Międzyfazowe struktury molekularne polimerów i biomakrocząsteczek ujawnione za pomocą spektroskopii oscylacyjnej generacji częstotliwości sumarycznej

Summary

Wszechstronnie wykorzystywana, spektroskopia oscylacyjna generowania częstotliwości sumy (SFG) może pomóc w ujawnieniu kolejności konformacyjnej łańcucha i wtórnych zmian strukturalnych zachodzących na granicy faz polimerów i biomakromolekuł.

Abstract

Jako nieliniowa spektroskopia optyczna drugiego rzędu, spektroskopia oscylacyjna z generowaniem częstotliwości sumy (SFG) jest szeroko stosowana w badaniu różnych powierzchni i interfejsów. Ta nieinwazyjna technika optyczna może dostarczyć lokalnych informacji na poziomie molekularnym z czułością jednowarstwową lub submonowarstwową. Przedstawiamy tutaj eksperymentalną metodologię, w jaki sposób selektywnie wykrywać zakopany interfejs zarówno dla makrocząsteczek, jak i biomakrocząsteczek. Mając to na uwadze, omówiono międzyfazowe struktury drugorzędowe fibroiny jedwabiu oraz struktury wodne wokół modelowego dupleksu oligonukleotydowego o krótkich łańcuchach. Pierwszy z nich wykazuje nakładanie się łańcuch-łańcuch lub efekt przestrzennego uwięzienia, a drugi wykazuje funkcję ochronną przed jonami^Ca2+ wynikającymi z chiralnej nadbudowy kręgosłupa wody.

Introduction

Rozwój spektroskopii oscylacyjnej z generowaniem częstotliwości sumy częstotliwości (SFG) można datować na prace wykonane przez Shen et al. trzydzieści lat temu^1,2. Unikalność selektywności międzyfazowej i czułości submonowarstwowej sprawia, że spektroskopia oscylacyjna SFG jest doceniana przez dużą liczbę badaczy w dziedzinach fizyki, chemii, biologii, materiałoznawstwa itp^3,4,5. Obecnie przy użyciu SFG badany jest szeroki zakres zagadnień naukowych związanych z powierzchniami i granicami faz, zwłaszcza w przypadku złożonych interfejsów w odniesieniu do polimerów i biomakrocząsteczek, takich jak struktury łańcuchowe i relaksacja strukturalna na zakopanych interfejsach polimerów, drugorzędowe struktury białkowe i międzyfazowe struktury wodne^{9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}.

Dla powierzchni i interfejsów polimerowych, próbki cienkowarstwowe są zazwyczaj przygotowywane przez powlekanie wirowe w celu uzyskania pożądanych powierzchni lub interfejsów. Problem wynika z zakłóceń sygnału z dwóch interfejsów przygotowanych folii, co prowadzi do niedogodności związanych z analizą zebranych widm SFG^27,28,29. W większości przypadków pożądany jest sygnał wibracyjny tylko z jednego interfejsu, folii/podłoża lub folii/drugiego medium. W rzeczywistości rozwiązanie tego problemu jest dość łatwe, a mianowicie eksperymentalnie zmaksymalizować pola świetlne na pożądanym interfejsie i zminimalizować pola świetlne na drugim interfejsie. W związku z tym współczynniki Fresnela lub lokalne współczynniki pola muszą zostać obliczone za pomocą modelu cienkowarstwowego i zweryfikowane w odniesieniu do wyników eksperymentalnych^{3,9,10,11,12,13,14,15,30}.

Mając na uwadze powyższe, niektóre interfejsy polimerowe i biologiczne mogłyby zostać zbadane w celu zrozumienia podstawowej nauki z poziomu molekularnego. Poniżej weźmy jako przykłady trzy zagadnienia międzyfazowe: sondowanie powierzchni poli(2-hydroksyetylometakrylanu) (PHEMA) i zakopanego interfejsu z podłożem⁹, tworzenie drugorzędowych struktur fibroiny jedwabiu (SF) na powierzchni polistyrenu (PS) i struktur wodnych otaczających modelowy krótkołańcuchowy oligonukleotyd duplex^16,21pokażemy, w jaki sposób spektroskopia oscylacyjna SFG pomaga ujawnić międzyfazowe struktury na poziomie molekularnym w związku z podstawową nauką.

Protocol

1. Eksperymentalne SFG

1. Użyj komercyjnego pikosekundowego systemu SFG (Tabela Materiałów), który zapewnia podstawową wiązkę 1064 nm o szerokości impulsu ~20 ps i częstotliwości 50 Hz, opartą na laserze Nd:YAG.
2. Zamień podstawową wiązkę 1064 nm na wiązkę 532 nm i wiązkę 355 nm, używając modułów drugiej i trzeciej harmonicznej. Bezpośrednio poprowadź wiązkę 532 nm jako wejściową wiązkę światła i wygeneruj drugą wejściową wiązkę średniej podczerwieni (IR) obejmującą zakres częstotliwości od 1000 do 4000 ^cm-1 w procesie optycznej generacji parametrycznej (OPG)/optycznego wzmocnienia parametrycznego (OPA)/generowania częstotliwości różnicowej (DFG).
3. Ustaw kąty padania dwóch wiązek wejściowych odpowiednio na 53° (IR) i 64° (widzialność) w stosunku do normalnej powierzchni.
4. Aby wykryć struktury międzyfazowe polimeru (interfejs folia/podłoże lub interfejs folia/inne medium), użyj kombinacji polaryzacji ssp (s-spolaryzowana wiązka o zmiennej częstotliwości, s-spolaryzowana wiązka widzialna i p-spolaryzowana wiązka podczerwieni) i ppp.
5. Do wykrycia międzyfazowych struktur białkowych drugorzędowych i struktur wodnych otaczających DNA, oprócz ssp i ppp, zastosowano chiralne kombinacje polaryzacji spp i psp.
6. Aby upewnić się, że próbki nie zostały uszkodzone, kontroluj energie impulsów w podczerwieni i widzialnym odpowiednio na poziomie ~70 i ~30 μJ. Schemat procesu SFG wraz z wykresem poziomu energii został pokazany w Rysunek 1. Rysunek 2 pokazuje system SFG w naszym czystym pomieszczeniu.

2. Współczynniki Fresnela

1. Użyj pryzmatów pod kątem prostym jako substratów dla wszystkich omawianych tutaj eksperymentów. Istnieją dwa interfejsy dla folii polimerowej na podłożu stałym, tj. powierzchnia polimeru w powietrzu i granica faz polimer/podłoże. Oba mogą generować sygnały SFG, ponieważ symetria inwersyjna jest złamana na obu interfejsach. W związku z tym zebrane widmo SFG jest widmem zakłóconym. Jednak współczynniki pola lokalnego lub współczynniki Fresnela na dwóch interfejsach można regulować, zmieniając kąty padania lub grubość warstwy pojedynczo lub jednocześnie^31,32. Daje nam to możliwość sondowania sygnału wibracyjnego SFG tylko z jednego interfejsu. W tym przypadku jako przykład wzięto film PHEMA na pryzmacie CaF₂⁹.
2. Jak pokazano na rysunku Rysunek 3, wykorzystaj geometrię pryzmatu pod kątem prostym do wykrywania sygnałów SFG generowanych z dolnej warstwy PHEMA. Natężenie wyjściowe SFG w trybie odbitym jest wyrażone jako
   (1)
   gdzie oznacza efektywny tensor podatności nieliniowej drugiego rzędu.
   składa się z trzech części, a mianowicie: granicy faz pryzmat/polimer, granicy faz polimer/dolny ośrodek (dolny ośrodek zawiera gaz, ciecz lub ciało stałe.) oraz tła nierezonansowego, jak pokazano w poniższym równaniu.
   (2)
   Tutaj dolnym medium może być powietrze, woda lub coś innego. F oznacza odpowiedni współczynnik Fresnela odpowiedzialny za lokalną poprawkę pola.
3. Zastosuj model cienkowarstwowy, aby obliczyć współczynniki Fresnela w tym przypadku. W tym miejscu przedstawiono tylko krótkie procedury obliczeniowe.
   1. W przypadku granicy pryzmatów/polimerów użyj
      (3)
      (4)
      (5)
      Znaczenie każdego z przedstawionych parametrów przedstawiono poniżej.
      1. ω_i oznacza częstotliwość wiązki.
      2. t_p i _{t s} oznaczają całkowite współczynniki transmisji i mogą być wyrażone jako
         (6)
         (7)
      3. T_P12 i _{T S12} oznaczają liniowe współczynniki transmisji wiązki światła na granicy faz pryzmat/polimer.
      4. R_P23 i R_S23 oznaczają współczynniki odbicia liniowego wiązki światła na granicy faz polimer/ośrodek.
      5. α reprezentuje różnicę faz między wiązką odblaskową a jej wtórną wiązką odblaskową po rozchodzącej się przez cienką warstwę polimeru, a następnie odbiciu z powrotem, co można wyrazić jako
         (8)
      6. λ oznacza długość fali wiązki światła, a d to grubość warstwy polimeru.
      7. Φ₁ i Φ₂ reprezentują kąty padania odpowiednio na granicy faz pryzmat/polimer i na granicy faz polimer/medium.
      8. N₁ i n₂ reprezentują współczynniki załamania światła odpowiednio pryzmatu i folii polimerowej.
      9. N₁₂ oznacza współczynniki załamania światła warstw międzyfazowych polimeru dla pryzmatu/polimeru.
   2. W przypadku granicy faz polimer/medium użyj
      (9)
      (10)
      (11)
      1. Δ reprezentuje różnicę faz pól elektrycznych światła na dwóch granicach.
      2. Ponieważ szerokość impulsu dla naszych wiązek wejściowych wynosi ~20 ps, błąd wynikający z opóźnienia czasowego związanego z efektem dyspersji można pominąć.
      3. Wyrażenie takiej różnicy faz dla wyjściowej SFG, wejściowej widzialnej i wejściowej wiązki podczerwieni można zapisać oddzielnie jako
         (12)
         (13)
         (14)
          
4. Z powyższego omówienia, dla układu pryzmat-polimer folia-medium (1-2-3), wyraź całkowite współczynniki Fresnela dla granicy faz pryzmat/polimer i polimer/medium w następujący sposób: dla kombinacji polaryzacji ssp i ppp. Oczywiście oba interfejsy są uważane za azymutalnie izotropowe.
   1. Dla granicy faz pryzmat/polimer wyrażenia całkowitych współczynników Fresnela zarówno dla kombinacji polaryzacji ssp, jak i ppp przedstawiono w następujący sposób.
      1. Dla ssp równanie jest następujące
         (15)
      2. A dla ppp równanie to
         (16)
         (17)
         (18)
         (19)
          
      3. T₁₀ i t₀₁ oznaczają współczynniki transmisji liniowej odpowiednio na granicy faz powietrze/pryzmat i pryzmat/powietrze.
   2. Dla granicy faz polimer/medium wyrażenia całkowitych współczynników Fresnela zarówno dla kombinacji polaryzacji ssp, jak i ppp są opisane w następujący sposób.
      1. Dla ssp równanie jest następujące
         (20)
      2. W przypadku ppp równania są następujące:
         (21)
         (22)
         (23)
         (24)
         
          
5. Po obliczeniu współczynników Fresnela przy użyciu modelu warstwowego należy je wykreślić jako funkcję grubości warstwy, jak pokazano na rysunku 4.
   UWAGA: W tym przypadku istnieje zakres grubości do zbierania sygnału SFG z interfejsu pryzmatu CaF₂/PHEMA z pomijalnym udziałem drugiego interfejsu, który wynosi około 150 nm. Podobnie, można wybrać odpowiednią grubość do wykrywania granicy faz PHEMA/dolny ośrodek z pomijalnym udziałem interfejsu pryzmatu CaF₂/PHEMA.

3. Kombinacja polaryzacji C hiral SFG

1. Dla normalnego interfejsu achiralnego zwykle używa się symetrii C_∞v w odniesieniu do średniej zespołu^33,34. Przy działaniu symetrii inwersji można wydedukować niezerowe składowe tensora podatności nieliniowej drugiego rzędu, którymi są c_xxz, c_xzx, c_{zxx, c yyz, c yyz,} c_yzy, c_zyy i c_zzz (istniejące składniki można dodatkowo zredukować, jeśli założy się interfejs izotropowy, co oznacza, że x i y są takie same). Jednak w przypadku interfejsu chiralnego sytuacja będzie inna. Interfejs chiralny posiada symetrię C∞, dozwolona jest tylko operacja symetrii obrotu. W tym przypadku, oprócz normalnych warunków achiralnych, więcej podatności nieliniowych drugiego rzędu będzie niezerowych, które można określić jako terminy chiralne, a mianowicie c_zyx, c_zxy i c_yzx z uwzględnieniem rezonansu nieelektronicznego. W związku z tym, używając kombinacji polaryzacji psp, pps i spp, można zbierać chiralne widma SFG^33,34.

4. Przygotowanie próbki

1. Przygotowanie filmu PHEMA
   1. Rozpuścić proszek PHEMA (patrz tabela materiałów) w bezwodnym etanolu, aby przygotować roztwór o stężeniu odpowiednio 2% i 4% wag.
   2. Przed nałożeniem warstw PHEMA należy najpierw namoczyć pryzmaty kątowe CaF₂ w rozpuszczalniku toluenowym, a następnie umyć je etanolem i ultraczystą wodą (18,2 MΩ·cm).
   3. Następnie wystawić podłoża (pryzmaty kątowe CaF₂) na działanie plazmy tlenowej, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia organiczne za pomocą środka do czyszczenia plazmowego (patrz Tabela materiałów).
      1. Najpierw włącz myjkę plazmową i umieść w niej podłoża.
      2. Następnie włącz pompę próżniową, aby odkurzyć odkurzacz. Wprowadź do niego tlen.
      3. Na koniec ustaw 4 minuty na czyszczenie. Następnie należy zachować czyste podłoża do sekwencyjnego przygotowania filmu PHEMA.
      4. Następnie przygotuj folie PHEMA na pryzmatach CaF₂ za pomocą wir-coatera (patrz Tabela Materiałów). Dostosuj grubość folii za pomocą stężenia roztworu i prędkości wirowania.
         1. Unieruchomić pryzmat CaF₂ na tarczy ssącej wirówki.
         2. Upuść jedną kroplę przygotowanego wcześniej roztworu PHEMA na czyste podłoża z prędkością 1 500 obr./min na 1 minutę (grubość warstwy 2% wag. dla 100 nm i 4% wag. dla 200 nm).
      5. Wszystkie przygotowane folie PHEMA wyżarzać w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C przez noc.
2. Przygotowanie fibroiny jedwabnej (SF)
   UWAGA: Protokół zaproponowany przez Kaplana i wsp.³⁵ został przyjęty.
   1. Umieścić 7,5 g jedwabnych kokonów B. mori we wrzącym roztworze wodnym węglanu sodu (Na₂CO₃, 0,02 M) na 30 minut. Wyjmij włóknisty SF do czystego pojemnika.
   2. Otrzymany włóknisty SF przemyć trzykrotnie wodą dejonizowaną pod mieszaniem w celu usunięcia cząsteczek serycyny i pozostawić tylko cząsteczki SF w próbce włóknistej.
   3. Suszyć włóknistą próbkę SF w piecu próżniowym w temperaturze 60 °C przez noc.
   4. Następnie rozpuścić odgumowaną włóknistą próbkę SF w wodnym roztworze bromku litu (LiBr, 9,3 M) (1 g SF rozpuszczono w ~4 ml roztworu LiBr) i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny przy mieszaniu.
   5. Roztwór SF należy dializować z wodą dejonizowaną (worki dializacyjne 3 500 Da) przez 3 dni w celu usunięcia rozpuszczonego LiBr. Wymieniaj nową wodę dejonizowaną trzy razy dziennie. Na koniec należy przechowywać przetworzony roztwór SF w temperaturze 4 °C do późniejszych eksperymentów SFG.
3. Przygotowanie dupleksu oligonukleotydów krótkołańcuchowych
   1. Zamów jednoniciową próbkę oligonukleotydu z jego końcem 3' zmodyfikowanym glikolem cholesterolowo-trietylenowym (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') z korporacji handlowej (patrz Tabela materiałów), a także próbkę komplementarną. Dla każdej pojedynczej nici rozpuścić 10 nmol próbki proszku w 0,5 ml ultraczystej wody. Następnie wymieszaj je ze sobą, tworząc dupleksowy roztwór oligonukleotydu (10 nmol/ml).
   2. Zmieszać 2 mg 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) i 2 mg deuterowanego DPPC (d-DPPC) i rozpuścić je w 1 ml chloroformu w celu przygotowania roztworu lipidowego.
   3. Przygotowanie monowarstwy DPPC i d-DPPC za pomocą koryta Langmuira-Blodgetta (LB)
      1. Przymocuj pryzmat CaF₂ pod kątem prostym do domowego uchwytu na próbkę z jedną powierzchnią pryzmatyczną, prostopadle zanurzoną w środowisku wodnym koryta LB.
      2. Następnie należy wstrzyknąć przygotowany wcześniej zmieszany roztwór lipidowy na powierzchnię wody, aż ciśnienie powierzchniowe osiągnie pewną wartość poniżej 34 mN·m⁻¹.
      3. Po ustabilizowaniu się ciśnienia powierzchniowego należy użyć dwóch barier teflonowych do ściśnięcia monowarstwy lipidowej w stosunku 5 mm/min, aż do osiągnięcia ciśnienia powierzchniowego 34 mN·m⁻¹.
      4. Wyjmij pryzmat z monowarstwą lipidową z wody z prędkością 1 mm/min w pionie.
   4. Przygotowanie drugiej monowarstwy lipidowej
      1. Aby ułatwić składanie dupleksowego oligonukleotydu i cząsteczek lipidów poprzez oddziaływanie hydrofobowe (cholesterol i lipidowy łańcuch alkilowy), należy wymieszać dupleksowy roztwór oligonukleotydu z roztworem lipidowym w stosunku molowym 1:100 (oligonukleotyd do lipidu).
      2. Wstrzyknąć zmieszany roztwór lipidów i dupleksu oligonukleotydów na powierzchnię wody w domowym pojemniku teflonowym, aż do osiągnięcia ciśnienia powierzchniowego 34 mN·m⁻¹.
   5. Na koniec umieść monowarstwę lipidową na dnie pryzmatu w kontakcie z monowarstwą lipidową z wstawionymi dupleksowymi oligonukleotydami na powierzchni wody, aby utworzyć końcową próbkę do pomiaru SFG.
4. Równanie Lorentza
   1. Użyj równania Lorentza, aby dopasować widma SFG, aby wyodrębnić informacje o drganiach dla określonego trybu drgań.
      (25)
      gdzie reprezentuje intensywność k-tego trybu wibracyjnego, reprezentuje częstotliwość rezonansową, oznacza połowę szerokości w połowie maksimum (HWHM) i reprezentuje częstotliwość skanowania padającej wiązki podczerwieni.

Results

W części dotyczącej współczynnika Fresnela w sekcji Protokołu, pokazaliśmy, że teoretycznie możliwe jest selektywne wykrycie tylko jednego interfejsu w tym samym czasie. Tutaj, eksperymentalnie, potwierdziliśmy, że ta metodologia jest w zasadzie poprawna, jak pokazano na Rysunek 5 i Rysunek 6.

Rysunek 5 pokazuje zakopaną międzyfazową strukturę PHEMA po intruzji wody z hydrożelową warstwą PHEMA ~150 nm i

Discussion

Aby zbadać informacje strukturalne na poziomie molekularnym, SFG ma swoje nieodłączne zalety (tj. czułość jednowarstwową lub submonowarstwową i selektywność międzyfazową), które można zastosować do badania różnych granic faz, takich jak granice faz ciało stałe/ciało stałe, ciało stałe/ciecz, ciało stałe/gaz, ciecz/gaz, ciecz/ciecz. Chociaż konserwacja sprzętu i wyrównanie optyczne są nadal czasochłonne, korzyści są znaczące, ponieważ można uzyskać szczegółowe informacje na poziomie molekularnym na powierzchniach i interf...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P-1g
Bezwodny etanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680	≥ 99,7%
pryzmat CaF2	Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Chlorek wapnia bezwodny	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10005817	≥ 96.0%
deuterowany DPPC (d-DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860345P-100mg
Piekarnik elektromagnetyczny	Zhejiang Supor Co., Ltd	C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) koryto	KSV NIMA Co., Ltd.	KN 2003
Bromek litu bezwodny	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	20056926
System syntezy Milli-Q	Millipore		Ultraczysta woda
Środek do czyszczenia plazmy	Chengdu Mingheng Science& Technology Co., Ltd	PDC-MG	Czyszczenie plazmą tlenową
Poli(2-hydroksyetylometakrylan) (PHEMA)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	192066 MSDS	Mw = 300 000
Polistyren	Sigma-Aldrich Co., LLC.	330345 MSDS	Mw = 48 kDa i Mn = 47 kDa
Kokony			Z Bombyx mori
Pojedyncza komplementarna nić oligonukleotydu	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H03596	5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'Pojedyncza
nić oligonukleotydu	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H04936	3¢-koniec zmodyfikowany przez cholesterol-glikol trietylenowy (Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Węglan sodu bezwodny	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019260	≥ 99.8%
Powlekarka spinowa	Instytut Mikroelektroniki Chińskiej Akademii Nauk	KW-4A	Do prezentacji folii ploymer
Profilomierz krokowy	Veeco	DEKTAK 150	Do pomiaru grubości warstwy
System spektroskopii oscylacyjnej z generowaniem sumy częstotliwości (SFG)	EKSPLA		Komercyjny pikosekundowy system SFG