzygotować w laboratoriumn/aPrzygotuj się zgodnie z krokiem 5 protokołu, użyj w kroku 6.1 - nocna hodowla myszy PBMC
C57Bl / 6Jlabs0000664Kroki protokołu 1, 2, 5 i 7 - wstrzyknięcie guza myszy, pobranie krwi/surowicy i powrót terapii
Krwawienie z policzka Nakłuwacz nawłociowy, 5 umMedipoint9891620Protokół krok 2 - przygotowanie PBMC myszy
Clear RPMIGibco firmy LifeTech11835-030Kroki protokołu 6 i 8 - całonocna hodowla myszy / człowieka PBMC
DMEM / F12Gibco firmy LifeTech11330-032Kroki protokołu 1 i 2 - Hodowla komórkowa YUMM1.7
EasyGrip Szalki Petriego EasyGrip, 35 mmFalcon 351008 Kroki protokołu 5 i 8 - całonocna hodowla myszy / człowieka PBMC
Probówki stożkowe Eppendorf 1,5 ml DOT1700-GMTKroki protokołu 1-8
FBS (płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie)SAFC Biosciences12306C-500mLKroki protokołu 1-4 - hodowla komórkowa YUMM1.7, leczenie komórek 8-MOP/UVA, płytka TI
Licznik hematologiczny Hemavet 950FSDrew ScientificHV950FSProtokół krok 8.2 - monitorowanie liczby płytek krwi u ludzi
Heparyna 5,000U/mlMcKesson Usługi pakowania949512Kroki 2 i 8 protokołu - przygotowanie PBMC u myszy i ludzi
IsofluraneAbbott Laboratories5260-04-05Kroki protokołu 1 i 7 - wprowadzenie guza sc myszy i podanie TI
Pożywka do izolacji limfolitów MProtokół Cedarlane LabsCL5035Krok 2 - mysi preparat PBMC
Aminokwasy endogenneGibco firmy LifeTech11140-050Kroki protokołu 1 i 2 - YUMM1.7 hodowla komórkowa
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)Gibco by LifeTech14190-144Kroki protokołu 1-7
Pióro/paciorkowiecGibco by LifeTech15140-122Kroki protokołu 1 i 2 - Hodowla komórkowa YUMM1.7
Polipropylenowe rurki stożkowe 15 mlFalcon352097Kroki protokołu 1-8
Programowalna 2-kanałowa pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems Incmodel NE-4000Kroki protokołu 4 i 8 - uruchamianie płytki TI
Igły do wstrzykiwań retro-orbitalnych, 27G x 1/2Protokół BD Biosciences305109 krok 7 - podawanie leczenia TI u myszy
Strzykawki, 10 ml (LUER-LokTip)Protokół BD Biosciences309604kroki 4, 8 - uruchamianie płytki TI
Strzykawki, 1 ml (końcówka poślizgowa)Protokół BD Biosciences309659kroki 1, 4, 7, 8
Zestaw płytek i przewodów TITransimmune AGniedostępne w handlu Prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem lub firmą Transimmune w celu uzyskania urządzenia na zasadzie współpracy.
Platforma do biegania płytowego TITransimmune AGniedostępna na rynku Prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem lub firmą Transimmune w celu uzyskania urządzenia na zasadzie współpracy.
Kolby do hodowli tkankowych, T75 (75 cm2)Falcon353136Protocol etapy 1, 2, 6 i 8 - hodowla komórek mysich i ludzkich
Płytki do hodowli tkankowych, 12-dołkoweFalcon353043Protocol kroki 3 i 8 - mysie i ludzkie leczenie komórek 8-MOP/UVA
Skrobaki do kultur tkankowychFalcon353085Protocol etapy 6 i 8 - całonocna hodowla trypsyny-EDTA u myszy/człowieka PBMC
0,25% (1x)Gibco by LifeTech25200-056Kroki protokołu 1 i 2 - Igły do wstrzykiwań guza do hodowli komórkowych YUMM1.7
, 25G x 5/8BD Biosciences305122Protocol krok 1 - wprowadzenie guza podskórnego myszy
Promiennik UVAJohnson and Johnsonnie jest dostępny na rynku Aparatura została specjalnie opracowana przez J& J jak laboratorium prof. R. Edelsona. W laboratorium dostępnych jest kilka maszyn współpracujących ze sobą; prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem w celu skorzystania z jednego z nich. Alternatywne promienniki UVA są dostępne na rynku, ale nie zostały przez nas przetestowane.
System obrazowania Invitrogen EVOS FL Auto 2Przyrząd do obrazowania fluorescencyjnegoInvitrogen
Jackson scientific

Bibliografia

  1. Edelson, R., et al. Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).
  2. Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens. The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).
  3. Scarisbrick, J. J., et al. A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent. Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).
  4. Barten, M. J., Dieterlen, M. -T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).
  5. Heald, P., et al. Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).
  6. Ratcliffe, N., et al. National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis. Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).
  7. Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. American council on ECP (ACE): Why now? Journal of Clinical Apheresis. , (2018).
  8. Edelson, R. L. Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).
  9. Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy. The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579(1989).
  10. Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).
  11. Ventura, A., et al. Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity. Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).
  12. Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable? Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).
  13. Girardi, M., et al. Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study. Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).
  14. Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).
  15. Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin. Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).
  16. Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells. Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).
  17. Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms. Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).
  18. Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).
  19. Gubanova, E., et al. Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival. Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).
  20. Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes. Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).
  21. Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease. Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).
  22. Berger, C., et al. Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy. Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

fizjologiczne komórki dendrytycznepłytka do transimmunizacjisygnalizacja płytkowakonwersja monocytów8-metoksypsoralen UVAapoptotyczne komórki nowotworowemononuklearne komórki krwi obwodowejanaliza cytometrii przepływowejinkubator do hodowli tkankowychsystem pompy strzykawkowej
Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.