Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Summary

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Abstract

Pozaustrojowa fotochemioterapia (ECP) jest szeroko stosowaną immunoterapią nowotworów w leczeniu chłoniaka skórnego z komórek T (CTCL), działającą w ponad 350 ośrodkach uniwersyteckich na całym świecie. Podczas gdy skuteczność kliniczna ECP i wzorowy profil bezpieczeństwa przyczyniły się do jego powszechnego stosowania, wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska pozostaje wyzwaniem, częściowo ze względu na brak laboratoryjnego modelu ECP. Aby pokonać tę przeszkodę i stworzyć prostą, przyjazną dla użytkownika platformę do badań ECP, opracowaliśmy pomniejszoną wersję klinicznego urządzenia do przetwarzania leukocytów ECP, nadającą się do pracy zarówno z modelami mysimi, jak i małymi próbkami krwi ludzkiej. To urządzenie jest nazywane komorą lub płytką Transimmunization (TI). W serii przełomowych eksperymentów zminiaturyzowane urządzenie wykorzystano do wyprodukowania szczepionki komórkowej, która regularnie inicjowała terapeutyczną odporność przeciwnowotworową w kilku syngenicznych modelach guzów myszy. Usuwając poszczególne czynniki z systemu eksperymentalnego i ustalając ich wkład w odpowiedź przeciwnowotworową in vivo, wyjaśniliśmy następnie kluczowe mechanistyczne czynniki potencjału immunizacyjnego ECP. Podsumowując, nasze wyniki ujawniły, że przeciwnowotworowe działanie ECP jest inicjowane przez komórki dendrytyczne (DC), fizjologicznie generowane przez interakcję monocytów krwi z płytkami krwi w płytce TI i naładowane antygenami z komórek nowotworowych, których apoptotyczna śmierć komórki jest drobno miareczkowana przez ekspozycję na fotoaktywowany czynnik sieciujący DNA 8-metoksypsoralen i światło UVA (8-MOP_A). Po powrocie do myszy ta szczepionka komórkowa prowadzi do specyficznej i zbywalnej odporności przeciwnowotworowych limfocytów T. Sprawdziliśmy, że komora TI nadaje się również do przetwarzania krwi ludzkiej, wytwarzając ludzkie DC w pełni porównywalne pod względem stanu aktywacji i profilu do tych pochodzących z klinicznej komory ECP. Przedstawione tutaj protokoły są przeznaczone do badań ECP na myszach i ludziach, kontrolowanego generowania apoptotycznych komórek nowotworowych z 8-MOP_A oraz szybkiej produkcji fizjologicznych DC pochodzących z ludzkich i mysich monocytów do różnych zastosowań.

Introduction

Pozaustrojowa fotochemioterapia (ECP) to uznana immunoterapia, która jest szeroko stosowana w ośrodkach uniwersyteckich na całym świecie. Jego zastosowanie było napędzane wyjątkową selektywnością, bezpieczeństwem i dwukierunkową skutecznością terapii ECP, cechami, które ECP dzieli z samym fizjologicznym układem odpornościowym, z którym wydaje się współpracować. ECP selektywnie uodparnia przeciwko komórkom nowotworowym w chłoniaku skórnym z komórek T (CTCL)^1,2 i selektywnie toleruje dla docelowych antygenów w ustawieniach przeszczepu, autoimmunizacji i choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)^3,4. Immunogenność ECP jest podkreślona przez jego zależność od nienaruszonego przedziału limfocytów T CD8 w CTCL⁵, podczas gdy swoistość znajduje odzwierciedlenie w bardzo korzystnym profilu działań niepożądanych ECP, bez supresji immunologicznej poza celem w warunkach przeszczepu lub GvHD i bez zwiększonej podatności na infekcje oportunistyczne w CTCL, gdzie niepatogenne klony komórek T mogą potencjalnie zostać utracone wraz ze złośliwymi limfocytami T.

Biorąc pod uwagę kliniczne znaczenie ECP, nadzieja, że lepsze zrozumienie jego mechanizmów może rozszerzyć zasięg terapeutyczny ECP na szersze spektrum nowotworów i zaburzeń immunologicznych, pobudziła międzynarodowe zainteresowanie. Przeprowadzono i zrelacjonowano dwa usankcjonowane przez kraj warsztaty, sympozjum National Institutes of Health (NIH) State-of-the-Science⁶ oraz konferencję konsensusu American Society for Apheresis⁷, w celu przyspieszenia identyfikacji głównych komórkowych czynników przyczyniających się do przeciwnowotworowego i tolerogennego działania ECP.

Do tej pory, pomimo licznych opublikowanych raportów próbujących rozwiązać problem mechanizmu ECP, dwie główne przeszkody utrudniły postęp naukowy. Po pierwsze, badania mechanizmów ECP w eksperymentalnych warunkach laboratoryjnych były ograniczone ze względu na brak miniaturowego urządzenia ECP, które w pełni odzwierciedlałoby efekty komórkowe i in vivo ECP oraz miałoby zastosowanie do modeli zwierzęcych. Po drugie, dogłębna analiza laboratoryjna próbek ECP w warunkach klinicznych została ograniczona przez ograniczoną dostępność komórek odpornościowych pacjentów przetwarzanych w ECP, które wymagają dostępu do ośrodków leczenia, a dodatkowo są uzależnione od czasu infuzji pacjenta, a także etycznego zapotrzebowania na bezkompromisowe zestawy leukocytów podawanych pacjentowi w infuzji.

Aby rozwiązać przeszkody utrudniające postęp badań nad ECP, postanowiliśmy opracować miniaturowy aparat ECP, który jak najwierniej naśladowałby kluczowe elementy terapii. Standardowe leczenie ECP polega na przejściu leukocytów pacjenta wzbogaconych w leukaferezę przez przezroczystą w świetle ultrafioletowym (UVA) płytkę z tworzywa sztucznego o grubości 1 mm^6,8. Na płytce leukocyty są wystawione na działanie 8-metoksypsoralenu (8-MOP), czynnika fotoaktywowanego, który po ekspozycji na promieniowanie UVA jest przejściowo przekształcany w formę reaktywną (8-MOP_A), zdolną do sieciowania DNA poprzez jego dwuwartościowe wiązanie z zasadami pirymidynowymi na siostrzanych niciach DNA9^,10. Przetworzone, leczone 8-MOP_A leukocyty są pobierane i zwracane pacjentowi dożylnie.

Ponieważ samo ECP jest terapią dwukierunkową, uodparniającą na raka i tolerującą w warunkach transplantacji, autoimmunizacji i GvHD, dla wyjaśnienia nazwaliśmy tryb immunizacji modelu ECP "transimmunizacją", a tryb tolerogenny "transtolerancją". Najpierw skupiliśmy się na modalności transimmunizacji. Nasze niedawno zgłoszone zminiaturyzowane, skalowalne urządzenie ECP typu mysz-człowiek, komora lub płytka do transimmunizacji (TI) i odpowiedni protokół, odtwarzają zarówno efekty komórkowe, jak i in vivo ludzkiego urządzenia ECP w warunkach nowotworowych¹¹.

Aby model transimmunizacji in vivo był jak najbardziej klinicznie istotny, rozpoczęliśmy immunoterapię po tym, jak podskórnie wstrzyknięte syngeniczne guzy myszy stały się wyczuwalne, testując w ten sposób skuteczność protokołu w ustalonym raku. Podobnie jak w przypadku ECP w CTCL, protokół szczepień transimmunologicznych typu proof-of-principle w modelu czerniaka YUMM1.7 wykorzystuje komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od zwierząt z nowotworem. Komórki są przepuszczane przez płytkę TI pod przepływem. Chociaż możliwe jest poddanie się działaniu 8-MOP_A komórek w miniaturowej komorze, zaleca się przeprowadzenie go oddzielnie, aby upewnić się, że tylko pożądany typ komórek jest narażony na działanie 8-MOP_A. Wcześniejsze badania wskazują, że tolerogenny efekt ECP jest pośredniczony przez komórki prezentujące antygen uszkodzony przez 8-MOP_A¹², podczas gdy efekt immunizujący wymaga uszkodzenia docelowych komórek nowotworowych 8-MOP_A¹¹. W protokole transimmunizacji zarówno komórki nowotworowe, jak i komórki odpornościowe mogą być selektywnie wystawione na działanie 8-MOP_A w razie potrzeby. Ponieważ wykazano, że maksymalizacja czasu kontaktu między komórkami nowotworowymi uszkodzonymi przez 8-MOP_A a komórkami dendrytycznymi (DC) indukowanymi przez ECP znacznie zwiększa zdolność immunoterapeutyczną klinicznej klasy ECP¹³, włączyliśmy do naszego protokołu etap koinkubacji przez noc. Po całonocnej inkubacji leczone komórki są zwracane zwierzęciu z nowotworem.

Ten system niezawodnie zmniejszył wzrost guza i zainicjował specyficzną odporność przeciwnowotworową u myszy z ustalonymi guzami syngenicznymi¹¹, i pozwolił nam przeanalizować mechanizm klinicznej skuteczności przeciwnowotworowej ECP. W kilku badaniach wykazaliśmy, że odporność ECP jest inicjowana poprzez aktywację płytek krwi ex vivo w TI plate^14,15. Aktywowane płytki krwi sygnalizują następnie dojrzewanie komórek monocytów do komórek dendrytycznych¹⁴, co prowadzi do produkcji fizjologicznych DC. Nowo utworzone DC pochodzące z monocytów są w stanie krzyżować zinternalizowane antygeny z komórek nowotworowych uszkodzonych przez 8-MOP_A, aby aktywować odpowiedzi limfocytów T specyficzne dla antygenu¹⁶. Jak zasugerowano wcześniej^12,17, jednakże, wywołane przez 8-MOP_A uszkodzenia powstających DC mogą przeciwdziałać lub nawet odwrócić efekt przeciwnowotworowy¹¹, zapewniając mechanistyczne powiązanie z tolerancją ECP.

Płytka TI została również użyta do produkcji fizjologicznie aktywowanych DC z ludzkiego PBMC. Podobnie jak w badaniach na myszach, ludzkie DC pochodzące z TI są zależne od pasażu płytki w obecności płytek krwi do ich wytwarzania, wydają się fenotypowo identyczne z tymi wytwarzanymi na klinicznej płytce ECP i są zdolne do wydajnego przetwarzania i krzyżowej prezentacji ludzkich antygenów nowotworowych w celu aktywacji ludzkich limfocytów T^11,16.

Odkrywając mechanizm immunoterapii ECP, odkryliśmy metodę szybkiego generowania fizjologicznych mysich i ludzkich komórek dendrytycznych o pożądanej swoistości antygenowej, które mogą być funkcjonalnie modulowane. Innowacyjne urządzenie i protokół TI mają duże potencjalne znaczenie w dziedzinie badań i terapii ECP oraz szerzej immunoterapii nowotworów, a także w każdej innej dziedzinie zainteresowanej fizjologicznymi, funkcjonalnymi komórkami dendrytycznymi zarówno w trybie immunizacji, jak i tolerancji. Mamy nadzieję, że niniejsza publikacja dostarczy niezbędnych narzędzi osobom zainteresowanym takimi obszarami badawczymi.

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody myszy zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Yale, w porozumieniu z National Institutes of Animal Healthcare Guidelines. Wszystkie badania na ludziach przeprowadzono z krwią oddaną przez zdrowych ochotników, za pisemną świadomą zgodą. Badania nad krwią ludzką zostały przeprowadzone zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi (np. Deklaracją Helsińską, CIOMS, Raportem Belmonta, Wspólnymi Regułami Stanów Zjednoczonych) i zostały zatwierdzone przez Yale Human Investigational Review Board na podstawie protokołu numer 0301023636.

UWAGA: Poniżej znajduje się protokół opisujący transimmunizację w terapii przeciwnowotworowej mysich guzów syngenicznych.

1. Implantacja guza syngenicznego YUMM1.7

1. Postępuj zgodnie z ustalonymi protokołami, aby wszczepić guzy syngeniczne w boki myszy, zgodnie z interesującą linią komórek nowotworowych.
   nuta: Poniższy protokół opisuje mysi model czerniaka YUMM1.7 C57BL/6. Komórki czerniaka YUMM1.7 zostały dzięki uprzejmości dr Bosenberga, Yale¹⁸.
2. Rozmrozić zamrożoną porcję komórek i użyć komórek po jednym pasażu komórkowym. Hodowla świeżo rozmrożonych komórek YUMM1.7 w zmodyfikowanej pożywce F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych, w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO₂ ).
   1. Zbierz komórki YUMM1.7 w zbiegu 60-70%, dodając tyle trypsyny-EDTA, aby pokryć dno płytki lub kolby do hodowli komórkowej (np. 4 ml dla kolby T75).
   2. Odpocznij naczynia do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej przez 3–4 minuty, delikatnie stukając od czasu do czasu w dno lub boki naczynia, aby pomóc w odłączeniu komórek.
   3. Dodać 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 4 ml kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby zatrzymać reakcję po odłączeniu większości komórek. Zebrać komórki, pipetując do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać kolbę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodać płukanie do tej samej probówki zbiorczej. Napełnij probówkę do 15 ml PBS.
   4. Wyjmij małą porcję i policz komórki.
   5. Wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do hodowli tkankowych, aby zebrać komórki nowotworowe.
3. Ponownie zawiesić komórki YUMM1.7 w PBS o gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml.
4. Wstrzyknąć 1 x 10⁵ komórek nowotworowych YUMM1.7 podskórnie w 100 μl PBS w prawe boki biorcy 4 do 6-tygodniowego samca C57BL/6J myszy typu dzikiego C57BL/6J, znieczulonego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. 3\u20125% gaz wziewny izofluranu, znieczulenie potwierdzone brakiem odruchu szczypania tylnej łapy).
5. Monitoruj objętość guza za pomocą dwutygodniowych pomiarów prostopadłych średnic i wysokości guza za pomocą suwmiarki. Obliczać YUMM1.7 (objętość guza jako długość guza x szerokość x wysokość)/2.
6. Rozpocznij terapię transimmunizacyjną, gdy guzy stają się po prostu wyczuwalne; w przypadku guzów YUMM1.7 jest to zwykle dzień 7-10 po implantacji guza.

2. Pobieranie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do transimmunizacji

1. Zbierz 100\u2012150 μl krwi od każdej myszy z guzem poprzez krwawienie z policzka.
2. Podczas pobierania krwi należy zebrać krew z każdej grupy leczonej myszami (każde 5 myszy eksperymentalnych + 5 myszy kontrolnych) w jednej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5000 U/ml heparyny. Użyj 10 μl 10% heparyny na 100 μl pobranej krwi.
   nuta: Często mieszaj probówkę podczas pobierania, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Podczas gdy myszy kontrolne z guzem mogą być wykrwawiane w tym samym czasie co myszy eksperymentalne, aby zapewnić równe warunki z grupą badaną, krew "kontrolna" może zostać albo odrzucona, albo połączona z krwią grupy leczonej w celu zapewnienia dodatkowego eksperymentalnego PBMC dla grupy leczonej, według uznania badaczy.
3. Ustaw jedną probówkę o pojemności 15 ml z 4 ml pożywki do izolacji limfocytów (patrz tabela materiałów) na 5\u201210 wykrwawionych myszy. Powoli nakładaj warstwę krwi (pobranej od myszy z nowotworem) na wierzchu pożywki. Wiruj komórki przez 20 minut w temperaturze 1,000-500 x g, aby oddzielić PBMC od czerwonych krwinek.
4. Pod koniec wirowania zebrać górną warstwę osocza, pozostawiając ~0,5 ml pozostałego nad kożuchem i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (krok 7.1).
5. Zebrać warstwę kożucha do czystej probówki o pojemności 15 ml, napełnić PBS do 15 ml i wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do hodowli tkankowych, aby zebrać PBMC.
6. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad, przesuwając rurkę. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać utracony. Dodać 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek ACK (patrz Tabela Materiałów) do probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe czerwone krwinki z PBMC. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
7. Napełnij probówkę PBS do 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do kultur tkankowych w celu zebrania PBMC.
8. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad przez strzepnięcie. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać zgubiony.
   nuta: Na tym etapie oczyszczony PBMC może być modyfikowany tak, jak najlepiej pasuje do eksperymentu. Różne składniki PBMC (płytki krwi, monocyty, inne typy komórek odpornościowych) mogą być zubożone lub wyizolowane z PBMC w razie potrzeby. Również sam PBMC może być narażony na działanie 8-MOP_A, przed lub po sekcji 4 (przed lub po przejściu płytki - po sekcji 2 lub przed sekcją 5), postępując zgodnie z krokami protokołu 3.3\u20123.8 i podstawiając PBMC na komórki YUMM1.7. Spowoduje to zmniejszenie zdolności immunogennej leczenia i zamiast tego będzie promować tolerancję immunologiczną.
9. Dla każdej grupy badanej (każde 5 myszy eksperymentalnych + 5 myszy kontrolnych) ponownie zawiesić osad PBMC w 300 μl FBS.

3. Leczenie komórek nowotworowych metodą 8-MOP/UVA

1. Hoduj i zbieraj komórki nowotworowe YUMM1.7 zgodnie z opisem w krokach 1.2–1.3, aby przygotować źródło antygenu komórek nowotworowych narażone na 8-MOP_A.
2. Przygotuj 2,5 x 10⁶ komórek nowotworowych YUMM1,7 na grupę leczoną 5 myszy. Dla każdej grupy leczonej ponownie zawieś osad komórek nowotworowych w FBS w temperaturze 2,5 x 10⁶ komórek/300 μL (~8,33 x 10⁶ komórek/ml).
3. Przy wyłączonych światłach okapu do hodowli tkankowej dodać 8-MOP (patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórek nowotworowych YUMM1.7, aby uzyskać końcowe stężenie 8-MOP 100 ng / mL.
   UWAGA: 8-MOP jest fotoaktywowanym środkiem uszkadzającym DNA i rakotwórczym. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się i dozowania, unikaj kontaktu z odsłoniętą skórą i odpowiednio wyrzuć.
4. Dobrze wymieszać komórki, owinąć pojemnik na komórki folią aluminiową i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
5. Wstępnie pokryj 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, wypełniając jedną studzienkę dla każdej grupy 5 myszy poddanych działaniu substancji (2,5 x 10⁶ komórek nowotworowych YUMM1,7) 1 ml FBS i przechowuj wypełnioną płytkę w lodówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Włącz źródło światła UVA, aby je wstępnie ogrzać.
   ostrożność: Światło UVA jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas pracy ze źródłami światła UVA pracuj szybko i ostrożnie, chroń skórę przed ekspozycją i używaj osłon twarzy lub okularów do ochrony twarzy i oczu.
7. Po 20 minutach przenieś schłodzoną 12-dołkową płytkę (krok 3.5) do okapu do hodowli tkankowej, usuń FBS z dołków i dodaj 300 μl (2,5 x 10⁶ komórek/dołek) komórek nowotworowych narażonych na MOP (od kroku 3.4) do dołka.
8. Wystawić płytkę zawierającą ogniwa na działanie wstępnie ogrzanego źródła światła UVA, aby uzyskać całkowite napromieniowanie 4 J/cm².
   nuta: Opisane tutaj stężenie 8-MOP i dawka UVA są skalibrowane dla linii komórek nowotworowych YUMM1.7. Miareczkowanie dawki 8-MOP/UVA, wystarczającej do spowodowania 100% śmierci komórek nowotworowych w ciągu 1 tygodnia od ekspozycji, powinno być przeprowadzone dla każdej eksperymentalnej linii komórek nowotworowych, w celu określenia skutecznej dawki zabijającej. Jest to niezwykle ważne dla eksperymentów TI in vivo na myszach, ponieważ komórki są ponownie wstrzykiwane po orbicie (krok 6.1), a zatem wszelkie nieuszkodzone komórki nowotworowe mogą w przeciwnym razie tworzyć guzy oka u leczonego zwierzęcia. Jako wskazówkę, 4\u20128 J/^cm2 UVA, 100\u2012200 ng/mL 8-MOP, jest typowym efektywnym zakresem dla większości linii komórek nowotworowych.
9. Zbierz komórki nowotworowe poddane działaniu_{8-MOP A} z każdej studzienki, obracając płytką i ostrożnie pipetując, aby zapewnić całkowite odzyskanie komórek.

4. Płyta TI Przejście komórek

1. Dla każdej grupy leczonej 5 myszy połączyć w jednej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml 300 μl odpowiedniego PBMC (z kroku 2.11) i 300 μl komórek nowotworowych traktowanych 8-MOP_A (z kroku 3.9). Wymieszaj komórki.
2. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby napełnić zestawy "wejściowe" i "wyjściowe" rurki TI (patrz
   Tabela materiałów) z FBS. Otwórz rurkę clamps, aby napełnić rurki, i zamknij zaciski po napełnieniu rurek przed odłączeniem strzykawki, aby utrzymać FBS wewnątrz rurki.
3. Użyj pipety P1000, aby dodać mieszaninę PBMC i komórek nowotworowych (z kroku 4.1) do płytki TI (patrz Tabela materiałów). Trzymaj płytkę pod kątem 45°, umieść końcówkę pipety bezpiecznie we wlocie płytki TI i powoli napełniaj płytkę, unikając pęcherzyków.
4. Wyjąć końcówkę pipety z wlotu przed zwolnieniem tłoka pipety. Płytka mieści 450 μl; Pozostałe komórki umieścić z powrotem w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.
5. Inkubować rurkę wypełnioną FBS, płytkę TI wypełnioną komórkami i stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Po inkubacji opróżnij rurkę TI grawitacyjnie, zwalniając zaciski.
6. Użyj pipety P1000, aby usunąć komórki z płytki TI, wkładając końcówkę pipety z tłokiem wciśniętym w port płytki. Trzymaj płytkę pod kątem 45° i napełnij końcówkę pipety P1000. Umieść komórki z powrotem w ich oryginalnej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.
7. Aby uruchomić płytę TI, podłącz rurkę wyjściową do płyty i przymocuj płytę TI do systemu jezdnego płyty.
8. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 600 μl mieszaniny PBMC i komórek nowotworowych z stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml, pozbyć się wszelkich pęcherzyków ze strzykawki, przymocować strzykawkę do rurki wejściowej z otwartym zaciskiem i powoli napełniać, aż płyn dotrze do końca rurki.
9. Przymocuj wolny koniec rurki wejściowej do płyty TI i kontynuuj delikatne ładowanie pozostałej objętości. Zamknij wejście clamp.
10. Odłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml i podłączyć rurkę wejściową do pompy strzykawkowej. Przymocuj rurkę wyjściową do czystej stożkowej rurki o pojemności 1.5 ml w celu pobrania komórek.
11. Wyreguluj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,09 ml/min, ale nie uruchamiaj jeszcze pompy. Przechylić płytkę TI o ~30° w kierunku strony pompy strzykawkowej, używając platformy do biegania z płytką TI lub w dowolny inny sposób (np. mały płaski przedmiot pod jednym końcem płytki).
12. Ostrożnie zwolnij zacisk na wężu wejściowym. Uruchomić pompę strzykawkową, uważnie obserwując, jak napełnia się płytka TI i w razie potrzeby przesunąć rurkę lub płytkę, jeśli pęcherzyki powietrza utrudniają przepływ.
13. Gdy płyta TI zostanie całkowicie napełniona, przechyl ją o ~30° w przeciwnym kierunku podczas opróżniania. Gdy wszystkie komórki i płyn znajdą się w stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml, zatrzymaj pompę.
14. Aby umyć płytkę TI, odłącz rurkę wejściową od pompy strzykawkowej, podłącz do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 600 μl FBS i postępuj zgodnie z procedurą dla kroków 4.8\u20124.9.
15. Wyreguluj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0.49 ml/min, zwolnij wejście clamp i uruchom płytkę TI zgodnie z opisem w krokach 4.12\u20124.13, zbierając płyn do tej samej stożkowej probówki o pojemności 1.5 ml. Delikatnie przesuwaj lub stukaj w płytkę TI przez cały czas, aby pomóc w odłączeniu i elucji wszelkich przylegających komórek.
16. Obracać stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml w laboratoryjnym mikrofugowaniu o sile 250 x g przez 8 minut. Wyrzucić supernatant.

5. Przygotowanie autologicznej surowicy mysiej do nocnego podłoża hodowlanego

1. Pobrać krew od 10-12-tygodniowych myszy C57BL/6J dowolną metodą zatwierdzoną przez instytucję (np. krwawienie z oka, krwawienie z żyły ogonowej, krwawienie z policzka lub końcowe wykrwawienie przez nakłucie serca), bez żadnych antykoagulantów. Oszacuj pobranie 1 ml krwi na każde potrzebne 300 μl surowicy.
   nuta: Potrzeba 300 μl surowicy na każdą grupę leczoną 5 myszy w eksperymencie.
2. Pozostawić krew do krzepnięcia przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Odwirowywać zakrzepłą krew w ilości 3 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie zebrać wierzchnią warstwę zawierającą surowicę
   nuta: Surowicę można natychmiast wykorzystać do przygotowania pożywki do inkubacji komórek przez noc (krok 6.1) lub zachować do przyszłych eksperymentów. Aby zachować surowicę, zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C.

6. Nocna koinkubacja PBMC z antygenem

1. Ponownie zawiesić PBMC i osad komórek nowotworowych (krok 4.5) w 2 ml przezroczystego RPMI z 15% autologiczną surowicą myszy (przygotowaną w kroku 5). Płytkę umieścić w sterylnym naczyniu o średnicy 35 mm bez hodowli tkankowej i inkubować przez noc w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO_{2 )}.
   nuta: Jeśli PBMC jest używany z antygenem niekomórkowym (peptyd, nanocząstka, białko itp.), należy pominąć sekcję 3 protokołu i przejść z sekcji 2 bezpośrednio do sekcji 4, dodając pożądany antygen do PBMC przepuszczonego przez płytkę TI w celu koinkubacji przez noc w kroku 6.1.
2. Następnego dnia ostrożnie odłącz wszelkie przylegające komórki od dna naczynia za pomocą skrobaka do kultur tkankowych, obracając naczynie podczas skrobania, aby zapewnić równomierne zbieranie komórek. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml.
3. Dodaj 2 ml PBS do naczynia i powtórz etap skrobania, zbierając komórki do tej samej probówki. Opłucz naczynie o średnicy 35 mm 1 ml PBS i dodaj płukankę do tej samej probówki.
4. Wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do kultur tkankowych w celu zebrania komórek. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad, przesuwając probówkę. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać utracony.

7. Ponowna iniekcja komórek leczonych TI myszom z nowotworem

1. Odwirowywać autologiczne osocze (przygotowane w kroku 2.4) w temperaturze 750 x g przez 15 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek. Zawiesić osad komórkowy (z kroku 6.4) w 600 μl osocza autologicznego lub PBS.
2. Wstrzyknąć komórki w dawce 100 μl na mysz do splotu zaoczodołowego odpowiednio znieczulonych (np. 3\u20125% gaz wziewny izofluranu, znieczulenie potwierdzone brakiem odruchu szczypania tylnej łapy) myszy eksperymentalnych z nowotworem. Jeśli jest to pożądane, należy ponownie wstrzyknąć myszom z grupą kontrolną nowotwór 100 μl samego osocza autologicznego lub PBS.
3. W przypadku myszy z guzem YUMM1.7 należy powtarzać zabieg (kroki 2–7.2) dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie, co daje w sumie 6 zabiegów. Zbieraj i przetwarzaj PBMC od myszy z nowotworem co tydzień (sekcje protokołu 2-4) w poniedziałki i czwartki, a następnie ponownie wlewaj po całonocnej inkubacji (sekcje protokołu 5-7) we wtorki i piątki.
   nuta: Ten schemat leczenia został opracowany z myślą o specyficznej kinetyce wzrostu guzów YUMM1.7 u myszy. Może być konieczne miareczkowanie dla innych układów nowotworowych o wolniejszym lub szybszym tempie wzrostu guza - odpowiednio zwiększając lub zmniejszając liczbę zabiegów.
4. Monitoruj objętość guza za pomocą dwutygodniowego pomiaru - najlepiej w momencie podawania terapii (wtorek i piątek) - prostopadłych średnic i wysokości guza za pomocą suwmiarki. Zakończ eksperyment, gdy kontrolne objętości guza osiągną maksymalny rozmiar dozwolony przez wytyczne i protokoły instytucjonalne.

8. Adaptacja protokołu do leczenia małych objętości krwi ludzkiej

1. Dostosuj protokół do stosowania z komórkami ludzkimi, najpierw izolując PBMC od ludzkiej krwi. Stosuj heparynę jako antykoagulant, z dowolnym preferowanym protokołem izolacji PBMC.
2. Upewnij się, że wyizolowana frakcja PBMC zawiera fizjologiczną liczbę płytek krwi, aby uzyskać najlepsze wyniki protokołu. Monitoruj liczbę płytek krwi przed i po izolacji PBMC za pomocą dowolnego standardowego licznika hematologicznego.
3. W przypadku korzystania ze źródła ludzkiego antygenu komórkowego należy traktować ludzkie komórki antygenowe zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3 dla komórek YUMM1.7. Miareczkować odpowiednio dawki 8-MOP i UVA.
4. Wykonać etapy przejścia płytki opisane w rozdziale 4, używając do 3 x 10⁷ PBMC na płytkę TI.
5. Hodowla PBMC przez noc z komórkowym/innym wybranym antygenem, jak opisano w punkcie 6, ale zastąp 15% ludzką surowicę AB autologicznym osoczem myszy pożywką do hodowli przez noc w kroku 6.1.
6. Użyj otrzymanych komórek w dowolnym teście. Na przykład współhodowla z limfocytami T reagującymi na antygen w celu obserwacji odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu zainicjowanych przez komórki traktowane TI.

Results

Niedawno opracowaliśmy skalowalne miniaturowe urządzenie ECP, płytkę TI (Rysunek 1A) i opracowaliśmy odpowiednie protokoły leczenia. Urządzenie i protokół odtwarzają kluczowe cechy komórkowe i in vivo uodparniania ECP, określane jako "uodparnianie przejściowe".

Protokół weryfikacji zasady mysich transimmunizacji¹¹ (Rysunek 1B) składa się z pozaustrojowego pasażu płytki TI komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od myszy z nowotworem wraz z apoptotycznymi komórkami nowotworowymi narażonymi na 8-MOP_A. Warto zauważyć, że komora TI jest przezroczysta i ma rozmiar dopasowany do standardowego formatu szkiełek mikroskopowych, co pozwala na łatwą wizualizację interakcji komórek w płytce TI w dowolnym punkcie protokołu (wideo 1). Komórki odpornościowe aktywowane płytką TI są inkubowane przez noc z apoptozą komórek nowotworowych narażonych na 8-MOP_A, ułatwiając wychwyt, przetwarzanie i transfer antygenów nowotworowych do DC. Następnego dnia współinkubowana mieszanina komórek jest zawracana do krwiobiegu zwierzęcia z guzem. Zwierzęta kontrolne poddawane są identycznym procedurom pobierania krwi, aby znormalizować wpływ limfodeplecji na wzrost guza, ale zamiast tego otrzymują ponowne wlewy PBS. Wzrost guza u wszystkich zwierząt jest monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu.

W badaniach wykorzystujących model syngenicznego czerniaka mysiego YUMM1.7¹⁸, protokół transimmunizacji powtarzano dwa razy w tygodniu przez trzy tygodnie, w sumie sześć zabiegów u każdego zwierzęcia (Rysunek 1B). Terapia wydawała się dobrze tolerowana u wszystkich leczonych zwierząt (>100) i konsekwentnie wykazywała zmniejszenie wzrostu guza YUMM1.7 u zwierząt leczonych w porównaniu z kontrolnymi, co zaobserwowano w 9 niezależnych eksperymentach przeprowadzonych przez 2 lata (Figura 2A, B). Wyniki pokazują skumulowane dane dotyczące wzrostu guza u zwierząt leczonych transimmunizacją i kontrolnych we wszystkich przeprowadzonych eksperymentach (Rysunek 2A), a także reprezentatywne krzywe wzrostu guza dla poszczególnych zwierząt w jednym eksperymencie, aby zapewnić poczucie zmienności w systemie (Rysunek 2B).

Stwierdziliśmy, że sukces protokołu zależy krytycznie od obecności monocytów w leczonym PBMC, obecności płytek krwi we frakcji PBMC oraz etapu przejścia płytki TI. Gdy pasaż płytki zostanie pominięty lub gdy płytki krwi lub monocyty są zubożone z frakcji PBMC, efekt terapeutyczny nie jest już obserwowany (Rysunek 3A). Leczenie wymaga również obecności apoptotycznych komórek nowotworowych. Jest nieskuteczny w przypadku braku komórek odpornościowych lub źródła antygenu lub w obecności niedopasowanego antygenu, na przykład, gdy myszy z guzami YUMM1.7 są leczone przy użyciu komórek raka jelita grubego MC38 (Figura 3B). Aby uzyskać wynik szczepienia, ważne jest również, aby unikać ekspozycji PBMC na 8-MOP_A. PBMC narażony na 8-MOP_A nie tylko znosi, a nawet odwraca odporność przeciwnowotworową (Figura 3C), ale także hamuje potencjał immunizacyjny komórek nienarażonych, jak w eksperymencie, w którym zastosowano równą liczbę PBMC narażonych na 8-MOP_A i chronionych przez 8-MOP_A bez zauważalnego efektu przeciwnowotworowego (Figura 3C).

W przypadku ludzkiego PBMC, komora TI i protokół transimmunizacji prowadzą do udanej aktywacji monocytów do DC, nieodróżnialnej przez powierzchnię komórki i wewnątrzkomórkowe markery aktywacji od tej osiągniętej przez kliniczną płytkę ECP (Tabela 1). Podobnie jak w badaniach na myszach, aktywacja DC (Figura 4A) i zdolność DC generowanych przez transimmunizację do przetwarzania i prezentowania antygenu (Figura 4B, C) krytycznie zależą od obecności płytek krwi w PBMC i pasażu płytki TI. Aktywowane transimmunizacją ludzkie DC mogą skutecznie przetwarzać i krzyżować antygeny peptydowe (Figura 4B) lub antygeny z całych ludzkich komórek nowotworowych narażonych na 8-MOP_A, w celu aktywacji linii limfocytów T specyficznych dla ludzkiego antygenu w testach in vitro (Figura 4C), w sposób zależny od TI i płytek krwi (Figura 4B, C).

Rysunek 1: Schematy komory transimmunizacji (TI) i protokołu. (A) Schemat i specyfikacja komory do leczenia transimmunizacji (płyta TI). (B) Schematyczny opis eksperymentalnego przebiegu leczenia transimmunizacyjnego. Krótko mówiąc, zwierzęta są szczepione podskórnie (s.c.) syngenicznymi komórkami nowotworowymi; zwierzęta z guzami wyczuwalnymi palpacyjnie są leczone dwa razy w tygodniu poprzez pobranie krwi, izolację PBMC z krwi, przejście przepływu PBMC przez autologiczną płytkę TI pokrytą płytkami krwi w obecności komórek nowotworowych traktowanych 8-MOP / UVA, współinkubację PBMC i komórek nowotworowych przez noc oraz ponowne wstrzyknięcie komórek dożylnie tym samym zwierzętom z nowotworem. Objętość guza jest mierzona przez cały czas trwania eksperymentu. Ten rysunek został zmodyfikowany z¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Transimmunizacja kontroluje wzrost guzów syngenicznych czerniaka YUMM1.7. (A) Objętość guza YUMM1.7 w czasie wykreślona dla myszy C57BL / 6 zaszczepionych 1 x 10⁵ komórkami nowotworowymi YUMM1.7 i otrzymujących sześć zabiegów transimmunizacji (linia) lub sześć terapii kontrolnych (szara linia). Dane są skumulowane w dziewięciu niezależnych eksperymentach przeprowadzonych w ciągu dwóch lat. (B) Dane z pojedynczego reprezentatywnego eksperymentu YUMM1.7 transimmunizaton, z każdą linią pokazującą wzrost guza dla pojedynczej myszy. (A i B) Myszy "kontrolne PBS" we wszystkich eksperymentach były wykrwawiane według tego samego harmonogramu co zwierzęta doświadczalne, ale otrzymały sześć sterylnych ponownych infuzji PBS. Słupki błędów reprezentują SEM, wartości p obliczone dla każdego punktu czasowego za pomocą testu wielokrotnych porównań Sidaka; **, p = 0,0013; , p < 0,0001. Ten rysunek został zmodyfikowany z¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Uodparnianie transimmunizacyjne wymaga monocytów i płytek krwi we frakcji PBMC przekazywanej przez płytkę TI, a także leczenia 8-MOP_A komórek nowotworowych dopasowanych antygenem i 8-MOP_A oszczędzających PBMC. (A) Objętość guza YUMM1.7 w czasie wykreślona dla myszy C57BL / 6 zaszczepionych 1 * 10⁵ komórkami nowotworowymi YUMM1.7 i otrzymujących sześć zabiegów uodparniania transimmunizacyjnego (ciągłe czarne linie), sześć terapii kontrolnych (ciągłe szare linie) lub sześć terapii TI, w których monocyty lub płytki krwi zostały pozbawione PBMC przed etapem pasażu płytki (przy użyciu zestawów do dezupulacji a-CD11b i a-CD41), odpowiednio) lub pominięto przejście płyty (linie przerywane). (B) Objętość guza w czasie wykreślona dla myszy C57BL / 6 zaszczepionych 1 x 10⁵ komórkami nowotworowymi YUMM1.7 i otrzymujących sześć zabiegów uodparniania transimmunizacyjnego (ciągłe czarne linie), sześć zabiegów kontrolnych (ciągłe szare linie), sam PBMC (linia przerywana), same komórki YUMM1.7 traktowane 8-MOP_A lub TI przy użyciu komórek nowotworowych MC38 traktowanych 8-MOP_A (linie przerywane). (C) Objętość guza w czasie wykreślona dla myszy C57BL / 6 zaszczepionych 1 x 10⁵ komórkami nowotworowymi YUMM1.7 i otrzymujących sześć zabiegów Transimmunizacji (ciągłe czarne linie), sześć zabiegów kontrolnych (ciągłe szare linie), sześć zabiegów TI, w których PBMC były jednolicie narażone na 8-MOP_A bezpośrednio przed pasażem płytki, sześć zabiegów TI, w których PBMC były jednolicie narażone na 8-MOP_A bezpośrednio po przejściu płytki lub sześć zabiegów, w których komórki TI po przejściu płytki zmieszano 1:1 z równą liczbą PBMC, które zostały równomiernie wystawione na napromieniowanie 8-MOP_A (linie przerywane). (A, B i C) Myszy "kontrolne PBS" we wszystkich eksperymentach były wykrwawiane według tego samego harmonogramu co zwierzęta doświadczalne, ale otrzymały sześć sterylnych ponownych infuzji PBS. Przedstawiono dane do reprezentatywnych eksperymentów. Słupki reprezentują SEM, wartości P obliczone dla każdego punktu czasowego za pomocą testu wielokrotnych porównań Sidaka; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = różnice nieistotne. Ten rysunek został zmodyfikowany z¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Protokół TI z komorą TI szybko indukuje dojrzewanie prądu stałego, unikalny profil aktywacji i zdolność aktywacji limfocytów T w ludzkim PBMC, w zależności od pasażu płytki i płytek krwi.
A. Analiza FACS wskazanych markerów w komórkach CD11c⁺ wśród świeżo wyizolowanego ludzkiego PBMC ("kontrola"), PBMC traktowanego protokołem TI ("TI"), lub PBMC traktowanego TI, w którym pominięto pasaż płytki, płytki krwi zostały zubożone za pomocą zestawu kulek a-CD41 przed pasażem płytki, lub wykonano oba powyższe działania. Dane podsumowują sześć niezależnych eksperymentów z udziałem trzech dawców krwi. Słupki reprezentują wartości średnie, podczas gdy słupki błędów reprezentują SEM. Wartości P dla każdego porównania obliczone za pomocą sparowanego testu t; *, p < 0,05; **, p < 0,01. Panele zostały zmodyfikowane z¹¹. B. Ludzkie PBMC zawierające płytki krwi lub zubożone w płytki krwi leczone TI inkubowano przez noc z nieistotnym peptydem (SIINFEKL) lub z długim peptydem dla białka HPV E7 związanego z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi. PBMC wykorzystano następnie do stymulacji ludzkiej linii limfocytów T CD8 specyficznie reaktywnej na peptyd E7. Stymulację limfocytów T mierzono produkcją IFNg po 5 dniach hodowli. (C) Ludzkie PBMC zawierające płytki krwi lub zubożone w płytki krwi leczone TI inkubowano wspólnie przez noc z linią komórkową raka płaskonabłonkowego głowy i szyi SCC61 leczoną 8-MOP_A, wykazującą ekspresję (SCC61 HPV E6/7) lub niewykazującą ekspresji (SCC61 bez HPV) antygenowych białek HPV E6 i E7¹⁹. PBMC wykorzystano następnie do stymulacji ludzkiej linii limfocytów T CD8 specyficznie reaktywnej na peptyd E7. Stymulację limfocytów T mierzono produkcją IFNg po 5 dniach hodowli. (B i C) Dane pokazują reprezentatywne eksperymenty z trzema powtórzeniami w każdym. Słupki reprezentują wartości średnie, podczas gdy słupki błędów reprezentują SEM. Wartości P dla każdego porównania obliczone za pomocą testu wielokrotnych porównań Sidaka; , p < 0,001; , p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział:

marker	parametr	Nieleczonych	Płytka ECP z protokołem TI	Tabliczka TI z protokołem TI	Wartość p ECP w porównaniu z TI
HLA-DR	Δ MIF	100,1 ± 42,4	od 439,8 ± 152,5	417,7 ± 152,2	Ns
Płyta CD80	Δ %	3,9 ± 1,1	22,3 ± 7,2	24,5 ± 7,2	Ns
Płyta CD83	Δ MIF	0,3 ± 0,2	53,3 ± 9,7	51,4 ± 17,4	Ns
Płyta CD86	Δ MIF	10,8 ± 1,7	103,9 ± 23,4	87,1 ± 17,6	Ns
LAUR	Δ MIF	54,5 ± 12	721,4 ± 183,6	528,7 ± 135,5	Ns
Protokół ICAM1	Δ MIF	12,2 ± 1,6	179,6 ± 28,5	192,5 ± 25,4	Ns
ITGB5	Δ MIF	53,6 ± 25,7	97,1 ± 31,6	103,8 ± 32,8	Ns
CCL2 (MCP-1)	Δ %	0,6 ± 0,5	70,1 ± 6,7	55,2 ± 8,9	Ns
CXCL5	Δ %	0,7 ± 0,4	39,1 ± 7,2	41,5 ± 4,7	Ns
CXCL16	Δ %	0,3 ± 0,2	28,0 ± 8,8	35,3 ± 11,7	Ns
CD105 (endoglin)	Δ MIF	3,6 ± 0,3	124,3 ± 25,4	141,8 ± 33,2	Ns
CD112 (nektyna 2)	Δ MIF	10,9 ± 1,8	47,3 ± 5,2	50,9 ± 9,2	Ns
CD120a (TNFR-1)	Δ MIF	10,1 ± 2,6	2,2 ± 1,4	1,8 ± 1,1	Ns
CD137L (4-1BBL)	Δ MIF	2,9 ± 1,5	1,0 ± 0,4	1,2 ± 0,6	Ns

Tabela 1: Protokół TI z komorą TI szybko indukuje dojrzewanie DC równoważne temu wywołanemu przez protokół TI z kliniczną komorą ECP. Analiza FACS zmiany wskazanych markerów z odpowiadających im kontroli IgG w żywych ludzkich komórkach CD11c+ wśród świeżo wyizolowanych PBMC ("nieleczonych"), PBMC przechodzących przez kliniczną płytkę ECP zgodnie z protokołem TI ("płytka ECP z protokołem TI") i analizowanych po inkubacji przez noc lub PBMC traktowanych protokołem TI ("płytka TI z protokołem") i analizowanych po inkubacji przez noc. W przypadku markerów, takich jak HLA-DR, w których cała populacja komórek została zmieniona, dane są wyrażone jako zmiana średniej intensywności fluorescencji (MFI). W przypadku markerów, w których tylko podzbiór komórek wyraża marker, takich jak CCL2, zamiast tego reprezentowana jest różnica w procentach komórek markerowo-dodatnich żywego PBMC CD11c +. Dane podsumowują sześć niezależnych eksperymentów z udziałem trzech dawców krwi. Dane dla każdego markera są wyrażone jako średni błąd standardowy średniej (SEM) ±. wartości P dla każdego porównania obliczone przy użyciu testu t sparowanego; NS = różnice nieistotne. Tabela została zmodyfikowana z¹¹.

Wideo 1: Obrazowanie żywych komórek interakcji płytek krwi i komórek odpornościowych w płytce TI.
PBMC przygotowano zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu powyżej i wystawiono na działanie płytki uodparniającej, jak opisano w sekcji 4, z wyjątkiem okresu inkubacji statycznej w kroku 4.2.3, który został skrócony z 1 godziny do 30 minut. Podczas protokołu TI płytka TI, która jest identyczna pod względem wielkości ze standardowym szkiełkiem mikroskopowym, została umieszczona w stopniu trzymania szkiełka systemu obrazowania fluorescencyjnego, a komórki w jej wnętrzu zostały zobrazowane w 40-krotnym powiększeniu i w temperaturze 37 °C podczas etapów napełniania płytki (4.2.2), inkubacji płytki (4.2.3) i przepływu płytki (4.3.5). Ciągłe obrazy były pozyskiwane, a filmy produkowane za pomocą oprogramowania "Automated Scanning Routine". Podpisy pod filmem wskazują na etap protokołu, w którym komórki są filmowane. Strzałki i okręgi w filmie wraz z powiązanymi podpisami wskazują komórki i obszary zainteresowania. Pasek skali 10 μM jest obecny w prawym dolnym rogu całego filmu. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Discussion

Zminiaturyzowane urządzenie i opisany powyżej protokół po raz pierwszy pozwalają na efektywne badanie laboratoryjne mechanizmów ECP w mysich układach doświadczalnych oraz w małych próbkach krwi ludzkiej. To wielki postęp; Na przykład pozwoliło nam to po raz pierwszy zademonstrować skuteczność transimmunizacji przeciwko guzom litym w mysim modelu ¹¹, otwierając przyszłą możliwość podobnego zastosowania w onkologii u ludzi.

Przed opracowaniem opisanego tutaj urządzenia i metody transimmunizacji niemożliwe było pełne zbadanie wszystkich aspektów ECP. W modelach mysich, chociaż aspekt terapii 8-MOP_A można było nieco odtworzyć poprzez traktowanie komórek na szalce Petriego^12,20, nie było zdolności do zintegrowania z metodą pasażu płytki, która, jak wykazano, zapewnia dynamiczne interakcje płytek krwi, które są krytycznie ważne dla fizjologicznej aktywacji ECP DC¹⁴. W badaniach na ludziach, alternatywnie, składnik przepływu był w pełni obecny, ale brakowało zdolności do selektywnego wystawiania określonych składników komórkowych na działanie 8-MOP_A lub ochrony przed nim^21,22. Uniemożliwiało to pełne zrozumienie mechanizmu ECP i jego optymalizację pod kątem odporności czy tolerancji. Ponadto ilość krwi potrzebna do pracy z klinicznym aparatem ECP jest duża, co utrudnia badania naukowe. Opisane tutaj po raz pierwszy zminiaturyzowane urządzenie i protokół ECP pozwalają na wydajne, w pełni elastyczne i przestrajalne laboratoryjne modelowanie ECP. Ponadto płytka TI pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym i monitorowanie interakcji komórek w płytce za pomocą mikroskopii.

Aby protokół zakończył się sukcesem przy użyciu zarówno systemów in vivo, jak i ex vivo, niezwykle ważne jest, aby leczony PBMC zawierał monocyty, które mogą być aktywowane do funkcjonalnych DC. Aby ta aktywacja mogła przebiegać, konieczne jest również upewnienie się, że frakcja PBMC zawiera fizjologiczną liczbę zdrowych, aktywowanych płytek krwi oraz że protokół pasażu płytki TI jest ściśle przestrzegany. Aby skierować nowo aktywowane DC w kierunku określonej reaktywności, należy je zaopatrzyć w antygen. Odkryliśmy, że najbardziej efektywną metodą dostarczania antygenu w celu uzyskania odporności przeciwnowotworowej jest nocna koinkubacja nowo aktywowanych DC z komórkami nowotworowymi zawierającymi antygen 8-MOP_A. Ma to tę dodatkową zaletę, że jest w stanie stworzyć immunogenną odpowiedź przeciwnowotworową bez konieczności wcześniejszej wiedzy na temat antygenów nowotworowych, umożliwiając DC ich selekcję. Jednak w przypadkach, gdy antygen jest znany, odnieśliśmy pewien sukces w systemach ex vivo, gdy używaliśmy wolnych peptydów jako antygenów we wspólnej inkubacji. W przypadku zastosowań immunogennych same DC powinny być chronione przed_narażeniem na 8-MOP A. Wreszcie, w eksperymentach in vivo, ważne jest, aby pracować z modelem zwierzęcym, który jest zdolny do odporności przeciwnowotworowej. Transimmunizacja działa poprzez tworzenie aktywowanych, specyficznych dla antygenu DC , które działają w organizmie w celu zainicjowania wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Upośledzona aktywność lub brak limfocytów T NK, CD4 lub CD8 u leczonej myszy wpłynie na skuteczność protokołu ^5,11.

Chociaż opisany tutaj protokół jest dowodem słuszności zasady, który został zoptymalizowany dla mysiego modelu guza syngenicznego litego, niemniej jednak ujawnia wiele możliwości. Mechanizmy ECP w onkologii dopiero się wyjaśniają i wciąż jest wiele miejsca na lepsze zrozumienie. W szerszym ujęciu, zdolność do generowania fizjologicznie aktywowanych mysich i ludzkich DC oraz selektywnego kierowania ich w kierunku odporności specyficznej dla antygenu ma wiele potencjalnych zastosowań poza rakiem. Zdolność do zrobienia tego samego, ale zamiast tego skierowania DC w kierunku tolerancji specyficznej dla antygenu, jak sugeruje tolerancyjna skuteczność samego ECP, ma również szerokie implikacje medyczne. Mamy nadzieję, że dzięki tej metodzie dostarczymy narzędzi i otworzymy produktywną ścieżkę badań dla każdego, kto jest zainteresowany fizjologicznymi terapiami DC.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)	Therakos, Inc	Tylko Rx, NDC nr 64067-0216-01	Kroki protokołu 3 i 8 - mysie i ludzkie leczenie komórek 8-MOP/UVA
Surowica AB	Lonza BioWhittaker	14-498E	Protokół krok 8.5 - nocna hodowla ludzkiego PBMC
ACK bufor do lizy czerwonych krwinek	Lonza BioWhittaker	10-548E	Protokół krok 2 - przygotowanie
PBMC u myszyAnestezjologiczny system stołowy V1 z aktywnym oczyszczaniem	VetEquip	901820	Kroki protokołu 1 i 7 - wprowadzenie guza sc myszy i podanie TI
Autologiczne osocze myszy	przygotować w laboratorium	n/a	Przygotuj się zgodnie z krokiem protokołu 2.4, użyj w  7.1 - podawanie leczenia TI u myszy
Autologiczna surowica myszy	przygotować w laboratorium	n/a	Przygotuj się zgodnie z krokiem 5 protokołu, użyj w kroku 6.1 - nocna hodowla myszy PBMC
C57Bl / 6J	labs	0000664	Kroki protokołu 1, 2, 5 i 7 - wstrzyknięcie guza myszy, pobranie krwi/surowicy i powrót terapii
Krwawienie z policzka Nakłuwacz nawłociowy, 5 um	Medipoint	9891620	Protokół krok 2 - przygotowanie PBMC myszy
Clear RPMI	Gibco firmy LifeTech	11835-030	Kroki protokołu 6 i 8 - całonocna hodowla myszy / człowieka PBMC
DMEM / F12	Gibco firmy LifeTech	11330-032	Kroki protokołu 1 i 2 - Hodowla komórkowa YUMM1.7
EasyGrip Szalki Petriego EasyGrip, 35 mm			Falcon 351008 Kroki protokołu 5 i 8 - całonocna hodowla myszy / człowieka PBMC
Probówki stożkowe Eppendorf 1,5 ml DOT	1700-GMT	Kroki protokołu 1-8
FBS (płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie)	SAFC Biosciences	12306C-500mL	Kroki protokołu 1-4 - hodowla komórkowa YUMM1.7, leczenie komórek 8-MOP/UVA, płytka TI
Licznik hematologiczny Hemavet 950FS	Drew Scientific	HV950FS	Protokół krok 8.2 - monitorowanie liczby płytek krwi u ludzi
Heparyna 5,000U/ml	McKesson Usługi pakowania	949512	Kroki 2 i 8 protokołu - przygotowanie PBMC u myszy i ludzi
Isoflurane	Abbott Laboratories	5260-04-05	Kroki protokołu 1 i 7 - wprowadzenie guza sc myszy i podanie TI
Pożywka do izolacji limfolitów M	Protokół Cedarlane Labs	CL5035	Krok 2 - mysi preparat PBMC
Aminokwasy endogenne	Gibco firmy LifeTech	11140-050	Kroki protokołu 1 i 2 - YUMM1.7 hodowla komórkowa
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)	Gibco by LifeTech	14190-144	Kroki protokołu 1-7
Pióro/paciorkowiec	Gibco by LifeTech	15140-122	Kroki protokołu 1 i 2 - Hodowla komórkowa YUMM1.7
Polipropylenowe rurki stożkowe 15 ml	Falcon	352097	Kroki protokołu 1-8
Programowalna 2-kanałowa pompa strzykawkowa	New Era Pump Systems Inc	model NE-4000	Kroki protokołu 4 i 8 - uruchamianie płytki TI
Igły do wstrzykiwań retro-orbitalnych, 27G x 1/2	Protokół BD Biosciences		305109 krok 7 - podawanie leczenia TI u myszy
Strzykawki, 10 ml (LUER-LokTip)	Protokół BD Biosciences	309604	kroki 4, 8 - uruchamianie płytki TI
Strzykawki, 1 ml (końcówka poślizgowa)	Protokół BD Biosciences	309659	kroki 1, 4, 7, 8
Zestaw płytek i przewodów TI	Transimmune AG	niedostępne w handlu	Prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem lub firmą Transimmune w celu uzyskania urządzenia na zasadzie współpracy.
Platforma do biegania płytowego TI	Transimmune AG	niedostępna na rynku	Prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem lub firmą Transimmune w celu uzyskania urządzenia na zasadzie współpracy.
Kolby do hodowli tkankowych, T75 (75 cm2)	Falcon	353136	Protocol etapy 1, 2, 6 i 8 - hodowla komórek mysich i ludzkich
Płytki do hodowli tkankowych, 12-dołkowe	Falcon	353043	Protocol kroki 3 i 8 - mysie i ludzkie leczenie komórek 8-MOP/UVA
Skrobaki do kultur tkankowych	Falcon	353085	Protocol etapy 6 i 8 - całonocna hodowla trypsyny-EDTA u myszy/człowieka PBMC
0,25% (1x)	Gibco by LifeTech	25200-056	Kroki protokołu 1 i 2 - Igły do wstrzykiwań guza do hodowli komórkowych YUMM1.7
, 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Protocol krok 1 - wprowadzenie guza podskórnego myszy
Promiennik UVA	Johnson and Johnson	nie jest dostępny na rynku	Aparatura została specjalnie opracowana przez J& J jak laboratorium prof. R. Edelsona. W laboratorium dostępnych jest kilka maszyn współpracujących ze sobą; prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem w celu skorzystania z jednego z nich. Alternatywne promienniki UVA są dostępne na rynku, ale nie zostały przez nas przetestowane.
System obrazowania Invitrogen EVOS FL Auto 2	Przyrząd do obrazowania fluorescencyjnego	Invitrogen