Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59382

⸱

31 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

Streszczenie

Stabilne topologicznie asocjujące domeny (TAD), w których pośredniczy czynnik wiążący CCCTC (CTCF), odgrywają kluczową rolę w ograniczaniu oddziaływań elementów DNA, które znajdują się w sąsiednich TAD. CTCF odgrywa ważną rolę w regulacji przestrzennej i czasowej ekspresji genów HOX, które kontrolują rozwój embrionalny, wzorce ciała, hematopoezę i leukemogenezę. Jednak pozostaje w dużej mierze nieznane, czy i w jaki sposób granice CTCF związane z loci HOX regulują organizację chromatyny i ekspresję genów HOX. W obecnym protokole wygenerowano specyficzną bibliotekę puli sgRNA ukierunkowaną na wszystkie miejsca wiązania CTCF w loci HOXA/B/C/D w celu zbadania wpływu zakłócenia granic chromatyny związanych z CTCF na tworzenie TAD i ekspresję genu HOX. Dzięki genetycznym badaniom przesiewowym CRISPR-Cas9 miejsce wiązania CTCF zlokalizowane między genami HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) zostało zidentyfikowane jako krytyczny regulator domeny chromatyny onkogennej, a także ważne dla utrzymania ektopowych wzorców ekspresji genu HOX w ostrej białaczce szpikowej (AML) reorganizowanej przez MLL. W związku z tym to podejście do badań przesiewowych biblioteki sgRNA dostarcza nowych informacji na temat organizacji genomu za pośrednictwem CTCF w określonych loci genów, a także stanowi podstawę do funkcjonalnej charakterystyki adnotowanych genetycznych elementów regulatorowych, zarówno kodujących, jak i niekodujących, podczas normalnych procesów biologicznych w erze projektu po ludzkim genomie.

Wprowadzenie

Ostatnie badania interakcji genomu wykazały, że ludzki genom jądrowy tworzy stabilne topologicznie asocjujące domeny (TAD), które są zachowane w różnych typach komórek i gatunkach. Organizacja genomu w odrębne domeny ułatwia i ogranicza interakcje między elementami regulatorowymi (np. wzmacniaczami i promotorami). Czynnik wiążący CCCTC (CTCF) wiąże się z granicami TAD i odgrywa kluczową rolę w ograniczaniu interakcji elementów DNA, które znajdują się w sąsiednich TADs1. Jednak dane dotyczące wiązania CTCF w całym genomie ujawniły, że chociaż CTCF w większości oddziałuje z tymi samymi miejscami DNA w różnych typach komórek, często działa jako bariera chromatyny w określonym miejscu w jednym typie komórki, ale nie w drugim, co sugeruje, że CTCF działa razem z innymi działaniami w tworzeniu granic chromatyny2. Nie wiadomo natomiast, czy elementy graniczne (miejsca wiązania CTCF) są bezpośrednio związane z biologiczną funkcją CTCF i w jaki sposób te powiązania występują. Dlatego stawiamy hipotezę, że określone miejsca wiązania CTCF w genomie bezpośrednio regulują tworzenie TAD i kontrolują interakcje promotora/wzmacniacza w tych domenach lub między sąsiednimi domenami. Zakończenie projektów sekwencjonowania genomu ludzkiego i mysiego oraz późniejsze analizy epigenetyczne pozwoliły na odkrycie nowych sygnatur molekularnych i genetycznych genomu. Jednak rola specyficznych sygnatur/modyfikacji w regulacji genów i funkcji komórkowych, a także ich mechanizm molekularny, nie została jeszcze w pełni poznana.

Wiele linii dowodowych potwierdza, że TADy, w których pośredniczy CTCF, reprezentują funkcjonalne domeny chromatyny3,4,5. Chociaż CTCF w większości oddziałuje z tymi samymi miejscami DNA w różnych typach komórek, dane sekwencyjne CTCF dotyczące całego genomu ujawniły, że CTCF często działa jako bariera chromatyny w jednym typie komórki, ale nie w drugim2. CTCF odgrywa istotną rolę podczas rozwoju, pośrednicząc w organizacji genomu4,6,7. Naruszenie granic CTCF upośledza interakcje wzmacniacz/promotor i ekspresję genów, prowadząc do zablokowania rozwoju. Sugeruje to, że TAD, w których pośredniczy CTCF, są nie tylko składnikami strukturalnymi, ale także jednostkami regulatorowymi wymaganymi do prawidłowego działania wzmacniacza i transkrypcji genów5,8,9.

Geny HOX odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju embrionalnego i są czasowo i przestrzennie ograniczone w swoich wzorcach ekspresji. Locus HOXA tworzy dwa stabilne TAD oddzielające geny przednie i tylne za pomocą elementu granicznego związanego z CTCF zarówno w komórkach hESC, jak i IMR901. Ostatnie doniesienia wykazały, że HoxBlinc, lncRNA związany z locus HoxB, pośredniczy w tworzeniu TAD kierowanych przez CTCF i interakcji wzmacniacz/promotor w locus HOXB. Prowadzi to do aktywacji genu HOXB w przedniej części ESC podczas angażowania i różnicowania ESC10. Ponadto, w określonych loci genów, w tym locus HOXA, zmiana domen TAD za pośrednictwem CTCF zmieniła profile ekspresji genów specyficzne dla linii i była związana z rozwojem stanów chorobowych11,12. Dowody potwierdzają podstawową funkcję CTCF w koordynowaniu transkrypcji genów i określaniu tożsamości komórki poprzez organizowanie genomu w domeny funkcjonalne.

Pomimo swojej roli w rozwoju embrionalnym, podczas hematopoezy, geny HOX regulują funkcję hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HS/PC). Odbywa się to poprzez kontrolowanie równowagi między proliferacją a różnicowaniem10,13,14,15. Ekspresja genów HOX jest ściśle regulowana przez cały okres specyfikacji i różnicowania komórek krwiotwórczych, z najwyższą ekspresją w HS / PC. Ekspresja genu HOX stopniowo spada w okresie dojrzewania, przy czym najniższy poziom występuje w zróżnicowanych komórkach krwiotwórczych16. Rozregulowanie genu HOX jest dominującym mechanizmem transformacji białaczki poprzez rozregulowanie właściwości samoodnawiania i różnicowania HS/PC, co prowadzi do transformacji białaczkowej17,18. Jednak mechanizm ustanawiania i utrzymywania prawidłowych i onkogennych wzorców ekspresji genów HOX, a także związanych z nimi sieci regulacyjnych, pozostaje niejasny.

Przesiewowe badanie biblioteki sgRNA CRISPR-Cas9 było szeroko stosowane do badania genów kodujących białka19, jak również genów niekodujących, takich jak lncRNA20 i miRNA21 u różnych gatunków. Jednak koszt korzystania z biblioteki sgRNA CRISPR-Cas9 do identyfikacji nowych celów genomowych pozostaje wysoki, ponieważ sekwencjonowanie genomu o wysokiej przepustowości jest często stosowane do weryfikacji badań przesiewowych biblioteki sgRNA. Nasz system badań przesiewowych sgRNA koncentruje się na określonych loci genomu i ocenia docelowe sgRNA za pomocą jednoetapowego RT-PCR zgodnie z ekspresją genu markera, takiego jak HOXA9. Ponadto sekwencjonowanie Sangera potwierdziło, że sgRNA zostało zintegrowane z genomem, a mutacje Indel można wykryć w celu zidentyfikowania miejsca docelowego sgRNA. Dzięki specyficznym dla loci genetycznym badaniom przesiewowym CRISPR-Cas9, granica chromatyny CBS7/9 została zidentyfikowana jako krytyczny regulator dla ustanowienia domeny chromatyny onkogennej i utrzymania ektopowych wzorców ekspresji genu HOX w patogenezie AML12. Metoda ta może być szeroko stosowana nie tylko do identyfikacji specyficznej funkcji granicy CTCF w rozwoju embrionalnym, hematopoezie, białaczce, ale także granicy CTCF jako potencjalnych celów terapeutycznych dla przyszłej terapii epigenetycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. CTCF sgRNALibrary Design za pomocą narzędzia online

  1. Zaprojektuj sgRNA ukierunkowane na miejsca wiązania CTCF w ludzkich loci HOX za pomocą narzędzia do projektowania platformy perturbacji genetycznych (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Zsyntetyzuj łącznie 1,070 sgRNA składających się z sgRNA ukierunkowanych na 303 losowe geny docelowe, 60 kontroli pozytywnych, 500 kontroli nieukierunkowanych na człowieka i 207 elementów CTCF lub genów docelowych lncRNA (Rysunek 1, Tabela 1). Każdy docelowy element DNA jest atakowany przez 5-10 różnych sgRNA.

2. Klonowanie biblioteki sgRNA

  1. Sklonuj zsyntetyzowane oligonukleotydy do wektora szkieletowego lentiwirusa CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Trawić wektor LentiCRISPRv2 enzymem restrykcyjnym BsmBI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Poszukaj obecności większego prążka (około 12 873 pz) na żelu po trawieniu BsmBI, a następnie oczyść go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      nuta: Mały kawałek wypełniacza o pojemności 2 kb jest również obecny na żelu po strawieniu, ale należy to zignorować.
    3. Zliguj zsyntetyzowane oligonukleotydy i strawiony wektor LentiCRISPR za pomocą 150 ng strawionego DNA LentiCRISPR, 1 μL 10 μM oligonukleotydów, 2 μL 10x buforu ligazy T4, 1 μL ligazy T4, a następnie inkubuj je w temperaturze 16 °C przez noc.
  2. Przekształć bibliotekę lentiwirusową CRISPR/sgRNA w elektrokompetentne komórki do amplifikacji.
    1. Przygotuj elektroporator przy napięciu 1,8 kV, 200 Ω i 25 μF. Następnie podgrzej wstępnie pożywkę regeneracyjną SOC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i podgrzej płytki z antybiotykiem LB ampicyliny w temperaturze 37 °C.
    2. Rozmrażać właściwe komórki na lodzie przez 10 minut.
    3. Przygotuj na lodzie mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml i kuwety do elektroporacji o średnicy 1 mm.
    4. Wymieszaj 1 μl plazmidowego DNA o sile 10 ng/μl z 25 μl kompetentnych komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie ręcznie przesuwając spód probówki.
    5. Gdy kuweta jest wystarczająco zimna, przenieś do niej mieszaninę DNA/kompetentnych komórek. Postukaj dwukrotnie w blat i wytrzyj wszelkie kropelki wody z zewnętrznej części kuwety bibułą. Następnie umieść kuwetę w module elektroporacyjnym i naciśnij impuls.
    6. Natychmiast dodać 975 μl wstępnie podgrzanej pożywki SOC o temperaturze 37 °C. Mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
    7. Obracać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    8. Rozcieńczyć 100 μl komórek w 900 μl pożywki SOC i umieścić 100 μl na płytce agarowej z antybiotykiem LB ampicylina. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Wyodrębnij plazmidowe DNA z połączonych kolonii za pomocą kolumny maxi-prep, jak opisano w protokole producenta.
    1. Zeskrobać wszystkie kolonie z płytki agarowej LB i zaszczepić kulturę starterową składającą się z 2 ml pożywki antybiotykowej LB ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem (~200 x g).
    2. Rozcieńczyć kulturę starterową w stosunku 1:500 w 100 ml pożywki LB ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin, energicznie wstrząsając (~200 x g).
    3. Zebrać osad komórek bakteryjnych przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny.
    5. Zawiesiny osad należy zlizować 10 ml buforu do lizy i energicznie odwrócić 4-6 razy. Inkubować lizat przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Zneutralizować lizat za pomocą 10 ml schłodzonego buforu neutralizującego. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówki 4-6 razy i inkubuj przez 20 minut na lodzie.
    7. Wirować w dół przy 13 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Natychmiast przenieść supernatant zawierający plazmidowe DNA do nowej probówki.
    8. Powtórzyć krok 2.3.7 i niezwłocznie przenieść supernatant zawierający plazmidowe DNA do nowej probówki.
    9. Zrównoważyć kolumnę, nakładając 10 ml buforu równoważącego i pozwolić, aby kolumna opróżniła się przez przepływ grawitacyjny.
    10. Dodaj supernatant do kolumny i pozwól mu dostać się do żywicy przez przepływ grawitacyjny.
    11. Przemyć kolumnę 2x 30 ml buforu do mycia.
    12. Eluować DNA za pomocą 15 ml buforu elucyjnego.
    13. Wytrącić DNA za pomocą 10,5 ml izopropanolu o temperaturze pokojowej do wymytego DNA. Wymieszać i natychmiast odwirować w temperaturze 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie delikatnie zdekantować supernatant.
    14. Przemyć osad DNA 5 ml 70% etanolu, odwirować osad DNA o sile 15 000 x g przez 10 minut i wyrzucić klarowny supernatant.
    15. Powtórz krok 2.5.14 jeszcze dwa razy.
    16. Odwirować osad DNA o sile 15 000 x g przez 10 minut i delikatnie zdekantować supernatant bez naruszania osadu DNA.
    17. Suszyć osad na powietrzu przez 5-10 minut i rozpuścić DNA w wymaganej objętości buforu (bufor TE, pH 8,0).

3. Generacja biblioteki sgRNA o wysokim mianie

  1. Przygotowanie komórek: Hodowla HEK293T komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (obj./obj.) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% (obj./obj.) penicyliną-streptomycyną (PS) w kolbach T-25. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Pakiet lentiwirusa: Kotransfekcja komórek HEK293T z 20 μg oczyszczonych wektorów bibliotecznych z kroku 2, 15 μg plazmidu pakietowego (psPAX2) i 10 μg plazmidu otoczki (pMD2.G) przez 48 godzin przed pobraniem wirusów.
  3. Zbieranie wirusa: Po 48 godzinach zebrać supernatant wirusa i przefiltrować supernatant wirusa przez błonę PVDF o niskiej wiązalności białka 0,45 μm.
  4. Stężenie wirusa: Zagęścić supernatant lentiwirusa 50-krotnie za pomocą koncentratora i przetestować MOI wirusa w kroku 5.
  5. Przechowywanie wirusów: Podwielokrotnić skoncentrowane wirusy i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

4. Zoptymalizowane stężenie Puromycyny

  1. Hodowla komórek białaczkowych: Hodowla komórek AML MOLM13 w RPMI 1640 uzupełniona 10% (vol/vol) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1x antybiotykami penicylina-streptomycyna (PS) w kolbie T-125. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: Komórki są zwykle przepuszczane co 4-5 dni w stosunku podziału 1:4 lub 1:6, nigdy nie pozwalając komórkom osiągnąć więcej niż 70% konfluencji.
  2. Umieść komórki MOLM13 na 12-dołkowej płytce o gęstości 1,0 x 104 komórki/ml, przy całkowitej objętości 2 ml na dołek (2,0 x 104 komórki).
  3. Test przebiegu w czasie: Traktuj komórki MOLM13 puromycyną przez 7 dni w rosnących stężeniach (0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml i 2,0 μg/ml)
    1. Ustaw komórki MOLM13 bez leczenia puromycyną w dniu 0 i ustaw 3 studzienki replikowane bez leczenia puromycyną jako kontrolę od dnia 0 do dnia 7.
    2. Traktuj komórki MOLM13 0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,5 μg/mL, 1,0 μg/ml i 2,0 μg/ml, oddzielnie, przy czym każdy warunek eksperymentalny zawiera 3 dołki replikatów.
    3. Policz stosunek żywych komórek i sporządź krzywą przeżycia od dnia 0 do dnia 7, zawierającą wszystkie warunki.
  4. Krzywa przeżycia: Wybarwiaj komórki błękitem trypanowym i licz żywotność codziennie, aby uzyskać krzywe przeżycia dla każdego stężenia puromycyny.
  5. Optymalizacja minimalnego stężenia puromycyny: Określ minimalne stężenie puromycyny poprzez barwienie błękitem trypanowym, w którym wszystkie komórki MOLM13 są zabijane w ciągu 5-7 dni.

5. Miareczkowanie biblioteki lentiwirusowej w komórkach białaczkowych MOLM13

  1. Przygotowanie komórek AML: Zbierz komórki AML MOLM13 za pomocą pożywki transdukcyjnej (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS i 8,0 μg/ml pożywki powlekającej) o gęstości 1,5 x 106 komórek / ml.
  2. Umieść komórki MOLM13 w 12-dołkowej płytce z 1,5 x 106 komórek w każdym dołku.
  3. Rozmrozić lentiwirusa: Wyjąć skoncentrowany lentiwirus z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić go na lodzie.
  4. Wymieszaj komórki MOLM13 z inną dawką skoncentrowanego lentiwirusa w oddzielnych studzienkach, w tym 0, 1, 2,5, 5, 7,5 i 10 μL (łącznie 6 grup).
  5. Mieszaniny te należy natychmiast odwirować przy 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 33 °C i przenieść 12-dołkowe płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
  6. Po 4 godzinach wirować zainfekowane komórki w masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić transdukowane komórki za pomocą świeżej pożywki (RPMI 1640, 10% FBS i 1% PS), a następnie przenieść je do kolb T-25 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin bez puromycyny.
  8. Po 48 godzinach podziel te komórki na 2 kolby (2 grupy): grupę eksperymentalną leczoną 1 μg/ml puromycyny przez 5 dni i grupę kontrolną bez leczenia puromycyną przez 5 dni.
  9. Przeprowadzaj selekcję puromycyny przez 5 dni z 1 μg/ml puromycyny zgodnie z krokiem 4, aż wszystkie nietransdukowane komórki kontrolne będą martwe. Wymieniaj na nowe nośniki co 2 dni.
  10. Zmierz zoptymalizowaną wartość MOI dla transdukcji, dzieląc liczbę żywych komórek leczonych puromycyną przez liczbę komórek bez leczenia puromycyną.

6. Transdukcja zbiorczej biblioteki CRISPR-Cas9 KO

  1. Transdukcja lentiwirusem: Zainfekuj 1,5 x 106 komórek MOLM13 0,3 MOI lentiwirusa połączonego z sgRNA w pożywce (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS i 8 μg/ml pożywki powlekającej) na płytce 6-dołkowej i użyj komórek bez infekcji lentiwirusem jako kontroli.
  2. Natychmiast odwirować 6-dołkową płytkę w temperaturze 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 33 °C w celu przeszczepienia komórek i przenieść płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
  3. Wiruj zainfekowane komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Delikatnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić transdukowane komórki za pomocą świeżej pożywki (RPMI 1640, 10% FBS i 1% PS), a następnie przenieść je do kolb T-25 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin bez puromycyny.
  5. Po 48 godzinach traktuj komórki 1 μg/ml puromycyny przez 5 dni. Po 2 dniach wymień na świeże podłoże i utrzymuj optymalną gęstość komórek.
  6. Wysiewać pojedynczy klon na 96-dołkowych płytkach z metodami ograniczającego rozcieńczania i inkubować te pojedyncze klony w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Hoduj je przez 3-4 tygodnie.
  7. Po tym, jak pojedyncza komórka wyrośnie w populację, przenieś połowę komórek na płytki 24-dołkowe w celu dalszej hodowli pod kontrolą selekcji puromycyny i zweryfikuj te klony w następnym kroku. Zachowaj resztę komórek.

7. Badanie przesiewowe biblioteki CRISPR-Cas9 KO z jednoetapowym RT-qPCR

  1. Określ skuteczność zintegrowanego badania przesiewowego klonów sgRNA, oceniając ekspresję genu markerowego HOXA9 z jednoetapową reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (jednoetapowa RT-qPCR).
    UWAGA: HOXA9 ulegają silnej ekspresji w komórkach AML MOLM13 w leukemogenezie22,23.
  2. Policz zintegrowaną komórkę MOLM13 zintegrowaną z sgRNA i przenieś 1 x 104 komórki na studzienkę na 96-dołkową płytkę PCR.
  3. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut, a następnie dokładnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu komórkowego.
  4. Umyć komórki 125 μl buforu PBS i odwirować probówkę o sile 1 000 x g przez 5 minut. Następnie usunąć 120 μl supernatantu za pomocą pipety i zachować około 5 μl PBS w każdym dołku.
  5. Do każdego dołka dodać 50 μl głównej mieszaniny do lizy komórek zawierającej 48 μl buforu do lizy komórek, 1 μl roztworu proteinazy K (10 mg/ml) i 1 μl roztworu DNazy (1 mg/ml). Następnie pipetuj w górę i w dół 5 razy, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
  6. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie w temperaturze 75 °C przez 5 minut.
  7. Przechowywać lizat komórkowy w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  8. Przygotowanie jednoetapowej reakcji RT-qPCR: Rozmrozić jednoetapową mieszaninę reakcyjną i inne składniki reakcji do temperatury 4 °C. Następnie krótko obrócić w dół, aby zebrać roztwory na dnie probówek i umieścić na lodzie bez światła. Wymieszaj i delikatnie odwiruj.
  9. Dodać 1 μl lizatu komórkowego do dołków PCR z mieszaniną reakcyjną RT-qPCR, w tym 1 μl startera do przodu (300 nM) i startera odwrotnego genu markerowego (300 nM), 0,125 μl odwrotnej transkryptazy (10 U/μL) i 5 μl jednoetapowej mieszaniny reakcyjnej (2x).
  10. Uszczelnij studzienki optycznie przezroczystą folią, delikatnie zwiruj i wymieszaj składniki reakcji.
  11. Umieść 96-dołkową płytkę do PCR na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym.
  12. Przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji na 10 minut w temperaturze 50 °C, a następnie inaktywować polimerazę i denaturację DNA na 1 minutę w temperaturze 95 °C.
  13. Przeprowadzić RT-PCR z 40 cyklami reakcji PCR: denaturacja przez 15 s w temperaturze 95 °C, wyżarzanie/wydłużanie i odczyt fluorescencji płytki przez 20 s w temperaturze 60 °C, a następnie analiza krzywej topnienia w temperaturze 65-95 °C w krokach co 0,5 °C przy 2-5 s/krok.
  14. Skonfiguruj grupy z regulacją w górę, w dół i bez zmian zgodnie z poziomami ekspresji genu HOXA9 w porównaniu z kontrolą, oddzielnie. Użyj genu β-aktyny jako kontroli genów domowych.

8. Weryfikacja zintegrowanych klonów sgRNA z dodatnim wynikiem poprzez genotypowanie i sekwencję Sangera

  1. Zweryfikuj klony HOXA9 o zmniejszonej ekspresji za pomocą sekwencjonowania Sangera i przeprowadź PCR z 50-100 ng DNA genomu MOLM13, 5 μl buforem reakcyjnym polimerazy (10x), 1 μl starterem do przodu (10 μM) (AATGGACTATCATATGCTTACCATGAAAGTATTTCG) i 1 μl startera odwróconego (10 μM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGCGTGCCTG), 1 μl dNTP (10mM), 1 jednostką polimerazy (5 U / μL). Przeprowadzić reakcję PCR z początkową denaturacją w temperaturze 94 °C przez 30 s, a następnie dalszą denaturacją w temperaturze 94 °C przez 20 s, wyżarzaniem w temperaturze 56 °C przez 20 s, przedłużaniem w temperaturze 68 °C przez 20 s (łącznie 30 cykli), końcowym przedłużeniem w temperaturze 68 °C przez 10 minut, a następnie utrzymywaniem w temperaturze 4 °C.
  2. Ekstrahować i oczyszczać produkty PCR (rozmiar 285 pz) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
  3. Związać oczyszczone produkty PCR z wektorem T za pomocą 2 μl buforu do ligacji T4 (10x), 50 ng wektora T DNA (50 ng/μL), 25 ng oczyszczonego DNA PCR (285 pz), 1 μl ligazy T4 (3 jednostki/μl) i umieścić mieszaninę ligacyjną w inkubatorze w temperaturze 16 °C na noc.
  4. Przenieść mieszaninę ligacyjną do komórki DH5α kompetentnej, hodować na płytce agarowej z antybiotykiem LB ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Wybierz pojedyncze klony z płytki LB i zweryfikuj je za pomocą genotypowania i sekwencjonowania Sangera.

9. Wykrywanie mutacji indel wywołanej sgRNA za pomocą testu trawienia nukleazy

  1. Wykryj wskaźniki indel indukowane pojedynczym klonem zintegrowanym z sgRNA za pomocą testu nukleazy.
  2. Oddzielnie przygotuj amplikony PCR z 50-100 ng zmutowanym DNA Indel (test) i DNA typu dzikiego (WT, odniesienie) jako matrycą PCR, 5 μl buforu reakcyjnego polimerazy (10x), 1 μL dNTP (10 mM), 1 jednostką polimerazy (5 U/μL), 1 μl startera do przodu (10 μM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') i 1 μl startera odwrotnego (10 μM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). Reakcję PCR przeprowadzono z początkową denaturacją w temperaturze 98 °C przez 30 s, a następnie denaturacją w temperaturze 98 °C przez 20 s, wyżarzaniem w temperaturze 56 °C przez 20 s, przedłużaniem w temperaturze 72 °C przez 30 s (łącznie 30 cykli) i końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 10 minut i utrzymywaniem w temperaturze 4 °C.
  3. Ustaw grupę mieszanin heterodupleksowych z 200 ng "referencyjnych" (20 ng / μL) i 200 ng "testowych" (20 ng / μL) amplikonów PCR w 0,2 ml probówce PCR, a grupę mieszaniny homodupleksu z tylko 400 ng "referencyjnych" amplikonów PCR jako kontrolę.
  4. Mieszaninę heterodupleksu i homodupleksu inkubować oddzielnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut w zlewce o pojemności 1 l wypełnionej 800 ml wody, a następnie stopniowo schładzać do temperatury pokojowej do wyżarzania i tworzenia heterodupleksu lub homodupleksów.
  5. Oddzielnie roztwarzać 400 ng wyżarzonej mieszaniny heterodupleksu i homodupleksu z 1 μl nukleazy do wykrywania mutacji indel (2,5 U/μL) i 2 μl buforu reakcyjnego nukleazy (10x) w temperaturze 42 °C przez 60 min.
  6. Analizować strawione próbki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, DNA mieszaniny heterodupleksowej należy pociąć na małe fragmenty (70-250 pz), a DNA homodupleksu (320 pz) nie należy ciąć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technologia CRISPR-Cas9 jest potężnym narzędziem badawczym w genomice funkcjonalnej. Szybko zastępuje ona konwencjonalne techniki edycji genów i wykazuje wysoką użyteczność zarówno w zastosowaniach obejmujących cały genom, jak i w badaniach skoncentrowanych na poszczególnych genach. Przedstawiona tutaj pierwsza indywidualnie klonowana, specyficzna dla loci biblioteka sgRNA w układzie CRISPR-Cas9 zawiera 1070 sgRNA, w tym sgRNA celujące w 303 losowe geny, 60 kontroli pozytywnych, 500 kontr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biblioteki sgRNA związane z genami kodującymi białka zostały zastosowane w funkcjonalnym systemie badań przesiewowych do identyfikacji genów i sieci regulujących określone funkcje komórkowe poprzez wzbogacenie sgRNA 24,25,26,27,28. Kilka bibliotek sgRNA związanych z regionem niekodującym wykazano również w specyficznych dla genów funkcjonalnych badaniach przes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów w związku z tym raportem.

Podziękowania

Autorzy dziękują również Nicholasowi Cesariemu za redakcję rękopisu. Prace były wspierane przez granty z National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinaza KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Komórki Stbl3 Technologie życiowe 
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii  M0202S
żeluQIAGEN28706
QIAuick Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR®   Zielony zestaw jednoetapowyBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni Thermo Fisher Naukowy 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Płodowa surowica bydlęca (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicylina/streptomycyna/L-glutamina Technologie życiowe 
Koncentrator Lenti-X Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Genessee Scientific  25-507
Bufor TAE Thermo Fisher Naukowy FERB49
Geodeta® Zestawy do wykrywania mutacjiZintegrowane technologie DNA706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Wirówka 5424 REppendorf5404000138
Cyfrowe suche łaźnie/grzejniki blokoweThermo Fisher Scientific88870002
serii TSX Zamrażarki ultraniskotemperaturoweThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma&handel; Steri-Cult&handel; CO2  InkubatoryThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasy IIThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Legenda i handel; Seria wirówek XT/XFThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™   Isotemp&handel; Kąpiele wodneThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™   Lokalizator i handel; Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855195
MiniAmp™ Thermal CyclerApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™   Sowa i handel; EC300XL2 Kompaktowy zasilaczThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™   Sowa i handel; EasyCast&handel; B1 Mini żelowe systemy elektroforetyczneThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Rotator rurowy i rożnaVWR International10136-084
VWR® Mini wytrząsarka inkubacyjnaVWR International12620-942
MS104TS/00METTLER TOLEDO
DS-11 FX i DS-11 FX+DeNovix Inc.DS-11 FX
C737303Ligaza QIAquick Zestaw do ekstrakcji 1196508410378016 Waga analityczna Spektrofotometr 30133522

Bibliografia

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiew CRISPRmiejsca wiązania CTCFregulacja genów HOXtransdukcja lentiwirusowaanaliza RT-qPCRsekwencjonowanie metodą Sangeratest trawienia nukleazątworzenie heterodupleksówkomórki MOLM13
PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.