Artykuł metodologiczny

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59384

⸱

16 kwietnia 2019

 ,  , 
1Research Programs Unit, Translational Cancer Medicine Research Program, University of Helsinki, 2Wihuri Research Institute, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, 3Laboratory Animal Center, Helsinki Institute of Life Science (HiLIFE), University of Helsinki

W tym artykule

Podsumowanie

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Streszczenie

Wysoce selektywna z natury, bariera krew-mózg (BBB) jest niezbędna dla homeostazy mózgu w warunkach fizjologicznych. Jednak w kontekście nowotworów mózgu selektywność molekularna BBB chroni również komórki nowotworowe, blokując dostarczanie obwodowo podawanych chemoterapii. Opracowywanie nowych leków (w tym nanocząstek) ukierunkowanych na złośliwe nowotwory mózgu wymaga wykorzystania przedklinicznych modeli zwierzęcych do badania transcytozy i skuteczności przeciwnowotworowej leku. Aby zachować zgodność z zasadą 3R (udoskonalić, zmniejszyć i zastąpić) w celu zmniejszenia liczby zwierząt laboratoryjnych w konfiguracji eksperymentalnej i przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych dużej biblioteki środków przeciwnowotworowych, opracowaliśmy odtwarzalną w warunkach in vitro ludzką i mysią naśladowniczkę bariery nowotworowej krew-mózg (BBTB) przy użyciu trójwarstwowych kultur komórek śródbłonka, astrocytów, i kule glejaka pochodzącego od pacjenta. Aby uzyskać większą skalowalność i odtwarzalność, komercyjne linie komórkowe lub unieśmiertelnione komórki zostały użyte w dostosowanych warunkach, aby umożliwić utworzenie bariery przypominającej rzeczywistą barierę BBB. Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania mimiki BBTB poprzez hodowlę komórek śródbłonka w kontakcie z astrocytami przy określonej gęstości komórek na wstawkach. Ten naśladownictwo BBTB może być wykorzystany na przykład do kwantyfikacji i obrazowania konfokalnego przejścia nanocząstek przez bariery śródbłonka i astrocytów, a także do oceny celowania w komórki nowotworowe w ramach tego samego testu. Ponadto wykazujemy, że uzyskane dane mogą być wykorzystane do przewidywania zachowania nanocząstek w przedklinicznych modelach zwierzęcych. W szerszej perspektywie, ten model in vitro może zostać zaadaptowany do innych chorób neurodegeneracyjnych w celu określenia przejścia nowych cząsteczek terapeutycznych przez barierę krew-mózg i/lub zostać uzupełniony organoidami mózgowymi w celu bezpośredniej oceny skuteczności leków.

Wprowadzenie

Jednostka nerwowo-naczyniowa składa się z neuronów, astrocytów i BBB, utworzonych przez skomplikowane połączenia między perycytami, astrocytami, komórkami śródbłonka i powiązaną błoną podstawną tworzącą mikrokrążenie mózgu1. Ta szczelna ściana komórkowa utworzona przez ciągłe, niefenestrowane naczynia precyzyjnie reguluje ruch jonów i cząsteczek (w tym hormonów, składników odżywczych lub leków), ale także krążących komórek1. Szczególnie niska transcytoza przez barierę krew-mózg cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej, takich jak przeciwciała terapeutyczne, koniugaty leków lub nanozwiązki, dramatycznie ogranicza postępy w odkrywaniu leków na choroby neurologiczne, w tym glejaki złośliwe2. Rzeczywiście, chemioterapia podawana doustnie lub dożylnie dociera do miąższu mózgu często w niewystarczająco niskich stężeniach, aby wywołać efekt przeciwnowotworowy lub po prostu nie jest w stanie przekroczyć BBTB, aby dotrzeć do komórek nowotworowych3. Kilka badań przedklinicznych i klinicznych nie zajmowało się kwestią przenikania BBTB, ale próbowano przejściowo zakłócić BBTB, na przykład za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków4,5, lub obejść go poprzez bezpośrednie dostarczanie leków in situ6. Jednak żadna z tych technik nie była w stanie przeciwdziałać nieuniknionej ekspansji lub nawrotowi guza. W związku z tym, przy opracowywaniu nowych terapii przeciwglejakowych, dyfuzja przez BBTB powinna być traktowana jako jeden z krytycznych aspektów skutecznego dostarczania środków terapeutycznych7.

Ze względu na bardzo złożoną naturę interakcji komórkowych w BBTB, badania in vivo na zwierzętach laboratoryjnych wydają się być oczywistym wyborem podczas badania przejścia molekuł z krwi do mózgu. Metody in vivo na dużą skalę są jednak stosunkowo skomplikowane do ustalenia, a zatem nie pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe cząsteczek w rozsądnym czasie przy rozsądnych kosztach. Co ważniejsze, testy na zwierzętach muszą być zgodne z wytycznymi etycznymi 3R zdefiniowanymi jako i) udoskonalić, ii) zredukować i, co ma znaczenie w obecnym kontekście, iii) zastąpić alternatywnymi protokołami (np. metodami in vitro/in silico). W związku z tym odtworzenie BBTB in vitro wydaje się interesującą i atrakcyjną możliwością, ale stanowi również złożone zadanie, które wiąże się z różnymi ograniczeniami. Opublikowano wiele prób odtworzenia tego złożonego przedziału z hodowanymi komórkami pierwotnymi lub liniami komórkowymi pochodzenia psiego, świńskiego, mysiego, a nawet ludzkiego (zgodnie z recenzją Rahman et al.8 i Helms et al.9). Modele te obejmują trójwymiarowe systemy mikroprzepływowe10, BBB-on-a-chip11,12 oraz wiele wariantów opartych na klasycznych kokulturach w systemach insertów. Niemniej jednak, obecne systemy mikroprzepływowe i chipowe albo nie nadają się do szybkich, wysokoprzepustowych badań walidacyjnych leków13,14 lub są obecnie niekompatybilne z badaniami nad dostarczaniem leków do guzów mózgu. Ponadto przegląd 155 opublikowanych modeli wykorzystujących komórki pierwotne, indukowalne pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) lub komercyjne linie komórkowe hodowane wspólnie na inteszach wykazał tendencję do rozbieżności między badaniami w ich pomiarach i/lub wnioskach8. Ten brak odtwarzalności międzylaboratoryjnej może być skorelowany z i) nieznormalizowanymi warunkami hodowli, na przykład z opcjonalnym pokryciem białkami macierzy błony podstawnej w naczyniu hodowli komórkowej, ii) zwiększoną liczbą subkultur i użyciem pożywek zawierających surowicę, które są głównymi czynnikami powodującymi genetyczne i fenotypowe modyfikacje linii komórkowych15lub iii) trudność w odtwarzalnym odtworzeniu właściwej równowagi między składnikami astrogleju i śródbłonka w naczyniu. Chociaż wykorzystanie unieśmiertelnionych komórek lub komercyjnych linii komórkowych do stworzenia modelu BBB in vitro nie ma niektórych właściwości w porównaniu z podobnymi modelami, które wykorzystują tylko komórki pierwotne, w opisanej metodzie pokazujemy, że właściwa kombinacja komórek wykazuje bardzo porównywalną wydajność do opublikowanych badań w innych modelach referencyjnych16, 17. Ostatecznie, brak solidnego i powtarzalnego modelu do badania przechodzenia związków terapeutycznych ukierunkowanych na nowotwory mózgu przez BBTB zmotywował nas do opracowania opisanych tutaj metod.

Ponieważ celem było wykorzystanie modelu do przewidywania dostarczania nanocząsteczek in vivo w przedklinicznych modelach zwierzęcych, najpierw zweryfikowaliśmy model BBTB, wykorzystując wstawki zawierające mysie komórki śródbłonka stykające się z mysimi astrocytami. Oprócz tego zoptymalizowaliśmy również model tak, aby wykorzystywał niektóre ludzkie linie komórkowe. Po ustabilizowaniu bariery komórkowe są przenoszone do hodowli z kulkami glejaka pochodzącymi od pacjenta lub komercyjnymi liniami komórkowymi glejaka. Następnie transcytozę nanocząstek i celowanie w komórki nowotworowe można uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej i określić ilościowo poprzez pobieranie próbek w czasie. Co ważne, wyniki uzyskane przy użyciu naśladowców BBTB mogą wiarygodnie przewidywać zachowanie nanocząstek in vivo, co przemawia za zastosowaniem naśladownictwa BBTB przed walidacją przedkliniczną.

Protokół

Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Doświadczeń na Zwierzętach Okręgu Południowej Finlandii (ESAVI/6285/04.10.07/2014).

1. Utworzenie analogów BBTB

UWAGA: Pożywka do hodowli komórek oraz suplementy zostały szczegółowo opisane w Tabeli materiałów.

  1. Przygotowanie astrocytów
    UWAGA: Poniższe objętości są odpowiednie dla szalki Petriego o średnicy 10 cm lub kolby do hodowli komórek T75.
    1. W sterylnej komorze do hodowli komórek ostrożnie przemyć hodowlę astrocytów 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Delikatnie usunąć PBS za pomocą pompy próżniowej i dodać 2 ml odczynnika do dysocjacji komórek na 5 min (w temperaturze 37 °C, patrz na Tabela materiałów) w celu ododerwania komórek. Sprawdzić ododerwanie komórek pod mikroskopem. Nie przekraczać 5 min inkubacji, aby ograniczyć stres komórkowy.
    2. Do naczynia należy dodać 10 ml sterylnej, kompletnej pożywki do hodowli astrocytów (ABM+), aby zahamować działanie odczynu do dysocjacji komórek. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść oddzielone komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Zawiesinę komórkową wirować przez 3 min w temperaturze pokojowej (RT) przy 250 rcf (przyspieszenie: 9 rcf/s, zwolnienie: 5 rcf/s).
    3. W międzyczasie przygotuj wkłady (patrz na Tabela materiałów): za pomocą sterylnej pęsety umieścić wkłady z mózg stroną do góry (Rysunek 1A) na pokrywce sterylnej płytki 6-dołkowej (Rycina 1B). Należy wcześniej upewnić się, że płytkę można położyć odwrócone dnem do góry na wkładkach w taki sposób, aby w trakcie tego procesu nie dotykać wkładkami ani ich nie przesuwać.
      UWAGA: Prawidłowe umieszczenie wkładów umożliwia uwięzienie zawiesiny astrocytów pomiędzy membraną a dnem dołka.
    4. Po odwirowaniu ostrożnie odlej nadsącz z zawiesiny komórkowej; zawiesić ponownie osad astrocytów w 1 ml ABM+, delikatnie rozprowadzając osad w probówce.’ściany do 5x. Należy unikać nadmiernego pipetowania komórek, aby ograniczyć stres komórkowy. Należy policzyć komórki i dostosować gęstość zawiesiny komórkowej do 1,5 x 105 komórki w 400 µL z ABM+/insertu.
    5. Umieść zawiesinę komórkową na środku wkładki po stronie odpowiadającej mózgowi’membrana (Rycina 1B) i bardzo ostrożnie rozprowadzić, wykorzystując siły kapilarne i sterylną końcówkę pipety. Należy unikać bezpośredniego kontaktu, ponieważ membrana jest szczególnie delikatna.
    6. Kładąc płytkę 6-dołkową z powrotem na insertach, tak aby strona z mózgiem pozostała skierowana do góry, zapewniamy, że zawiesina komórkowa zostanie uwięziona pomiędzy membraną a samym dnem dołka (Rycina 1C). Należy unikać pęcherzyków powietrza w zawiesinie komórkowej, ponieważ mogą one uniemożliwić jednorodne rozprzestrzenienie się astrocytów na membranie.
    7. Umieść płytkę i wkłady, stroną z mózgiem do góry, w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO­2) aby umożliwić adhezję komórek przez minimum 2 h (w przypadku unieruchomionych astrocytów mysich) lub do 6 h (w przypadku pierwotnych astrocytów ludzkich).
      UWAGA: Ponieważ wkłady są utrzymywane w pozycji odwróconej, wizualizacja adhezji komórkowej pod mikroskopem nie jest możliwa. Zaleca się zatem wysianie komórek do osobnego, standardowego naczynia hodowlanego i kontrolowanie adhezji komórek w tym naczyniu w czasie. Niezbędna jest ostrożna manipulacja membraną, gdyż w przypadku jej uszkodzenia uzyskane wyniki będą niewiarygodne.
    8. Po zakończeniu czasu inkubacji należy sprawdzić, czy nie doszło do wycieku zawiesiny komórkowej poza obszar wysiewu; w przypadku stwierdzenia nieszczelności należy odrzucić wkłady. Płytkę 6-dołkową należy przywrócić do pozycji standardowej, tak aby wkłady znajdowały się teraz stroną z krwią skierowaną ku górze (Rycina 1A). Do każdej studni należy dodać 2,6 ml ABM+. Do każdego insertu należy wlać 2,5 ml pełnej pożywki dla astrocytów, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO­2).
  2. Przygotowanie komórek śródbłonka
    UWAGA: W przypadku mysich komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (bEND3), komórki muszą osiągnąć 100% konfluencji, aby zapewnić maksymalną liczbę kontaktów międzykomórkowych wyzwalających optymalną ekspresję białek połączeń ścisłych w dniu eksperymentu. Nie dotyczy to ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HuAR2T), ponieważ w przypadku tych komórek do ekspresji białek połączeń ścisłych wymagana jest obecność astrocytów.
    1. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem dla astrocytów (kroki 1.1.1 i 1.1.2.). Po odwirowaniu ostrożnie odlej nadsącz; resuspenduj osad komórek śródbłonka w 1 ml pełnej pożywki do hodowli komórek śródbłonka (EBM+), powoli pipetując zawiesinę komórkową w probówce.’ściankę do 5x. Unikaj nadmiernego pipetowania komórek, aby ograniczyć stres komórkowy. Policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórkowej do 2 x 105 komórki w 2,5 ml/insert pożywki do hodowli komórek śródbłonka pozbawionej surowicy (EBM-) oraz czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-A (VEGF-A).
    2. Wyjąć płytkę zawierającą wkłady, ostrożnie usunąć medium ze strony krwi i zastąpić je 2,5 ml zawiesiny komórek śródbłonka. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO­2) i pozostawić na noc, aby komórki śródbłonka przywarły do membrany.
    3. Następnego dnia przygotować sterylną płytkę 6-dołkową, przelewając 3 ml uprzednio ogrzanej, wolnej od surowicy pożywki dla astrocytów (ABM-) do każdego dołka. Używając sterylnej pęsety do manipulowania wkładami, ostrożnie usunąć kompletną pożywkę dla komórek śródbłonka ze strony krwi, umieścić wkład w nowej płytce zawierającej ABM- i dodać 2,5 ml EBM-.
      UWAGA: Stosowanie EBM- jest kluczowe dla utworzenia bariery śródbłonkowej (należy odnieść się do sekcji dyskusji).
    4. Pozostaw wkładki w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO­2) przy minimalnych zakłóceniach fizycznych i wahaniach temperatury przez 5 dni, aby umożliwić wytworzenie błony podstawnej śródbłonka, ustanowienie kontaktów astrocytów z komórkami śródbłonka, a w konsekwencji sformowanie modelu BBTB. Wymień pożywkę w dniu przeniesienia kultur komórek glejaka (należy odnieść się do sekcji 1.4).
  3. Pomiar przepuszczalności modelu BBTB (opcjonalnie)
    figure-protocol-1
    1. Pasywna dyfuzja małocząsteczkowego fluorescencyjnego barwnika, fluorezeinianu sodu (Na-Fl), w czasie z krwi na stronę mózgową wstawek pozwala na obliczenie wartości przepuszczalności według następującego wzoru:
      ​Tutaj, dFdołek jest wartością fluorescencji zmierzoną w dołku w określonym punkcie czasowym pomniejszoną o wartość autofluorescencji pożywki do hodowli komórkowej, dT czas podany w sekundach, A powierzchnia bariery w centymetrach kwadratowych i dFWstawić (wartość fluorescencji zmierzona w insertcie w tym samym punkcie czasowym pomniejszona o wartość autofluorescencji medium).
    2. Zbierz 100 µL podłoże z obu stron (krwistej i mózgowej) modelu BBTB i przenieść każdą z próbek do osobnej czarnej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem w celu przeprowadzenia kolejnych pomiarów fluorescencji. Jako próbę ślepą do korekcji autofluorescencji należy wykorzystać czyste podłoże.
    3. Przygotować 2,5 ml na dołek roztworu Na-Fl (50 µM) w EBM-. Podgrzej roztwór Na-Fl do 37 °CWymień pożywkę po stronie krwi w insertach na pożywkę zawierającą Na-Fl. Uruchom stoper natychmiast po wymianie pożywki.
    4. Ostrożnie zebrać 100 µL pośrodka z obu stron wkładki (strony krwawej i mózgowej) w czasie 5, 30, 60 i 120 min. Przenieś każdą próbkę do osobnych dołków czarnej płytki 96-dołkowej.
    5. W związku z tym należy uzupełnić pobrane pożywki w insertach, aby zachować równowagę objętości po obu stronach. Pomiędzy kolejnymi pobraniami próbek inserty należy umieszczać z powrotem w inkubatorze, aby zminimalizować wahania temperatury.
    6. Zmierz fluorescencję zebranych próbek, używając czytnika płytek z zestawem filtrów ustawionym na 480/560 nm (odpowiednio wzbudzenie i emisja).
      UWAGA: Fluorescencja z mózg poziom jest niemal niewykrywalny w punkcie czasowym 5 min. Wysokie wartości w porównaniu z próbą ślepą wskazują na nieszczelność lub uszkodzenie insertu’błonę lub barierę; należy zatem wykluczyć te próbki z dalszych analiz. Oczekiwane wartości przepuszczalności Na-Fl dla BBTB powinny mieścić się w zakresie 10-5 do 10-6 zakres cm/s (Tabela 1).
  4. Przygotowanie komórek glejaka
    UWAGA: Choć w niniejszym protokole wykorzystano sferoidy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów, można go łatwo dostosować do adhezyjnych, komercyjnie dostępnych linii komórkowych glejaka wielopostaciowego, takich jak U-87MG.
    1. Opcjonalnie, w przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego, należy umieścić do czterech okrągłych, sterylnych szkiełek nakrywkowych z borokrzemianu (ø (0,9 cm) na dołek w płytce 6-dołkowej zawierającej 2 ml poli-D-lizyny (0,01%). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    2. W tym czasie ostrożnie przenieś sferoidy nowotworowe z naczynia hodowlanego do sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Sferoidy nowotworowe wiruj przez 3 min przy 250 rcf.
    3. Odlać supernatant, delikatnie resuspendować sfery w 1 ml pożywki dla komórek glejaka pozbawionej bFGF/EGF (GBM-) i policzyć komórki. Dostosować gęstość komórek do wartości około 104 sfer/ml (105 komórek/ml) w GBM-.
    4. Odlaj polilizynę z dołków i przepłucz je trzykrotnie sterylnym PBS. Naniesiesz na płytkę 3 ml zawiesiny sferoidów nowotworowych na dołek, a następnie przenieś wkłady z modelem BBB na zawiesinę komórek nowotworowych.
    5. Inkubować przez noc (w temperaturze 37 °C z 5% CO­2) aby umożliwić osiągnięcie stanu równowagi między stroną krwi a stroną guza mózgu w układzie testowym. Następnego dnia należy wymienić medium po stronie krwi na EBM uzupełniony o interesujące badacza cząsteczki/leki/nanocząsteczki. Próbki są pobierane w określonych odstępach czasu w celu bezpośredniego oznaczenia ilościowego, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Komórki są utrwalane w ściśle określonym punkcie czasowym do obrazowania fluorescencyjnego (należy odnieść się do  sekcje 2.1 i 2.2).

2. Wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne BBTB

UWAGA: 4% paraformaldehyd (PFA, pH 7.4, 6 mL na powtórzenie BBTB) jest zawsze przygotowywany na świeżo w PBS. Przechowywać w lodzie.

UWAGA: PFA jest substancją rakotwórczą. Podczas pracy z PFA należy używać rękawiczek nitrylowych i przygotowywać roztwór w dygestorium chemicznym.

  1. Ekspresja białek połączeń ścisłych w śródbłonku BBTB
    1. Przepłucz obie strony membrany lodowatym PBS (3x przez 5 min, 2,5 ml/insert, 3 ml/dołek). Odlej PBS i dodaj odpowiednio 3 ml i 2,5 ml lodowatego 4% PFA do dołka i do insertu. Inkubuj na lodzie przez 10 min. Odlej PFA (zgodnie z zasadami instytucji’(zgodnie z procedurą utylizacji odpadów chemicznych niebezpiecznych) i przepłukać 3 razy buforem PBS w temperaturze pokojowej (2,5 ml/wkład, 3 ml/dołek).
      UWAGA: Po utrwaleniu próbki można przechowywać w PBS (2,5 ml/wkład, 3 ml/dołek) w temperaturze 4°C °C przez tydzień.
    2. Za pomocą patyczka higienicznego przetrzyj stronę wkładki od strony mózgu i usuń astrocyty. Używając ostrego skalpela, ostrożnie przetnij błonę na cztery równe części, wykonując dwa prostopadłe cięcia w kształcie krzyża. Następnie wprowadź skalpel w miejsce, w którym błona przylega do ścianki wkładki, i obracaj wkładkę drugą ręką, aby uwolnić cztery próbki. Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przenieś każdą próbkę do płytki 24-dołkowej zawierającej 200 µL PBS/dołka, z warstwą krwi skierowaną do góry w każdej dołce.
    3. Zablokować membrany, używając 10% płodowej surowicy bydlęcej w PBS (przez 30 min w temperaturze pokojowej, 200 µL/well). Przygotuj 1° roztwór przeciwciał do immunobarwienia białek połączeń ścisłych (Rysunek 1D) (zonula occludens-1, claudyna-5; należy odnieść się do) Tabela materiałów) w 200 µL roztworu blokującego/do studzienki. Opcjonalnie tożsamość komórek śródbłonka weryfikuje się poprzez dodanie przeciwciała skierowanego przeciwko cząsteczce adhezji komórek śródbłonka naczyń i płytek krwi (PECAM1 lub CD31; należy odnieść się do Tabela materiałów) do każdego roztworu przeciwciał przeciwko połączeniom ścisłym. Odrzucić roztwór blokujący i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi’ przez noc w 4°C °C.
    4. Następnego dnia usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i wypłukać je za pomocą 200 µL buforu PBS (3 x 5 min w temperaturze pokojowej). Następnie inkubować je z odpowiednimi gatunkowo przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluorophorem (rozcieńczenie 1:500, 200 µL/well, rozcieńczony w roztworze blokującym; prosimy odnieść się do Tabela materiałów) przez 2 h w temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić przeciwciała wtórne, wypłukać za pomocą 200 µL buforem PBS (3 x 5 min w temperaturze pokojowej). Usunąć bufor PBS i przeprowadzić kontrastowe barwienie jąder komórkowych, używając roztworu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) o stężeniu końcowym 1 µg/ml w czystej wodzie destylowanej2Woda destylowana (dH₂O)2O; 200 µL/wellproszę odnieść się do Tabela materiałów). Inkubować przez 7 min w temperaturze pokojowej. Usunąć DAPI i przemyć membrany 3x wodą destylowaną (dH2O)2O (200 µL/well).
    6. Nanieś kroplę medium montażowego (patrz w Tabela materiałów) na szkiełku przedmiotowym. Używając pęsety precyzyjnej, ostrożnie wyjmij membranę z dołka i, zachowując jej orientację, usuń nadmiar dH2O i umieść go na kropli medium montażowego. Nałóż kolejną kroplę medium montażowego na membranę i ostrożnie przykryj ją szkiełkiem podstawowym z borokrzemianu. Upewnij się, że nie pozostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °w temperaturze 4°C i w ciemności do momentu przeprowadzenia obserwacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
      UWAGA: Barwienie astrocytów można przeprowadzić, umieszczając fragmenty membran w płytce 24-dołkowej stroną mózgową do góry, przy użyciu wybranych przeciwciał specyficznych dla astrocytów (np. skierowanych przeciwko kwaśnemu białku włókienstwa gliaльного [GFAP]) (Rysunek 1E).
  2. Barwienie fluorescencyjne BBTB w celu wykrycia transcytozy nanocząsteczek
    1. Przeprowadź znakowanie lizosomów w żywych komórkach (np. przy użyciu sond fluorescencyjnych [zob. the Tabela materiałów]). Rozcień fluorescencyjny barwnik lizosomalny do stężenia roboczego 50 nM w uprzednio ogrzanym medium EBM- (2,5 ml/insert) lub 75 nM w uprzednio ogrzanym medium ABM- (3 ml/dołek) w celu odpowiednio oznakowania lizosomów w komórkach śródbłonka i astrocytach. Inkubuj komórki przez 45 min (w temp. 37 °C z 5% CO­2); następnie wypłukać 3x lodowatym PBS (2,5 ml/insert, 3 ml/dołek).
    2. Odlać PBS i dodać odpowiednio 3 ml oraz 2,5 ml schłodzonego do temperatury 0°C 4% PFA do dołka i do wkładu. Inkubować na lodzie przez 10 min. Odlać PFA i przemyć komórki 3x PBS (w temperaturze pokojowej, 2,5 ml/wkład, 3 ml/dołek).
      UWAGA: Po utrwaleniu próbki można przechowywać w PBS (2,5 ml/insert, 3 ml/dołek) w temperaturze 4 °C przez tydzień.
    3. Usunąć PBS i przeprowadzić przeciwbarwienie jąder komórkowych, stosując roztwór DAPI o stężeniu końcowym wynoszącym 1 µg/mL w dH2O2O (1 ml/insert, 1 ml/dołka). Inkubować przez 7 min w temperaturze pokojowej. Usunąć DAPI i przemyć membrany 3 razy wodą destylowaną (dH2O)2O (2,5 ml/wkład, 3 ml/dołek).
    4. Ostrożnie wytnij membranę i usuń nadmiar dH2O2O, a następnie umieść go w kropli medium montażowego (patrz na Tabela materiałów) na szklanym szkiełku przedmiotowym. Nanieść kolejną kroplę medium montażowego po drugiej stronie błony i ostrożnie przykryć ją szkiełkiem nakrywkowym z borokrzemianu. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C i przechowywać je w ciemności do czasu obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.
  3. Barwienie fluorescencyjne komórek nowotworowych
    1. Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przenieś okrągłe szkiełka nakrywki zawierające sferoidy nowotworowe do płytki 24-dołkowej wypełnionej lodowatym PBS. Następnie przeprowadź znakowanie lizosomów w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnych sond lizosomalnych w stężeniu 75 nM w uprzednio ogrzanym medium GBM- (200 µL/well). Inkubować próbki przez 45 min, a następnie przemyć je 3 razy lodowatym PBS (200 µL/well).
    2. Odpiąć PBS i dodać 200 µL lodowatego PFA na dołek. Inkubować w lodzie przez 10 min. Odpić PFA i przepłukać próbki 3x w PBS (w temperaturze pokojowej).
      UWAGA: Po utrwaleniu próbki można przechowywać w PBS (200 µL) w 4 °C przez tydzień.
    3. Usunąć PBS i przeprowadzić barwienie kontrastowe jąder komórkowych, używając roztworu DAPI o stężeniu końcowym wynoszącym 1 µg/mL w dH2O2O (200 µL/well). Inkubować przez 7 min w temperaturze pokojowej. Usunąć DAPI i przemyć szkiełka nakrywki 3 razy wodą destylowaną (dH2O)2O (200 µL/well).
    4. Za pomocą precyzyjnej pęsety wyjmij szkiełko nakrywkę i usuń nadmiar dH2O2O, a następnie nanieś go na kroplę medium montażowego (patrz na Tabela materiałów) na szklanym szkiełku przedmiotowym. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C i przechowywać je w warunkach chroniących przed światłem do czasu wykonania obserwacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

3. Porównawcze badanie in vivo

  1. Rejestracja in situ dyfuzji fluoresceiny sodowej przez barierę krew-mózg
    1. Przygotuj 150 µL roztworu Na-Fl o stężeniu 50 nM w roztworze fizjologicznym. Należy utrzymać roztwór w temperaturze 37 °C po podaniu dożylnym.
    2. Zanurzyć mysz w znieczuleniu poprzez dokonać dostrzykiwania dootrzewnowego mieszanki ketaminy i ksylazyny (300 µL (100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny w PBS). Po uzyskaniu głębokiej anestezji umieścić zwierzę na podgrzewaczce w celu utrzymania temperatury ciała.
      UWAGA: Do uzyskania przedstawionych danych wykorzystano dziesięciotygodniowe samice myszy nago z immunodeficytem z linii Naval Medical Research Institute (NMRI). Rysunek 2Jednakże protokół ten został dostosowany zarówno do myszy immunokompetentnych, jak i z niedoborem odporności. Metoda znieczulenia/analgezji zależy od decyzji naukowca’według uznania badacza. Nie zaleca się jednak stosowania znieczulenia inhalacyjnego, takiego jak izofluran, ponieważ znacznie zwiększa ono przepuszczalność bariery krew-mózg (BBB)18.
    3. Umieść mysz w aparacie stereotaksycznym (patrz na Tabela materiałów) i wykonaj podłużne nacięcie skóry głowy za pomocą drobnych nożyczek, a następnie, używając precyzyjnej pęsety, delikatnie rozdziel tkankę łączną, aby odsłonić czaszkę. Wykonując ruchy okrężne za pomocą precyzyjnego mikrowiertła, usuń ø okrągły fragment czaszki o średnicy 0,3 mm z lewej lub prawej kości ciemieniowej. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wiercenia oraz usuwania fragmentu czaszki, aby uniknąć uszkodzenia znajdującej się poniżej tkanki oponowej i naczyń krwionośnych.
    4. Nanieś kroplę roztworu fizjologicznego na odsłoniętą tkankę. Używając dwóch par pęset precyzyjnych, ostrożnie usuń tkankę opon mózgowych, aby uzyskać dostęp do kory mózgu. Tkanka mózgowa nie może mieć bezpośredniego kontaktu z powietrzem.
      UWAGA: Niewielkie krwawienia wynikające z uszkodzenia opon mózgowo-rdzeniowych można zatamować za pomocą gąbek hemostatycznych (należy odnieść się do Tabela materiałów).
    5. Po usunięciu tkanki oponowej i całkowitym odsłonięciu kory, należy uwięzić kroplę roztworu fizjologicznego między korą a ø szkiełko nakrywkowe z borokrzemianu o grubości 0,5 mm. Zabezpieczyć obszar obserwacyjny kroplą kleju cyjanoakrylowego (należy odnieść się do Tabela materiałów) rozprowadzić po szkiełku nakrywkowym za pomocą igły. Pozostawić klej do wyschnięcia na 1 min.
    6. Przygotuj implantowany cewnik do wstrzyknięć do żyły ogonowej (Rycina 2A). Odłam końcówkę igły 25 G za pomocą kleszczyków Rochester-Ochsner i wprowadź ją do rurki poliuretanowej PE20 o długości 10 cm (należy odnieść się do Tabela materiałów) (Rycina 2A).
    7. Wprowadź cewnik do bocznej żyły ogonowej myszy, używając klamer typu bulldog do manipulacji cewnikiem i jego wprowadzenia (należy odnieść się do Tabela materiałów) (Rysunek 2B). Wprowadzoną igłę należy unieruchomić za pomocą kropli kleju cyjanoakrylowego. Pozostawić klej do wyschnięcia na 20 s przed zdjęciem klamry typu bulldog. Ostrożnie połączyć drugi koniec cewnika z igłą 25 G podłączoną do strzykawki zawierającej roztwór Na-Fl (Rysunek 2B).
    8. UWAGA: Nie należy zaciskać ogona kleszczykami typu bulldog; służą one wyłącznie do precyzyjnego manipulowania cewnikiem. Prawidłowe wprowadzenie cewnika można potwierdzić, obserwując cofanie się krwi do przezroczystego przewodu.
    9. Umieść zwierzę pod stereomikroskopem (patrz na Tabela materiałów). Wykorzystując niskopoziomową autofluorescencję w kanale zielonym (480 nm), należy ustawić ostrość na obszarze zawierającym stosunkowo duże naczynia krwionośne (wyglądają one na ciemniejsze ze względu na absorpcję światła o tej długości fali przez hemoglobinę) oraz mniejsze kapilary (Rycina 2C). Rozpocznij akwizycję time-lapse krótko przed wstrzyknięciem barwnika fluorescencyjnego, aby zmierzyć fluorescencję tła.
      UWAGA: Alternatywnie rejestrację time-lapse można zastąpić zdjęciami wykonanymi w punkcie czasowym T0 oraz w innych określonych punktach czasowych.
    10. Wstrzykuj roztwór powoli i w sposób ciągły lub alternatywnie użyj automatycznego systemu infuzyjnego. Wykrywana we krwi fluorescencja Na-Fl powinna pozostać stabilna (okres półtrwania we krwi: 286 min), co pozwala na rejestrację dyfuzji przez barierę krew-mózg (BBB) przez okno czaszkowe przez kilka minut. Po zakończeniu akwizycji ostrożnie usuń cewnik i uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie stawów kręgowych szyi.
  2. Oznaczanie przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo
    UWAGA: Wartości pozyskuje się przy użyciu dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazów, np. ImageJ, co umożliwia pomiar intensywności sygnału fluorescencji wewnątrz wyznaczonego obszaru zainteresowania (ROI).
    1. Używając narzędzia do adnotacji, narysuj prostokątny obszar ROI poza naczyniem krwionośnym, w tkance mózgowej, w okolicach 5 µm odległość od wszelkich widocznych naczyń krwionośnych wypełnionych Na-Fl. Należy odnotować wymiary ROI oraz zmierzoną intensywność fluorescencji w czasie T0 w tym ROI, która służy jako tło (blank) dla tkanki’autofluorescencji. Bez przemieszczania ROI należy przyspieszyć odtwarzanie do punktu czasowego po wstrzyknięciu (np. do ostatniej zarejestrowanej klatki, gdy do zwierzęcia wstrzyknięto cały roztwór) i odnotować dokładny czas oraz wartości fluorescencji zmierzone w obrębie ROI (Rycina 2C).
    2. Przesuń obszar zainteresowania (ROI) na widoczne naczynie krwionośne (Rycina 2C) i zapisz wartość autofluorescencji T0 dla krwi. Bez przesuwania obszaru zainteresowania (ROI) przejdź do tego samego punktu czasowego, który określono w kroku 3.2.1., i zapisz wartość fluorescencji zmierzoną w obrębie ROI (Rycina 2C).
      figure-protocol-2
    3. Aby wyznaczyć przepuszczalność BME, należy zastosować następujący wzór (zaadaptowany z sekcji 1.3):
    4. Tutaj, dFmózg wartość intensywności fluorescencji pomniejszona o wartość tła w punkcie T0 w mózgu, dT jest czas akwizycji w sekundach, A to przybliżona powierzchnia naczynia, przyjęta jako obszar ROI w centymetrach kwadratowych, a dFkrew jest wartością intensywności fluorescencji pomniejszoną o wartość tła (blank) w czasie T0 we krwi.
      UWAGA: Oczekiwane wartości przepuszczalności dla BBB powinny mieścić się w przedziale 10-6 zakres cm/s (Tabela 1).
  3. Obróbka tkanek w celu detekcji fluorescencyjnych nanocząsteczek w mózgu myszy
    1. Zaimplantować sferoidy glejaka wyjściowego od pacjenta (5 x 104 komórki w 5 µL (sterylnego PBS) do ciała modzelowatego u znieczulonych 6-tygodniowych samic myszy nago NMRI. Zlokalizuj ten obszar mózgu według następujących współrzędnych stereotaksyjnych, poczynając od Bregmy: przód-tył + 0,5 mm, lewo-prawo + 2,5 mm, grzbiet-brzuch + 3 mm. Pozostaw guza mózgu do wzrostu przez 2 tygodnie.
    2. Wstrzyknąć nanocząstki dożylnie (100 µg w 100 µL roztworu soli fizjologicznej) i pozostawić je do krążenia przez 8 h. Myszom kontrolnym wstrzyknąć dożylnie 100 µL sterylnego roztworu fizjologicznego.
    3. Uśmierć myszy poprzez zwichnięcie stawów szyjnych i szybko pobierz mózgi w celu błyskawicznego zamrożenia w izopentanie utrzymywanym na suchym lodzie (1 min w -50 °C). Przechowywać mózgi w temperaturze -80°C. °do momentu opracowania tkanek.
    4. Wykonaj koronalne przekroje mózgu za pomocą kriomikrotomu. Zlokalizuj miejsce implantacji wewnątrzczaszkowej po bliznie powstałej na korze i wykonaj cięcie. 9 µm-grube skrawki z tego obszaru na odpowiednie szkiełka przedmiotowe (patrz w części Tabela materiałów).
    5. Zanurzyć preparaty przekrojów mózgu unieruchomionych na szkiełkach w lodowatym PBS (2x przez 5 min), a następnie utrwalić je w lodowatym 4% PFA (przez 5 min). Przemyć szkiełka w PBS (3x przez 5 min w temperaturze pokojowej). Położyć szkiełka poziomo i nanieść pipetą roztwór blokujący zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej w PBS na przekroje tkanek, pokrywając całą ich powierzchnię (na 1 h w temperaturze pokojowej). 500 µL/slide). Przygotować przeciwciało CD31 (należy odnieść się do Tabela materiałów) w 250 µL roztworu blokującego/preparatu. Roztwór blokujący należy zastąpić przeciwciałem i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze z nawilżeniem.
    6. Następnego dnia zanurz preparaty w PBS (3x przez 5 min w temperaturze pokojowej) i inkubuj je z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluorochromem (1:500 w 250 µL z PBS przez 2 h w temperaturze pokojowej). Płukać 3x w PBS (w temperaturze pokojowej) i przeprowadzić kontrastowe barwienie jąder komórkowych, używając roztworu DAPI o końcowym stężeniu 1 µg/mL w dH₂O2O (250 µL/slide). Inkubować próbki przez 7 min w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór DAPI i przemyć preparaty 3x wodą destylowaną (dH2O).2O.
    7. Na każdy przekrój tkanki nanieś jedną kroplę medium montażowego (należy odnieść się do Tabela materiałów) i zabezpieczyć próbki szkiełkiem nakrywkowym. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C i przechowywać je w ciemności do momentu przeprowadzenia obserwacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Obrazowanie konfokalne mysiego modelu BBTB wykazuje ekspresję i lokalizację komórkową białek połączeń ścisłych: zonula occludens-1 (ZO-1) oraz klaudyny-5 w komórkach bEND3. Kontakty między komórkami śródbłonka a astrocytami wyraźnie wywołały relokację ZO-1 i klaudyny-5 do miejsc kontaktu międzykomórkowego komórek śródbłonka w porównaniu z monokulturami bEND3 (Rycina 1D). Dzięki zastosowaniu barwienia immunofluorescencyjnego w celu wizualizacji wykazujących ekspresję GFAP astrocytów po stronie mózgowej membrany, możliwe jest obserwowanie i badanie wypustek astrocytarnych oraz stópek kontaktujących się z komórkami śródbłonka poprzez membranę (Rycina 1E). Znane jest, że kontakty między astrocytami a komórkami śródbłonka wspomagają i stabilizują uszczelnianie bariery komórkowej i wiążą się z niższymi wartościami przepuszczalności BBB19. Zgodnie z tym zaobserwowaliśmy znaczny spadek przepuszczalności mysiego modelu BBTB dla Na-Fl z 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s w przypadku monokultur do 6,74 (± 3,01) x 10-6 cm/s podczas kokultury z astrocytami z nokautem czynnika indukowanego hipoksją (HIFko) (Tabela 1). Unieśmiertelniona linia HuAR2T tworzy wysoce przepuszczalne bariery komórkowe (104,92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, Tabela 1). Podobnie jak w modelu mysim, zmierzyliśmy znacznie niższą przepuszczalność BBTB dla Na-Fl, mianowicie 47,4 (± 14,32) x 10-6 cm/s, gdy komórki HuAR2T były w kokulturze z ludzkimi pierwotnymi astrocytami (Tabela 1).

W obu modelach BBTB na myszach i ludziach obecność sfer glioblastoma pochodzących od pacjentów wywołała niewielki wzrost wartości przepuszczalności w porównaniu do samych kokultur komórek śródbłonka i astrocytów (Tabela 1). Zjawisko to obserwuje się w przypadku kilku, ale nie wszystkich modeli sfer glejaka od pacjentów. Może to być spowodowane VEGF-A wydzielanym przez niektóre z tych komórek pochodzących od pacjentów.

Aby porównać wartości przepuszczalności in vitro mimo biologicznej bariery krew-mózg (BBTB) z in vivo barierą krew-mózg (BBB), obrazowano dyfuzję Na-Fl w czasie rzeczywistym przez okno czaszkowe wszczepione u myszy nago. Za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego rejestrowano dyfuzję Na-Fl z naczyń kapilarnych odchodzących od głównych naczyń pialnych przed, w trakcie oraz po systemowym wstrzyknięciu sondy (Rysunek 2C). Pomiary różnicowych wartości fluorescencji we krwi krążącej oraz w parenchymie kory mózgowej w czasie pozwoliły nam obliczyć przybliżone wartości przepuszczalności u myszy nude’BBB dla Na-Fl (5,57 ± 2,19 x 10-6 cm/s, Tabela 1).

Aby zilustrować, w jaki sposób ten model BBTB może być wykorzystany do wizualizacji przenikania związków ze strony krwi do strony mózgu, porównaliśmy transcytozę nanocząstek o średnicy ø 110 nm (NP110) oraz ø 350 nm (NP350) celujących w sferoidy glejaka wielopostaciowego pochodzenia od pacjenta. Wyniki uzyskane in vitro porównano następnie z transcytozą in vivo. W przedstawionym przykładzie powierzchnię nanocząstek pokryto peptydem CooP20 celującym w nowotwór i załadowano je barwnikiem fluorescencyjnym (FITC), aby ułatwić wizualizację. Komórki znakowano barwnikiem lizosomalnym i barwiono przeciwbarwnikiem DAPI 24 h po dodaniu nanocząstek FITC po stronie krwi modelu BBTB, a następnie wykonano mikrografie konfokalne na różnych poziomach (np. strona krwi, membrana, strona mózgu oraz sferoidy glejaka pacjenta) (Rysunek 3A). Sygnał fluorescencyjny związany z NP110 kolokalizował z lizosomami w komórkach śródbłonka, astrocytach i komórkach nowotworowych. Ponadto NP110 wykryto pomiędzy komórkami śródbłonka a astrocytami, przenikającymi przez pory membrany insertu (Rysunek 3A).

Przenikanie NP110 określono ilościowo poprzez pomiar fluorescencji z próbek pobranych zarówno ze strony krwi, jak i mózgu. Wartości przepuszczalności porównano z wartościami wyznaczonymi dla nanocząsteczek o średnicy  ø 350 nm (NP350). Wyniki pokazują, że tylko NP110 było w stanie przekroczyć modele BBTB (Rycina 3B). NP350 pozostały po stronie krwi modelu BBTB, co skutkowało niższymi wartościami przepuszczalności dla tych nanocząsteczek.

Aby podkreślić istotność mimetyków BBTB w porównaniu z modelami in vivo, myszom nude wstrzyknięto dożylnie nanocząsteczki NP110 lub NP350 powlekane peptydem CooP celującym w guz i sprzężone z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (TRITC) w celu detekcji. Tkanki pobrane w kilku punktach czasowych wykazały, że po 8 h nanocząsteczki przenikające przez BBB przeniknęły do miąższu mózgu, podczas gdy nanocząsteczki nieprzenikające, które pozostały w krwiobiegu, zostały głównie usunięte z krążenia systemowego in vivo. W związku z tym pobraliśmy mózgi i określiliśmy liczbę nanocząsteczek na milimetr kwadratowy 8 h po wstrzyknięciu. Zgodnie z wynikami in vitro, NP110, a nie NP350, skutecznie przeniknęło do miąższu mózgu (Rycyna 3C). Obrazowanie nanocząsteczek w mózgu przy dużym powiększeniu wykazało, że NP110 było homogenicznie rozłożone w miąższu mózgu poza kapilarami krwionośnymi i skutecznie dotarło do zaimplantowanych komórek glejaka (Rycyna 3D). Pomimo posiadania tej samej grupy celującej w guz (CooP), NP350 nie było w stanie przeniknąć do miąższu mózgu i zostało wykryte jedynie po stronie światła naczyń krwionośnych mózgu (Rycyna 3E), co było zbieżne z wynikami uzyskanymi in vitro.

figure-results-1
Rysunek 1: Opis modelu bariery krew-guz mózgu (BBTB). (A) Schematyczne przedstawienie rozmieszczenia różnych typów komórek. (B) Ilustracja umieszczenia wkładu na pokrywie płytki 6-dołkowej oraz techniki wysiewania astrocytów na stronę mózgową membrany wkładu’. (C) Ilustracja rozmieszczenia płytki 6-dołkowej umożliwiająca adhezję astrocytów. (D) Mikrografie immunofluorescencyjne białek połączeń ścisłych zonula occludens-1 (ZO-1, górny rząd, czerwony) i claudyny-5 (dolny rząd, zielony). Ekspresję białek porównano z mysimi mikro naczyniowymi komórkami śródbłonka mózgu (bEND3) hodowanymi na stronie krwi BBTB jako monokulturę (lewa kolumna) lub z mysimi unieśmiertelnionymi astrocytami HIFko (prawa kolumna). Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). (E) Mikrograf immunofluorescencyjny pokazujący glia lny kwaśny białko (GFAP, czerwony) w astrocytach HIFko hodowanych po stronie mózgowej BBTB. Obraz przy dużym powiększeniu pokazuje wypustki astrocytów i stopki końcowe (strzałki) kontaktujące się z komórkami śródbłonka poprzez pory membrany (prawy panel). Tożsamość astrocytów HIFko została zweryfikowana poprzez barwienie immunofluorescencyjne dużego antygenu T wirusa małpiego 40 (SV40 large T, zielony) wykorzystanego do unieśmiertelnienia komórek. Komórki śródbłonka nie wykazują ekspresji GFAP ani SV40 large T i dlatego mogą być częściowo obserwowane przez przezroczystą, przeciwległą stronę membrany jako komórki barwione wyłącznie DAPI (linie przerywane). Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: In vivo oznaczanie przepuszczalności BBB u myszy. (A) Przygotowanie implantowalnego cewnika do żyły ogonowej. (1) Narzędzia i sprzęt obejmują: (a) rurkę polietylenową PE20, (b) dwie igły 25 G, (c) kleszczyki Rochester-Ochsner oraz (d) mały zacisk typu bulldog. (2) Igłę 25 G usuwa się poprzez kilkukrotne przekręcenie za pomocą kleszczyków i (3) ostrożnie wsuwa do rurki. (4) Drugi koniec rurki zostaje połączony z drugą igłą 25 G. (B) Wytyczne dotyczące implantacji i pozycjonowania cewnika w celu infuzji roztworu fluoresceiny sodowej przez żyłę ogonową myszy. Zakreślony obszar wskazuje miejsce nałożenia kropli kleju cyjanoakrylowego w celu zabezpieczenia cewnika. Zacisk typu bulldog służy do manipulowania cewnikiem i jest usuwany po jego zabezpieczeniu. (C) Reprezentatywne obrazowanie i metoda kwantyfikacji służąca do wyznaczenia wartości przepuszczalności fluoresceiny sodowej. Przed infuzją fluoresceiny sodowej (lewa kolumna) mierzy się autofluorescencję/tło w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) umieszczonego na mózgu (górny panel, biały prostokąt) oraz w obszarach naczyń krwionośnych (dolny panel, czerwony prostokąt). Podczas infuzji fluoresceiny sodowej (prawa kolumna) mierzy się intensywność fluorescencji w obu obszarach ROI, co pozwala na obliczenie przepuszczalności BBB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Przewidywanie wewnątrzczaszkowej transcytozy nanocząstek przez BHE in vivo z wykorzystaniem modelu BBTB in vitro. (A) Graficzna reprezentacja testu BBTB z reprezentatywnymi obrazami konfokalnymi uzyskanymi na wskazanych różnych poziomach mysiego modelu BBTB. Nanocząstki o średnicy 110 nm (NP110) sprzężone z FITC (zielony) dodano po stronie krwi BBTB. Komórki znakowano sondą lizosomalną (LT-99, czerwony).  (1) Komórki śródbłonka, (2) transcytoza śródbłonkowa nanocząstek przez pory membrany (biała przerywana linia), (3) astrocyty oraz (4) sfery glejaka pacjenta zostały zidentyfikowane na grafice i odpowiadających im mikrografiach konfokalnych (po prawej). Enkapsulacja lizosomalna nanocząstek (strzałki) sugeruje aktywną transcytozę przez warstwy śródbłonka i astrocytów BBTB. (B) Ilościowe oznaczenie wskazanej przepuszczalności nanocząstek przez BBTB in vitro (n = 6). (C) Ilościowe oznaczenie wskazanej gęstości nanocząstek w przekrojach tkanki mózgowej 8 h po infuzji do żyły ogonowej u myszy nude (n = 3). (D) Mikrografie konfokalne przedstawiające rozkład nanocząstek o średnicy ø 110 nm (NP110, czerwony) w przekrojach tkanki mózgowej myszy znakowanych przeciwciałem anty-mysim CD31 (zielony). Strzałka wskazuje transcytozę nanocząstek (panel lewy). Nanocząstki nagromadziły się wokół komórek guza mózgu (tumor, panel prawy) dzięki peptydowi celującemu CooP obecnemu na ich powierzchni. W tkance mózgowej (Brain) nie zaobserwowano istotnego hominguu. (E) Mikrografie konfokalne przedstawiające rozkład nanocząstek o średnicy ø 350 nm (NP350, czerwony) w przekrojach tkanki mózgowej myszy znakowanych przeciwciałem anty-mysim CD31 (zielony). Groty strzałek wskazują NP350, które zatrzymały się w świetle naczyń krwionośnych i nie były w stanie przekroczyć BHE, prawdopodobnie ze względu na większą średnicę w porównaniu do NP110. Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). ** P < 0.01. Wartości P obliczono za pomocą dwustronnego, nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

mysi model naśladujący barierę krew-guzy mózgu (BBTB)bEND3bEND3+HIFko AsbEND3+GBbEND3+HIFko As+GBIn vivo
Przepuszczalność (10-6 cm/s)27.636.7426.810.835.57
SD (10-6 cm/s)3.453.017.992.652.19
mimik ludzkiego BBTBHuAR2THuAR2T+hIAsHuAR2T+GBHuAR2T+hIAs+GB
Przepuszczalność (10-6 cm/s)104.9247.489.0848.24
SD (10-6 cm/s)27.114.3210.2113.07

Tabela 1: Wartości przepuszczalności sodu-fluoresceiny (Na-Fl) (w centymetrach na sekundę) określone in vitro w wskazanych systemach kokultury oraz in vivo u myszy nagi NMRI. Dane z reprezentatywnego eksperymentu (n = 3 myszy).

Dyskusja

Rozwój koncepcji zmienności guza między pacjentami ożywił badania nad spersonalizowaną medycyną onkologiczną21. Ta zmienność jest również cechą charakterystyczną nowotworów ośrodkowego układu nerwowego. Ze względu na nieprzewidywalność guza, odpowiedź na chemioterapię zwiększa efekt ochronny bariery krew-mózg w dostarczaniu leków i w sumie stanowi poważne wyzwanie w opiece nad pacjentem22. Aby opracować skuteczniejsze terapie, często konieczne jest badanie przesiewowe dużych bibliotek nowych cząsteczek. Aby ocenić skuteczność przeciwnowotworową i zdolność nowych przewodów terapeutycznych do dotarcia do miejsca guza, najlepszą opcją jest badanie przedkliniczne na komórkach pochodzących od pacjenta wszczepionych in vivo do mysich awatarów pacjentów. Ze względów praktycznych (finansowych, czasowych, ludzkich i obiektowych) i etycznych (zasada 3R w przypadku wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych) opracowanie tak dużej platformy badań przesiewowych in vivo często nie jest możliwe, w związku z czym testy oparte na komórkach pozostają modelem pierwszego wyboru23. Głównym powodem wyboru ustalonych linii komórkowych i unikania komórek pierwotnych jest ułatwienie odtwarzalności i ograniczenie wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, które są głównym źródłem izolacji i zakładania pierwotnych kultur mysich. Przedstawione tu metody, w pełni zgodne z zasadą 3R, mogłyby skutecznie wyeliminować nanocząstki z dalszych badań przedklinicznych na kryterium ich niezdolności do przekroczenia modelu BBTB. Jako dowód słuszności zasady opisujemy tutaj wyniki uzyskane podczas opracowywania i walidacji BBTB. Udało nam się potwierdzić wyniki in vitro in vivo, na przykład podczas pomiaru biernej dyfuzji fluoresceiny sodowej 376 Da.

Protokół opisany w tym artykule opisuje przygotowanie komórek śródbłonka hodowanych wspólnie z astrocytami w celu utworzenia interfejsu przypominającego barierę krew-mózg guza w konfiguracji in vitro. Po nawiązaniu fizycznego kontaktu między tymi dwoma typami komórek, warstwa komórek śródbłonka wykazuje podobieństwa do BBB (np. ekspresja białek ścisłego połączenia na powierzchni komórki i stosunkowo niska przepuszczalność). Co ciekawe, mysi naśladowca BBTB wydawał się zapewniać szczególnie podobne wartości przepuszczalności Na-Fl do tych uzyskanych za pomocą pomiarów przepuszczalności BBB in vivo na myszach24. W związku z tym wydajność naśladowców BBTB będzie bezpośrednio związana z wyborem komórek użytych do utworzenia bariery. Komórki śródbłonka bEND3 pochodzą z mózgu i wiadomo, że skutecznie tworzą bariery, gdy są hodowane wspólnie z astrocytami25. Jednak do wygenerowania mimiki BBTB używaliśmy unieśmiertelnionych astrocytów HIFko26 . Ze względu na brak czynnika indukowanego hipoksją, astrocyty te nie wytwarzają VEGF-A, co jest kwintesencją opisanej tutaj stabilizacji naśladującej BBTB. Astrocyty zostały zidentyfikowane jako modulatory przepuszczalności bariery krew-mózg, na przykład poprzez uwalnianie VEGF-A w odpowiedzi na zapalenie nerwów27. Aktywacja receptorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGFR) jest kluczowym regulatorem przepuszczalności śródbłonka/naczyń krwionośnych zarówno in vitro28 , jak i in vivo29. Dlatego suplementy VEGF-A w pożywce aktywują VEGFR2 na komórkach śródbłonka, co indukuje fosforylację białek połączeniowych adherenów, takich jak VE-kadheryna30. Utrata kontaktów komórka-komórka śródbłonka generuje wysoce przepuszczalne naczynia krwionośne. Podobnie, zarówno silne właściwości mitogenne, jak i nieznany skład płodowych surowic bydlęcych stosowanych w testach hodowli komórkowych powodują poważne problemy ze stabilizacją bariery i odtwarzalnością testu.

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są czasami wykorzystywane do tworzenia BBB in vitro31; jednak znacznie różnią się od komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, takich jak linia komórkowa hCMEC/D332, pod względem ekspresji genów i właściwości tworzenia bariery. Jednak stosunkowo wyższe wartości przepuszczalności uzyskane za pomocą komórek HuAR2T hodowanych samodzielnie w porównaniu z bEND3 zostały znacznie zmniejszone przez kokulturację ich z ludzkimi astrocytami pierwotnymi. Chociaż komórki śródbłonka są niezbędne do utworzenia ściany komórkowej, jasne jest, że astrocyty mają do odegrania równie ważną rolę w tworzeniu i stabilizacji BBTB.

Kiedy do tego równania dodano kulki glejaka pochodzące od pacjentów, mysz naśladująca BBTB podsumowała niektóre cechy mysich ksenoprzeszczepów, takie jak dyfuzja leku przez naczynia krwionośne mózgu i celowanie w komórki nowotworowe. Omawiane tutaj mimiki BBTB odniosły na przykład sukces w odzwierciedleniu zachowania in vivo, gdy przebadaliśmy kilka nanocząstek o różnych średnicach. Aby zilustrować równoległość między modelami in vitro i in vivo, użyliśmy wcześniej opisanych mezoporowatych nanocząstek krzemianu33 o właściwościach penetrujących komórki34 sprzężonych z peptydem CooP ukierunkowanym na nowotwór na ich powierzchni20. Peptyd ukierunkowany na CooP jest domem dla inwazyjnych komórek nowotworowych poprzez specyficzne wiązanie z inhibitorem wzrostu pochodzącym z sutka (MDGI). Kilka nowotworów, w tym glejaki, wykazują nadekspresję MDGI w porównaniu z normalną tkanką35, co sprawia, że CooP jest bardzo skutecznym ugrupowaniem ukierunkowanym na nowotwór, zdolnym do zwiększenia dostarczania ładunku20. Wcześniej wykazano, że zastosowane tutaj nanocząstki dyfundują do miąższu mózgu (27547955), a po sfunkcjonalizowaniu za pomocą Taxolu te nano-ładunki odniosły sukces w zmniejszaniu wzrostu glejaka w modelach przedklinicznych36. Dodanie pozostałości glikolu polietylenowego (PEG) na powierzchni nanocząstek również utrzymało ich ładunek statyczny do wartości dodatnich (około + 4 mV), umożliwiając lepszą interakcję z jednostką nerwowo-naczyniową37 , a także zwiększając ich stabilność w krążeniu. W przedstawionych danych 3 kDa PEG sprzężono z NP110, natomiast NP350 pokryto 10 kDa PEG. Jednak PEG o zwiększonej masie cząsteczkowej spowodował również znaczny wzrost średnicy nanocząstek, stąd ich fizyczne możliwości przekraczania bariery krew-mózg. W związku z tym sprawdziliśmy, czy fizyczne wymiary cząstek uniemożliwiają im przejście przez BBTB i czy obserwacje te można odzwierciedlić in vivo.

Zgodnie z wcześniej opublikowanymi obserwacjami zaobserwowaliśmy, że NP110 wynaczyniane były zarówno przez BBTB in vitro, jak i BBB myszy z guzami wewnątrzczaszkowymi, podczas gdy NP350 zatrzymywane po stronie światła mimiki BBTB i w naczyniach krwionośnych myszy. Te podobne wyniki silnie sugerują, że model BBTB przewidział zdolność nanocząstek do przekraczania bariery krew-mózg in vivo i docierania do mózgu.

Często dyskutuje się o znaczeniu modeli komórkowych bariery krew-mózg, nawet w odniesieniu do centralnego dostarczania nanocząstek38. Pokazujemy tutaj, że pierwotne astrocyty i komórki śródbłonka, oba uważane za najistotniejsze narzędzia in vitro, mogą zostać zastąpione przez unieśmiertelnione i/lub dostępne na rynku komórki, zapewniając większą skalowalność i odtwarzalność. Następna generacja naśladowców BBB in vitro może zostać opracowana poprzez włączenie urządzeń mikroprzepływowych, co pozwoli na pięknie uformowane jednostki nerwowo-naczyniowe, które strukturalnie przypominają rzeczywisty BBB12,14. Jednak takie modele nie nadają się obecnie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych cząsteczek dostarczanych do glejaków ze względu na ograniczenia techniczne w następstwie dostawy14. Rzeczywiście trudno jest uchwycić fizjologiczną złożoność bariery krew-mózg w naczyniu, a możliwy brak niektórych receptorów/białek, o których wiadomo, że są wyrażane przez barierę krew-mózg, może zagrozić interpretacji wyników. Kolejny argument dotyczy dużej zmienności ekspresji genów między warunkami in vivo i in vitro, a także między liniami komórkowymi, zwłaszcza biorąc pod uwagę komórki śródbłonka. Można jednak również argumentować, że jednostka nerwowo-naczyniowa nie jest jednolitą jednostką w mózgu39. Badania naukowe w dziedzinie biologii osiągnęły erę humanitarną, w której dobrostan zwierząt, odpowiedzialność etyczna i koszt wykorzystania życia zwierząt są zawsze brane pod uwagę przed zaprojektowaniem eksperymentu. Dlatego, aby wesprzeć zastępowanie zwierząt, coraz więcej ostatnich badań pokazuje, że świadomość ograniczeń modeli i staranny dobór modeli komórkowych w celu ustanowienia bariery – z naciskiem na astrocyty – uzasadnia zgodność wyników uzyskanych w naczyniu i w modelach zwierzęcych40. Dzięki opisanej tutaj metodologii zbliżamy się o krok do zmniejszenia liczby zwierząt doświadczalnych wykorzystywanych do celów przesiewowych transcytozy BBB pod kątem potencjalnych środków terapeutycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Fińskich Organizacji Walki z Rakiem, Fundacji Jane i Aatos Erkko oraz Fundacji Sigrid Juselius (dla P.L. i V.L.J.), Swiss National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility grant no: P300PB_164732, dla S.K.), Fundacji Badawczej Orion (dla S.K.), Fundacji Pamięci Maud Kuistila (dla S.K.) oraz Akademii Fińskiej (TERVA 2017, Nr grantu: 314 498). Zakład Obrazowania Biomedicum (Helsinki) jest uznawany za dostawcę podstawowego wyposażenia w obrazowanie mikroskopowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cells
bEND3ATCCCRL-2299Hodowane w: DMEM (1g/L glukozy) uzupełnionym 10% FBS, 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny
Unieśmiertelnione astrocyty myszy HIFkowyizolowane w laboratorium dr Gabriele Bergershttps://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6Hodowane w: BME-1 uzupełnione 5% FBS, 5 ml 1 M HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 3 g D-glukozy i 5 ml penicyliny/streptomycyny
HuAR2TWyizolowane w laboratorium dr Dagmar Wirthhttps://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184Hodowane w: EBM-2 z SupplementMix
normalne ludzkie astrocyty pierwotneLonzaCC-2565Hodowane w: ABM z SingleQuots
Materiał i odczynniki
Półmisek 100 mm x17 mm, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350
10 ml pipeta serologicznaThermoFisher Scientific170361
15 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenuThermoFisher Scientific339650
ABM Basal Medium, 500 mlLonzaCC-3187Dla pierwotnych astrocytów ludzkich. ABM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. ABM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem rhEGF i FBS
Accutase Cell Detachment SolutionCorning25-058-CI
AGM SingleQuots Suplementy i czynniki wzrostuLonzaCC-4123
B27 suplementGibco17504-044zarówno dla GBM +, jak i - średni
Basal MediumEagle ThermoFisher Scientific21010046BME-1
Corning Costar Płytki 6-dołkowe z powłoką TCSigma-AldrichCLS3506
Corning Transwell Wkładki do hodowli komórek z membraną poliestrowąSigma-AldrichCLS3452 
D-glukozęSigma-AldrichG8270rozpuścić w 50 ml BME-1 i sterylnym filtrze przed dodaniem do pożywki
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 HamGibco21331-020Specyficzny dla hodowli kulek pochodzących od pacjenta wyizolowanych w naszym laboratorium, może się różnić dla innych linii komórkowych glejaka
Wzrost EBM-2 Medium SupplementMixPromoCellc-39216EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM-: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS
Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)PromoCellc-22211EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki PołudniowejThermoFisher Scientific10500056
Sól sodowa fluoresceinySigma-AldrichF6377
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytkiSigma-AldrichGreiner 655090czarne studzienki polistyrenowe płaskie dno (z mikroprzezroczystym dnem)
Menzel-Glä ser 0,9 cm okrągłe borokrzemianowe szkiełka nakrywkoweThermo Scientific10313573
tabletki PBSMedicago09-9400-100jedna tabletka na litr dH2O, następnie wysterylizować roztwór przez autoklawowanie
bromowodorku poli-D-lizynySigma-AldrichP6407 
Rekombinowany ludzki EGFPeprotechGMP100-15do podłoża GBM+
Rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18Bdo GBM+ średnio
immunofluorescencja
paraformaldehydowaSigma-Aldrich158127
24 mm x 60 mm szkiełko nasadkowe do mikroskopuORSAtec0224601-D
AlexaFluor 488 i 594 przeciwciała drugorzędoweThermoFisher Naukowerozcieńczenie: 1/500
Przeciwciało anty-Claudin-5Abcamab15106rozcieńczenie: 1/150
Klon przeciwciała anty-GFAP GF5Abcamab10062rozcieńczenie: 1/150
Anti-Mouse CD31  przeciwciało Klon MEC 13,3BD Biosciences550274rozcieńczenie 1/800
Przeciwciało anty-SV40 Anty-SV40AbcamAb16879Rozcieńczenie: 1/150
Anti-Zonula Occludens-1Abcamab96587Rozcieńczenie: 1/200
DAPITOCRIS5748
Fluoromount Wodne podłoże montażowe Sigma-AldrichF4680
LysoTracker Red DND-99ThermoFisher ScientificL7528
Animal procedures
10 cm zakrzywione nożyczki preparacyjneWorld Precision Instruments14394
BD Microlance 25 GEckton Dickinson300600
Cienkie kleszcze (12,5 cm)World Precision Instruments503283do dysocjacji tkanek
Intramedic Rurki polietylenowe PE20Becton Dickinson427406
Ketaminol vet 50 mg / mlIntervetVNR511485zasilana z sieci ketaminy
World Precision Instruments503599
Menzel-Glä ser 0,5 cm okrągłe borokrzemianowe szkiełka nakrywkoweThermo Scientific11888372
Zacisk Micro BulldogWorld Precision Instruments14119
Fizjologiczny roztwór solifizjologicznej MustelaSterylne fiolki jednodawkowe 20 x 5 ml / 40 x 5 ml - klasa
Kleszcze Rochester-OschnerWorld Precision Instruments501709
Rompun weterynarz 20 mg/mlIntervetVNR148999ksylazyny
World Precision Instruments502063
Sugi Sponge PointsKettenbach31603
Equipment
Axio Zoom.V16 fluorescencyjny stereofoniczny mikroskop zmiennoogniskowy Carl Zeiss
FLUOstar OmegaBMG Labtech
ORCA-Flash 4.0 cyfrowa kamera sCMOSHamamatsu Photonics
Universal 320 Kot Hettich. Nr 1401
ZEISS LSM 880 z mikroskopem konfokalnym AiryscanCarl Zeiss
Anty-T Mikrowiertarka wyrobów medycznych Adapter stereotaktyczny Czytnik mikropłytek Wirówka stołowa

Bibliografia

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors. Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).
  3. Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
  4. Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
  5. Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
  6. Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225(2016).
  7. Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
  8. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
  11. Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
  12. Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083(2017).
  13. Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
  16. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  17. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  18. Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
  19. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
  20. Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
  21. Levin, V. A. Personalized medicine in neuro-oncology. CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).
  22. Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
  23. O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
  24. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
  25. Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017(2017).
  26. Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
  27. Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
  28. Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
  29. Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
  30. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability--the essentials. Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).
  31. Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
  32. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).
  33. Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423(2017).
  34. Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
  35. Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
  36. Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
  37. Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119(2012).
  38. Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545(2016).
  39. Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12(2018).
  40. Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostarczanie nanocz steczekmodel in vitrokom rki r db onkakokultura astrocyt wsferoidy glejaka wielopostaciowegoobrazowanie konfokalnekwantyfikacja fluorescencjifluoresceina sodowatranscytoza leku
Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.