PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Huacheng Luo; Amin Sobh; Christopher  D. Vulpe; Edmond Brewer; Sinisa Dovat; Yi Qiu; Suming Huang

doi:10.3791/59382

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59382

⸱

31 marca 2019

Huacheng Luo¹ , Amin Sobh² , Christopher D. Vulpe² , Edmond Brewer¹ , Sinisa Dovat¹ , Yi Qiu³ , Suming Huang¹

¹Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, ²Department of Physiological Sciences, University of Florida, ³Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

Streszczenie

Stabilne topologicznie asocjujące domeny (TAD), w których pośredniczy czynnik wiążący CCCTC (CTCF), odgrywają kluczową rolę w ograniczaniu oddziaływań elementów DNA, które znajdują się w sąsiednich TAD. CTCF odgrywa ważną rolę w regulacji przestrzennej i czasowej ekspresji genów HOX, które kontrolują rozwój embrionalny, wzorce ciała, hematopoezę i leukemogenezę. Jednak pozostaje w dużej mierze nieznane, czy i w jaki sposób granice CTCF związane z loci HOX regulują organizację chromatyny i ekspresję genów HOX. W obecnym protokole wygenerowano specyficzną bibliotekę puli sgRNA ukierunkowaną na wszystkie miejsca wiązania CTCF w loci HOXA/B/C/D w celu zbadania wpływu zakłócenia granic chromatyny związanych z CTCF na tworzenie TAD i ekspresję genu HOX. Dzięki genetycznym badaniom przesiewowym CRISPR-Cas9 miejsce wiązania CTCF zlokalizowane między genami HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) zostało zidentyfikowane jako krytyczny regulator domeny chromatyny onkogennej, a także ważne dla utrzymania ektopowych wzorców ekspresji genu HOX w ostrej białaczce szpikowej (AML) reorganizowanej przez MLL. W związku z tym to podejście do badań przesiewowych biblioteki sgRNA dostarcza nowych informacji na temat organizacji genomu za pośrednictwem CTCF w określonych loci genów, a także stanowi podstawę do funkcjonalnej charakterystyki adnotowanych genetycznych elementów regulatorowych, zarówno kodujących, jak i niekodujących, podczas normalnych procesów biologicznych w erze projektu po ludzkim genomie.

Wprowadzenie

Ostatnie badania interakcji genomu wykazały, że ludzki genom jądrowy tworzy stabilne topologicznie asocjujące domeny (TAD), które są zachowane w różnych typach komórek i gatunkach. Organizacja genomu w odrębne domeny ułatwia i ogranicza interakcje między elementami regulatorowymi (np. wzmacniaczami i promotorami). Czynnik wiążący CCCTC (CTCF) wiąże się z granicami TAD i odgrywa kluczową rolę w ograniczaniu interakcji elementów DNA, które znajdują się w sąsiednich TADs¹. Jednak dane dotyczące wiązania CTCF w całym genomie ujawniły, że chociaż CTCF w większości oddziałuje z tymi samymi miejscami DNA w różnych typach komórek, często działa jako ba....