Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59385

⸱

25 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Streszczenie

Ubikwitynacja to potranslacyjna modyfikacja, która odgrywa ważną rolę w różnych szlakach sygnałowych i jest szczególnie zaangażowana w koordynację funkcji chromatyny i procesów związanych z DNA. Modyfikacja ta obejmuje sekwencyjne działanie kilku enzymów, w tym E1 aktywującego ubikwitynę, E2 sprzężonego z ubikwityną i ligazy ubikwityny E3 i jest odwracana przez deubikwitynazy (DUB). Ubikwitynacja indukuje degradację białek lub zmianę funkcji białek, w tym modulację aktywności enzymatycznej, interakcję białko-białko i lokalizację subkomórkową. Kluczowym krokiem w wykazaniu ubikwitynacji lub deubikwitynacji białek jest przeprowadzenie reakcji in vitro z oczyszczonymi składnikami. Na skuteczne reakcje ubikwitynacji i deubikwitynacji mogą mieć duży wpływ różne zastosowane składniki, kofaktory enzymów, warunki buforowe i charakter substratu. Tutaj przedstawiamy protokoły krok po kroku dotyczące przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji. Ilustrujemy te reakcje za pomocą minimalnych składników mysiego kompleksu represyjnego Polycomb 1 (PRC1), BMI1 i RING1B, ligazy ubikwityny E3, która monoubikwitynuje histon H2A na lizynie 119. Deubikwitynacja nukleozymalnego H2A jest przeprowadzana przy użyciu minimalnego kompleksu deubikwitynazy represyjnej Polycomb (PR-DUB) utworzonego przez ludzką deubikwitynazę BAP1 i domenę ADaptor DEUBikwitinazy (DEUBAD) jej kofaktora ASXL2. Te testy ubikwitynacji/deubikwitynacji można przeprowadzić w kontekście rekombinowanych nukleosomów odtworzonych za pomocą białek oczyszczonych przez bakterie lub natywnych nukleosomów oczyszczonych z komórek ssaków. Zwracamy uwagę na zawiłości, które mogą mieć znaczący wpływ na te reakcje i proponujemy, aby ogólne zasady tych protokołów można było szybko dostosować do innych ligaz ubikwityny E3 i deubikwitynaz.

Wprowadzenie

Ubikwitynacja jest jedną z najbardziej konserwatywnych modyfikacji potranslacyjnych i ma kluczowe znaczenie dla szerokiej gamy organizmów, w tym drożdży, roślin i kręgowców. Ubikwitynacja polega na kowalencyjnym przyłączeniu ubikwityny, wysoce konserwatywnego polipeptydu składającego się z 76 aminokwasów, do docelowych białek i zachodzi w trzech sekwencyjnych etapach obejmujących trzy enzymy, tj. Aktywację E1, koniugację E2 i ligazę E31,2,3. Ta modyfikacja potranslacyjna odgrywa kluczową rolę w szerokim spektrum procesów biologicznych. Rzeczywiście, ligazy E3, które zapewniają specyficzność reakcji, stanowią dużą nadrodzinę enzymów i są najliczniejszymi enzymami układu ubikwityny4,5,6. Dalsze skutki ubikwitynacji białek zależą od charakteru modyfikacji: monoubikwitynacja, multiubikwitynacja oraz poliubikwitynacja liniowa lub rozgałęziona. Monoubikwitynacja rzadko wiąże się z degradacją proteasomalną, ale zamiast tego ta modyfikacja bierze udział w pośredniczeniu w różnych zdarzeniach sygnalizacyjnych. Poliubikwitynacja obejmuje N-koniec lub reszty lizyny w samej cząsteczce ubikwityny, a los białka poliubikwitynowanego zależy od tego, która reszta jest zaangażowana w wydłużenie łańcucha ubikwityny. Od dawna wiadomo, że poliubikwitynacja, w której pośredniczy lizyna 48 ubikwityny, indukuje degradację proteasomalną. Wręcz przeciwnie, poliubikwitynacja ubikwityny za pośrednictwem lizyny 63 jest często związana z aktywacją białek7,8,9. Podobnie jak w przypadku innych ważnych modyfikacji potranslacyjnych, ubikwitynacja jest odwracalna, a usuwanie ubikwityny z białek jest zapewnione przez specyficzne proteazy zwane deubikwitynazami (DUB), które stały się ważnymi regulatorami procesów komórkowych2,10. Co ważne, wiele DUB jest wysoce wyspecjalizowanych i reguluje, poprzez deubikwitynację, określone substraty, co wskazuje, że delikatna równowaga między ubikwitynacją a deubikwitynacją ma kluczowe znaczenie dla funkcji białek. E3s i DUB, wraz z maszynerią degradacji proteasomu i czynnikami dodatkowymi, tworzą system proteasomu ubikwityny (UPS, z >1200 genami), który reguluje główne szlaki sygnałowe, z których kilka jest związanych ze wzrostem i proliferacją komórek, określaniem losu komórki, różnicowaniem, migracją komórek i śmiercią komórki. Co ważne, deregulacja kilku kaskad sygnalizacyjnych obejmujących ubikwitynację sprzyja nowotworzeniu i chorobom neurodegeneracyjnym5,11,12,13,14.

Ubikwitynacja odgrywa dominującą rolę w biologii chromatyny i procesach zależnych od DNA15,16,17. Na przykład monoubikwitynacja histonu H2A na lizynie 119 (dalej H2A K119ub) jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną zaangażowaną w represję transkrypcyjną i naprawę DNA18,19,20,21,22. H2A K119ub jest katalizowany przez kompleks represyjny Polycomb 1 (PRC1), który odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu informacji epigenetycznej i jest wysoce konserwatywny od Drosophila do człowieka. Kanoniczny PRC1 składa się w szczególności z RING1B i BMI1, które są rdzeniem kompleksu ligazy ubikwityny E3 odpowiedzialnym za wyżej wymienione zdarzenie ubikwitynacji22,23. U Drosophila monoubikwitynacja H2A (H2A K118ub, która odpowiada H2A K119ub u ssaków) jest odwracana przez DUB Calypso, który oddziałuje z Additional Sex Comb (ASX), tworząc kompleks Polycomb-represive DUB (PR-DUB) class24. Ortologia calypso u ssaków, BAP1, jest supresorem guza delecytowanym lub inaktywowanym w różnych nowotworach złośliwych u ludzi25,26,27,28,29,30,31,32,33. BAP1 reguluje procesy zależne od DNA w jądrze i apoptozę za pośrednictwem sygnalizacji wapniowej w retikulum endoplazmatycznym33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42. BAP1 składa wielopodjednostkowe kompleksy białkowe zawierające regulatory transkrypcji, w szczególności ASXL1, ASXL2 i ASXL3 (ASXLs), trzy ortologie klasy ASX38,43. ASXL używają domeny DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), nazywanej również domeną ASXM, do stymulowania aktywności BAP1 DUB35,36,44. W związku z tym ASXL odgrywają ważną rolę w koordynowaniu aktywności BAP1 DUB w chromatynie, a szerzej w jej funkcji supresorowej

guza.

Istnieje kilka metod badania procesów ubikwitynacji i deubikwitynacji. Warto zauważyć, że testy biochemiczne wykorzystujące białka oczyszczone z bakterii pozostają bardzo skuteczne w wykazywaniu bezpośredniej ubikwitynacji lub usuwania ubikwityny z określonych substratów. Eksperymenty te można przeprowadzić w celu zbadania szeregu parametrów, takich jak określenie wymagania dotyczących minimalnych kompleksów, określenie kinetyki reakcji, zdefiniowanie relacji struktura/funkcja oraz zrozumienie wpływu patologicznych mutacji genów. W tym miejscu udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji na substratach chromatyny z oczyszczonymi składnikami. Jako układ modelowy przedstawiono ubikwitynację i deubikwitynację in vitro nukleosomalnego białka H2A. Oczyszczone przez bakterie białka złożone w minimalne kompleksy RING1B/BMI1 i BAP1/DEUBAD są wykorzystywane odpowiednio do ubikwitynacji lub deubikwitynacji nukleosomalnej H2A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oczyszczanie powinowactwa GSH-agarozy kompleksu ligazy ubikwityny GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3

  1. Użyj konstruktu ekspresji bakterii pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa), aby przekształcić bakterie BL21 (DE3) (patrz Tabela materiałów)23. Ta konstrukcja umożliwia ekspresję mysiej domeny RING1B 1-159 połączonej z domeną BMI1 1-109 ze znacznikiem GST w szkielecie pGEX-6P-2.
  2. Przeprowadzić nocną hodowlę starterową, zaszczepiając bakterie RIL wykazujące ekspresję GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) w 20 ml pożywki bulionowej LB w obecności 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować przez wytrząsanie w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia dodać kulturę starterową do kolby o pojemności 1 litra zawierającej 500 ml świeżej pożywki bulionowej LB (rozcieńczenie 1:26) z ampicyliną i inkubować kulturę w shakerze w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny.
  3. W czasie inkubacji zmierzyć średnicę zewnętrzną przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Gdy kultura bakterii osiągnie 0,6 jednostki OD przy 600 nm, należy pobrać 1 ml podwielokrotności w probówce o pojemności 1,5 ml jako próbkę nieindukowaną. Dodać 400 μM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do 1 l kultury w celu wywołania ekspresji białka. Inkubować bakterie w temperaturze 25 °C przez 6 godzin do nocy.
    1. Odwirować 1 ml podwielokrotności przy 14 000 x g przez 30 s, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do próbek Laemmli i zachować do analizy indukcji białek SDS-PAGE i Coomassie blue.
  4. Przenieść indukowaną kulturę bakterii z kolby do czystej butelki wirowej i odwirowywać w temperaturze 3 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 ml zimnego PBS i wirować w temperaturze 3 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego etapu. Jeśli białka są indukowane o oczekiwanej masie cząsteczkowej, przejdź do następnego kroku.
  6. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 25 ml lodowatego buforu do lizy A (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0,5 mM DTT i 1/100 koktajlu antyproteazy zawierającego AEBSF, aprotyninę, bestatynę, E-64, leupeptynę i pepstatynę A). Upewnij się, że wszystkie osady bakterii są ponownie zawieszone. PMSF i koktajl antyproteazowy muszą być świeżo dodane do buforu do lizy, tylko w czasie lizy bakterii.
    ostrożność: Próbkę należy zawsze przechowywać na lodzie.
    nuta: Można dodać lizozym w stężeniu 100 μg/ml w celu zwiększenia lizy bakterii.
  7. Inkubować lizat bakterii na lodzie przez 15 minut. Użyć sonikatora sondowego i sonikować przy 70% amplitudzie wyjściowej przez 30 s (4-5x), a następnie wirować przy 21 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    ostrożność: Podczas sonikacji próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
  8. W czasie wirowania weź 500 μl zapakowanych kulek GSH-agarozy (50% zawiesiny) do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 10 ml buforu A bez PMSF i antyproteaz. Krótko wymieszać i wirować z prędkością 2 500 g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, powtórzyć ten krok prania jeszcze dwa razy i trzymać kulki na lodzie.
  9. Po odwirowaniu lizatu bakteryjnego zebrać supernatant i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Weź podwielokrotność 100 μl jako całkowity lizat i dodaj 100 μl 2x buforu próbki Laemmli do analizy SDS-PAGE i Coomassie blue.
  10. Przefiltruj lizat przez filtr strzykawkowy z porami 0,45 μm i wymieszaj go z kulkami GSH. Inkubować w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem przez 5 godzin. Wirować kulki o masie 2 500 x g przez 3 minuty, wyjąć i zachować supernatant podczas przepływu. Przemyj kulki związane z białkami GSH 6 razy (po 5 ml każdy) buforem A zawierającym koktajl antyproteazy i PMSF.
  11. Po ostatnim przepłukaniu przenieść kulki wraz z 10 ml buforu do pustej kolumny chromatograficznej, dodać 1,5 ml buforu A zawierającego 25 mM glutationu i zebrać grawitacyjnie elucję do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć procedurę elucji 4 razy.
    nuta: Roztwór podstawowy glutationu przygotowuje się w stężeniu 200 mM w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Pobrać podwielokrotność 10 μl z każdej z 4 elucji i dodać 10 μl 2x buforu do próbek Laemmli. Próbki te zostaną wykorzystane do analizy SDS-PAGE i Coomassie blue w celu określenia obecności i czystości oczyszczonych białek.
    nuta: Po ostatniej elucji przechowuj kulki w buforze w temperaturze 4 °C do recyklingu i wykorzystania w przyszłości.
  13. Do dalszej analizy należy wybrać eluowane frakcje wykazujące rozsądne ilości oczyszczonych białek. Zrób małe porcje preparatu. Oczyszczone białka należy przechowywać w temperaturze -80°C. Zazwyczaj stężenie białka wynosi od 0,5 μg do 2 μg na μl i w tym stanie można przechowywać próbki.
  14. OPCJONALNIE: Zagęścić próbkę lub zmienić bufor za pomocą filtra odśrodkowego 10K

2. Oczyszczanie kompleksu deubikwitynazy BAP1/DEUBAD (ASXL2)

  1. Użyj konstruktów ekspresji bakteryjnej pET30a+-His-BAP138 i pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 do transformacji bakterii BL21 (DE3) RIL do produkcji odpowiednio His-BAP1 i MBP-DEUBAD.
  2. Przeprowadzić dwie oddzielne nocne kultury starterowe, inkubując bakterie eksprymujące His-BAP1 i MBP-DEUBAD (ASXL2) w 20 ml bulionu LB pożywki ampicyliny zawierającej 50 μg/ml chloramfenikolu i odpowiedni antybiotyk dla każdego plazmidu, odpowiednio 100 μg/ml kanamycyny lub 100 μg/ml ampicyliny. Umieścić na shakerze w temperaturze 37°C.
  3. Wykonaj kroki 1.3–1.6.
  4. Ponownie zawiesić granulki bakterii w 25 ml lodowatego buforu do lizy B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-merkaptoetanolu, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF i 1/100 koktajl antyproteazy). Wymieszać równe objętości His-BAP1 z lizatami MBP-DEUBAD i inkubować na lodzie przez 15 minut. Sonikować, a następnie odwirować lizat, jak wskazano w protokole 1 (krok 9).
    1. Podczas wirowania należy przygotować 500 μl zapakowanych kulek agarozy Ni-NTA (50% zawiesiny), przemywając je trzykrotnie buforem B bez PMSF i koktajlem antyproteazy.
  5. Po odwirowaniu lizatu bakteryjnego zebrać supernatant i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Weź podwielokrotność 100 μl jako całkowity lizat i dodaj 100 μl 2x buforu próbki Laemmli do analizy SDS-PAGE i Coomassie blue.
  6. Przefiltruj lizat przez filtr strzykawkowy o porach 0,45 μm i wymieszaj go z kulkami Ni-NTA. Inkubować w temperaturze 4°C z wytrząsaniem przez 5 godzin. Wirować kulki o masie 2 500 x g przez 3 minuty, wyjąć i zachować supernatant podczas przepływu.
    1. Przemyć kulki 6 razy (po 5 ml każdy) buforem B zawierającym 20 mM 1,3-diaza-2,4-cyklopentadienu (imidazolu).
      UWAGA: Przygotować roztwór podstawowy 2 M imidazolu o pH 7,3.
  7. Po ostatnim przemyciu przenieść kulki z 10 ml buforu do pustej kolumny chromatograficznej, dodać 1 ml buforu B zawierającego 200 mM imidazol i zebrać grawitacyjną elucję do 1,5 ml mikroprobówek zawierających 10 μl DTT (500 mM) i 2 μL EDTA (500 mM, pH: 8). Powtórzyć procedurę elucji 4 razy. Pobrać 10 μl każdej frakcji elucyjnej i dodać 10 μl 2x buforu próbki Laemmli do analizy SDS-PAGE i Coomassie blue. Zbierz żądane eluowane frakcje.
    nuta: Przechowuj kulki w buforze w temperaturze 4 °C do recyklingu i wykorzystania w przyszłości.
  8. Rozcieńczyć eluowany kompleks 3 razy buforem C (50 mM Tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF i koktajl inhibitorów proteazy 1/100) przed inkubacją z kulkami agarozy amylozy.
    1. Przygotuj kulki agarozy amylozy (zapakowane w 500 μl), myjąc je 2 razy buforem C bez dodawania PMSF i koktajlu antyproteazy. Dodać kulki do rozcieńczonej elucji i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Wirować przy 2 500 x g przez 3 minuty i utrzymać przepływ. Umyj kulki związane z białkami 5 ml buforu C (5-6x).
  10. Oczyszczony kompleks His-BAP1/MBP-DEUBAD należy przechowywać na kulkach agarozy amylozy w buforze D (50 mM HEPES pH 8,0, 50 mM NaCl, 10% glicerolu i 1 mM DTT) i przechowywać w temperaturze -80 °C. Weź 20 μl frakcji kulek (50% roztwór kulek) i dodaj 20 μl 2x buforu próbki Laemmli do analizy SDS-PAGE i Coomassie blue.

3. Oczyszczanie nukleosomów z komórek HEK293T

  1. Hodowla HEK293T komórek w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 5% surowicą nowonarodzonych cieląt (NBS), 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny.
  2. Płytka około 12 x 106 HEK293T komórek w 20 ml kompletnej pożywki na 15 cm szalki hodowlanej na dzień przed transfekcją (użyto 10 szalek). Przed transfekcją zmień pożywkę komórki na 12 ml pożywki wolnej od surowicy i transfekuj komórki 21 μg pCDNA-Flag-H2A przy użyciu 63 μl polietyleniminy (PEI) w stężeniu 1 mg/ml36. Zmień na kompletne podłoże 12 godzin później.
  3. Trzy dni po transfekcji przemyj komórki 15 ml lodowatego PBS (dwukrotnie) i zbierz je w 3 ml lodowatego PBS za pomocą skrobaka do komórek. Wirować przy 2 100 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić PBS i przejść do etapu lizy lub zamrozić osad komórkowy w temperaturze -80 °C.
  4. Zawiesić osad komórkowy w około 10 objętościach buforu E (50 mM Tris-HCl pH 7,3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteazy 1/100 i 20 mM N-metylomaleimidu (NEM)) i inkubować na lodzie przez 20 minut. Dodanie N-metylomaleimidu (NEM) ma kluczowe znaczenie dla zahamowania DUB, które oczyszczają się z nukleosomami.
  5. Po odwirowaniu przy 3.000 x g przez 5 min, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad chromatyny w 10 objętościach buforu E. Wymieszać przez inwersję i odwirować przy 3.000 x g przez 5 min.
    1. Powtórz etap płukania jeszcze raz, używając buforu E i dwa razy używając buforu F "Bufor MNazy" (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,3 M sacharozy, 0,1% NP-40, 1 mM PMSF i koktajl inhibitorów proteazy 1/100).
      UWAGA: Pellet będzie unosił się na wodzie podczas mycia i wirowania.
  6. Ponownie zawiesić chromatynę w 5 ml buforu F i potraktować osad nukleazą mikrokokkową (MNazą) (3 U/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej).
    nuta: Reakcję można wspomóc mieszaniem za pomocą homogenizatora Dounce.
  7. Po inkubacji pobrać 40 μl podwielokrotności mieszaniny do analizy nukleosomalnych fragmentów DNA. Wymieszaj tę porcję z 40 μl fenolu/chloroformu i 20 μl 6-krotnego buforu ładującego DNA, wiruj, wiruj przy 18 000 x g przez 2 minuty i załaduj DNA na 2% żel agarozowy.
    1. Gdy DNA składa się głównie z fragmentu o długości 147 pz odpowiadającego mononukleosomom, należy zatrzymać reakcję, dodając 5 mM EDTA w końcowym stężeniu.
  8. Po odwirowaniu w temperaturze 21 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C, inkubować rozpuszczalną frakcję chromatyny z żywicą antyflagową przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć kulki 6x buforem G (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, koktajl inhibitorów proteazy 1/100).
  9. Przenieść kulki z 5 ml buforu G do pustej kolumny chromatograficznej. Eluować nukleosomy związane z kulkami za pomocą 200 μg/ml peptydu elucyjnego Flag. Użyć buforu elucyjnego składającego się z buforu G zawierającego 200 μg/ml peptydów elucyjnych Flag (patrz tabela materiałów) i 1/5 (obj. obj.) 1 M Tris, pH 8,0. Eluować nukleosomy 3x za pomocą 260 μl buforu elucji flagowej (2 godziny każdej elucji).
  10. Przetestuj 3 elucje, pobierając podwielokrotność do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i załaduj DNA w 2% żelu agarozowym. Weź 10 μl każdej frakcji elucyjnej i dodaj 10 μl buforu próbki Laemmli 2x do analizy SDS-PAGE i błękitu Coomassie i załaduj każdą elucję do wykrywania ubikwitynowanego H2A w Western Blot. Przechowywać elucję w temperaturze -80 °C. Ogólnie rzecz biorąc, oczyszczanie z komórek ludzkich daje mniejszą ilość białek niż w przypadku bakterii, o stężeniach od 0,1 do 0,5 μg/μl.

4. Test ubikwitynacji nukleosomów przy użyciu kompleksu ligazy ubikwityny BMI1/RING1B E3

  1. Odwirować nukleosomy przez 10-kilobajtowe filtry odśrodkowe o porach 0,5 ml, aby zmienić substrat z buforu elucyjnego na bufor reakcyjny H (25 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl2 i 5 mM ATP). Alternatywnie do testu można użyć dostępnych na rynku nukleosomów.
    nuta: Zamiana roztworu zawiesiny substratu na bufor reakcyjny zapewnia powtarzalność i zapobiega potencjalnemu hamowaniu ligazy E3 przez związki obecne w mieszaninie elucyjnej Flag.
  2. Inkubować 1 μg nukleosomów w 40 μl całkowitej objętości buforu H. Dodać enzym aktywujący Ub (UBE1) (250 ng), Ub (50 ng/μL) i enzymy sprzężone E2 Ub (672 ng) oraz 1 μg kompleksu ligazy ubikwityny BMI1/RING1B E3. Inkubować reakcję przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu wstrząsając.
    nuta: Równolegle można przeprowadzić kilka kontroli, w tym pomijanie E1, E2, E3, ATP i ubikwityny. Zapewnia to specyficzność dla reakcji ubikwitynacji.
  3. Zatrzymaj reakcję, dodając 40 μl 2x buforu do próbek Laemmli i przeanalizuj ubikwitynację histonu H2A K119 za pomocą SDS-PAGE i western blot, zgodnie ze standardowymi procedurami. Należy stosować przeciwciała anty-H2A lub anty-H2A K119ub (patrz tabela materiałów).

5. Test nukleosomalny H2A DUB in vitro z użyciem BAP1/DEUBAD

  1. Użyj oczyszczonych nukleosomów do testu deubikwitynacji in vitro. Ponownie zawiesić 100–500 ng nukleosomów w 40 μl buforu I (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 1 mM MgCl2, 50 mM NaCl i 1 mM DTT). Dodać 1 μg oczyszczonego z bakterii BAP1 His-BAP1 i MBP-DEUBAD. Przeprowadzać reakcję deubikwitynacji przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu wstrząsając.
  2. Zatrzymać reakcję in vitro, dodając 40 μl 2x buforu Laemmli i przeanalizować za pomocą immunoblottingu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Białka GST-BMI1 i RING1B są dobrze produkowane w bakteriach i mogą być łatwo ekstrahowane w frakcji rozpuszczalnej. Rysunek 1A przedstawia barwienie błękitem Coomassie dla typowego oczyszczania kompleksu GST-BMI1-RING1B. Prążki GST-BMI1 i RING1B migrują przy oczekiwanej masie cząsteczkowej, odpowiednio ~45 kDa i ~13 kDa. Co istotne, kompleks ligazy E3 jest wysoce homogenny, z bardzo niskim poziomem zanieczyszczeń białkami bakteryjnymi i/lub produktów degradac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kilka zalet ustanowienia solidnych testów ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro dla białek będących przedmiotem zainteresowania. Testy te mogą być wykorzystywane do: (i) ustalenia optymalnych warunków i określenia minimalnego zapotrzebowania na te reakcje, (ii) określenia enzymatycznych stałych kinetycznych i biochemicznych, (iii) zdefiniowania ról kofaktorów lub inhibitorów, które mogą wpływać na te reakcje, (iv) identyfikacji interfejsów interakcji, (v) zbadania wpływu sztucznych lub związanych z chorobą mu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Dianie Adjaoud za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) i Genome Canada (2016-2019) dla E.B.A. E.B.A. jest starszym pracownikiem naukowym Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M i N.S.K. są stypendystami doktorantów FRQ-S. H.B była stypendystką doktorską Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego oraz Tunezyjskiego Instytutu Badań Naukowych i Fundacji Cole'a.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki agarozy amylowejNew England Biolabs#E8021
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml 10KSigma-Aldrich#UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub)Technologia sygnalizacji komórkowej#8240
Koraliki agarozowe Anti-Flag-Sigma-Aldrich#A4596
Koktajl przeciw proteazieSigma-Aldrich
BL21 (DE3) Bakterie CodonPlus-RILAgilent technologies#230240
DMEM Bisent#319-005-CL
Pusta kolumna chromatograficznaBiorad#731-1550
Peptyd flagowySigma-Aldrich#F3290
GSH-koraliki agarozoweSigma-Aldrich#G4510
HEK293TATCC#CRL-3216
ImidazolSigma-Aldrich#I5513
Nukleaza mikrokokkowa (MNaza)Sigma-Aldrich#N3755
Koraliki agarozowe Ni-NTAThermoFisher Scientific#88221
N-metylomaleimid (NEM)Bioshop#ETM222
Filtr strzykawkowy z porami 0,45 i mu; mSarstedt#83.1826
Polietylenina (PEI)Polysciences Inc#23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109)Addgene#63139
Enzym aktywujący UB (UBE1)Boston Biochem#E-305
UBCH5C (UBE2D3)Boston Biochem#E2-627
#P8340

Bibliografia

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385(2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ubikwitynacjianaliza deubikwitynacjiligaza E3 ubikwitynykompleks deubikwitynazyoczyszczanie bia ekWestern blottinghistona H2ABMI1 RING1BBAP1 DEUBAD
Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.