Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II

Podsumowanie

Profilowanie proteomiczne białek azotowanych tyrozyną było trudną techniką ze względu na niską obfitość modyfikacji 3-nitrotyrozyny. W tym miejscu opisano nowatorskie podejście do wzbogacania i profilowania nitropeptydów przy użyciu angiotensyny II jako modelu. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne systemy in vitro lub in vivo.

Streszczenie

Nitrowanie białek jest jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) reszt tyrozyny i może być indukowane przez chemiczne działanie reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNS) w komórkach eukariotycznych. Precyzyjna identyfikacja miejsc nitrowania białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologicznych i patologicznych procesów związanych z nitrowaniem białek, takich jak stany zapalne, starzenie się i nowotwory. Ze względu na to, że białka nitrowane występują w niskiej liczebności w komórkach nawet w warunkach indukowanych, nie opracowano uniwersalnych i skutecznych metod profilowania i identyfikacji miejsc nitrowania białek. Tutaj opisujemy protokół wzbogacania nitropeptydów za pomocą reakcji redukcji chemicznej i znakowania biotyną, a następnie spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. W naszej metodzie pochodne nitropeptydów mogą być identyfikowane z dużą dokładnością. Nasza metoda wykazuje dwie zalety w porównaniu z poprzednio opisywanymi metodami. Po pierwsze, znakowanie dimetylu służy do blokowania pierwszorzędowej aminy na nitropeptydach, które można wykorzystać do generowania wyników ilościowych. Po drugie, do wzbogacania stosuje się wiązanie dwusiarczkowe zawierające odczynnik NHS-biotyna, który można dodatkowo zredukować i zalkilować w celu wzmocnienia sygnału wykrywania na spektrometrze masowym. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do modelowego peptydu Angiotensyny II w niniejszej pracy.

Wprowadzenie

Nitrowanie reszt tyrozyny w białkach do postaci 3-nitrotyrozyny reguluje wiele procesów biologicznych. Ze względu na różne właściwości chemiczne między tyrozyną a 3-nitrotyrozyną, białko nitrowane może mieć zaburzoną aktywność sygnalizacyjną^1,2. Dlatego ważne jest, aby opracować metody, które mogą skutecznie wzbogacać i identyfikować miejsca nitracji białek. Ponieważ 3-nitrotyrozyna jest modyfikacją białek o niskiej obfitości w porównaniu z innymi formami PTM, takimi jak fosforylacja i acetylacja, trudno jest zidentyfikować endogenne miejsca nitrowania bezpośrednio z linii komórkowych lub próbek tkanek. Niemniej jednak opracowano metodologię wykorzystania spektrometrii mas (MS) do scharakteryzowania wzorca fragmentacji nitrotpeptydu (na przykład Zhan & Desiderio³), co stanowi podstawę dla nowych metod nitroproteomiki.

Obecnie, etap wzbogacania, po którym następuje MS, jest najpotężniejszą strategią profilowania nitropeptydów^4,5. Metody wzbogacania można podzielić na dwie klasy. Jedna klasa opiera się na przeciwciałach, które mogą rozpoznawać specyficznie 3-nitrotyrozynę, podczas gdy druga klasa opiera się na pochodnym chemicznym, które redukuje grupę nitrową do grupy aminowej ^4,5. W przypadku metody opartej na przeciwciałach do wzbogacania stosuje się kolumnę powinowactwa nitrotyrozyny, z której eluowany materiał jest dalej rozpuszczany i analizowany za pomocą wysokiej rozdzielczości MS^6,7. W przypadku metody opartej na wyprowadzeniu chemicznym grupy aminowe na N-końcu peptydu lub lizyny powinny być blokowane w pierwszym etapie za pomocą odczynników acetylacji, znaczników izobarycznych do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (iTRAQ) lub znaczników masy tandemowej (TMT). Następnie stosuje się reduktor w celu redukcji nitrotyrozyny do aminotyrozyny, a następnie modyfikuje się nowo utworzoną grupę aminową, która obejmuje ligację biotyny, konwersję peptydu sulfidrylowego lub inne rodzaje systemów znakowania^8,9,10,11. Większość ustalonych do tej pory protokołów opiera się na białkach nadmiernie nitrowanych in vitro, a nie na białkach nitrowanych endogennie.

W obecnym badaniu, zmodyfikowana procedura chemicznego wyprowadzania nitrotyrozyny jest rozwijana do wzbogacania i identyfikacji nitropeptydu, która wykazuje zwiększoną czułość podczas wykrywania SM i jest odpowiednia do celów kwantyfikacji. Nasze ostatnie badanie z zastosowaniem tej metody w systemach biologicznych wykazało, że nitrowanie specyficznej dla limfocytów białkowej kinazy tyrozynowej (LCK) w Tyr394 przez RNS wytwarzane z komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC) odgrywa ważną rolę w immunosupresji mikrośrodowiska nowotworu¹². Dlatego nasza metoda identyfikacji nitropeptydów może być stosowana również do złożonych próbek biologicznych. Tutaj opisujemy nasz protokół, używając modelowego peptydu angiotensyny II, którego wzór fragmentacji jest znany i szeroko stosowany w badaniach nitroproteomicznych^8,9,10,11, jako przykład.

Protokół

1. Nitrowanie angiotensyny II

1. Aby wytworzyć peptyd nitrowany, należy rozcieńczyć 10 μl roztworu macierzystego angiotensyny II (DRVYIHPF) (2 mM w wodzie) w 390 μl roztworu PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4) przy końcowym stężeniu 50 μM.
2. Dodać 10 μl nadtlenoazotynu (200 mM w 4,7% NaOH) do roztworu angiotensyny II, aby uzyskać końcowe stężenie nadtlenoazotynu 5 mM.
   UWAGA: Nadtlenoazotyn jest niestabilny i łatwo się rozpuszcza, gdy występuje w postaci kwasu, więc roztwór macierzysty nadtlenoazotynu jest przechowywany w roztworze zasadowym i przechowywany w temperaturze -80 °C.
3. Dostosować wartość pH roztworu do 7-8 na 1 M HCl. Aby rozpocząć reakcję nitracji, należy wstrząsnąć probówką z prędkością 400 obr./min przez 5 minut.
4. Do odsalania należy użyć dostępnej w handlu kolumny SPE z odwróconą fazą (patrz tabela materiałów).
   1. Przygotuj 2 roztwory do odsalania, 5% metanolu w wodzie do mycia i 80% metanolu w wodzie do elucji.
   2. Dodać 500 μl metanolu, a następnie 500 μl wody, aby wstępnie przygotować kolumnę, umieścić 1 ml pipetora końcówką na górze kolumny, nacisnąć pipetor, aby przyspieszyć przepływ.
   3. Załadować 410 μl próbki w kroku 1.3 do kolumny, odrzucić przepływ.
   4. Po umyciu 500 μl 5% metanolu, użyj 300 μl 80% metanolu do wymycia nitropeptydu, który jest następnie całkowicie suszony przez speed-vac w domyślnym ustawieniu w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Odsalanie jest bardzo ważne dla reakcji, ponieważ rozpuszczalnik pozostawiony w poprzednim etapie może mieć negatywny wpływ na kolejne kroki.

2. Alkilowanie amin pierwszorzędowych przez znakowanie dimetylu

1. Rozpuścić sproszkowaną nitro-angiotensynę II w 100 μl 100 mM roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB).
   UWAGA: Wartość pH roztworu powinna wynosić od 7 do 9 i upewnić się, że do roztworu nie dodano żadnej pierwszorzędowej aminy.
2. Dodać 4 μl 4% formaldehydu do roztworu, krótko wymieszać.
   UWAGA: Opary formaldehydu są toksyczne; Eksperymenty należy wykonywać w dygestorium.
3. Dodać 4 μl 0,6 M NaBH₃CN do roztworu, wstrząsać probówką z prędkością 400 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Ugasić reakcję znakowania, dodając 16 μl 1% roztworu amoniaku, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
5. Dodać 8 μl kwasu mrówkowego w celu zakwaszenia roztworu i przeprowadzić odsalanie za pomocą kolumny SPE z odwróconymi fazami, jak opisano w kroku 1.4.

3. Redukcja nitrotyrozyny do aminotyrozyny

1. Nitro-angiotensynę II znakowaną dimetylem należy rozpuścić w 500 μl PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4).
2. Dodać 10 μl 1 M ditionianu sodu do roztworu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po reakcji redukcji żółty kolor roztworu staje się przezroczysty.
   UWAGA: Odważyć 174,1 mg ditionianu sodu i rozpuść go w wodzie, aby uzyskać końcową objętość 1 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C nie dłużej niż tydzień.
3. Do odsalania należy użyć kolumny SPE z odwróconą fazą, jak opisano w kroku 1.4.

4. Biotynylacja, wzbogacanie i wykrywanie

1. Rozpuść znakowaną dimetylo aminoangiotensynę II w 500 μl PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4).
2. Dodać 5 μl 40 nM NHS-S-S-biotyny, rozpuszczonej w DMSO, do roztworu, po 2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej użyć 1 μl 5% hydroksyloaminy do wygaszenia reakcji.
3. W międzyczasie należy zrównoważyć kulki agarozy streptawidyny, dodając 500 μl PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4), odwirowując przy 580 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucając supernatant. Wykonaj równoważenie 3 razy.
4. Dodać 100 μl kulek agarozy streptawidyny do układu reakcyjnego, inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej. Przemyć 4 razy PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4). Na każdym etapie płukania dodać 500 μl PBS do kulek, dobrze wymieszać, a następnie odwirować przy 580 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
5. Użyć 400 μl 10 mM ditiotreitolu (DTT) do inkubacji z kulkami agarozy w temperaturze 50 °C przez 45 min, odwirować w dół przy 580 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i wyrzucić kulki, dodać 20 μl 0,5 M idoacetamidu (IAM) do supernatantu na 20 minut w ciemności.
   UWAGA: DTT służy do zerwania wiązania dwusiarczkowego między wiązaniem biotyny a peptydem, ten ostatni jest uwalniany z kulek i dalej alkilowany przez IAM.
6. Użyj kolumny SPE z odwróconą fazą do odsalania pokazanego w kroku 1.4.
7. Po rozpuszczeniu suchych peptydów w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego (FA), produkt każdej sekcji poddać chromatografii cieczowej z analizą tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).
   1. Oddzielić zmodyfikowane peptydy Ang II przez 60-minutową elucję gradientową (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) przy natężeniu przepływu 0,300 μl / min z systemem nano-HPLC, który jest bezpośrednio połączony ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości.
      UWAGA: Kolumna analityczna ma średnicę wewnętrzną 75 μm, długość 150 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% kwasu mrówkowego, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.
   2. Uruchom spektrometr masowy w trybie akwizycji zależnej od danych, ustaw pojedyncze widmo masowe pełnego skanowania (300-1800 m/z, rozdzielczość 60 000), a następnie 20 zależnych od danych skanów MS/MS przy 28% znormalizowanej energii zderzenia.
   3. Otwórz dane widm mas i zidentyfikuj piki produktu na każdym etapie, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie przeprowadzona.

5. Kwantyfikacja nitropeptydu

1. Przygotować 3 zestawy roztworów nitro-angiotensyny II z kroku 1.4, każdy zestaw zawierający 2 stężenia nitro-angiotensyny II: zestaw #1, 20 nmol w probówce A i 20 nmol w probówce B, każdy w 100 μl roztworu TEAB; Zestaw #2, 10 nmol w probówce C i 20 nmol w probówce D, każdy w 100 μl roztworu TEAB; Zestaw #3, 40 nmol w probówce E i 10 nmol w probówce F, każdy w 100 μl roztworu TEAB.
   Uwaga: Dwa stężenia nitro-angiotensyny II w każdym zestawie są używane do znakowania dimetylu, aby reagować odpowiednio z formaldehydem (lekkim) i formaldehydem-D2 (ciężkim).
2. Do każdego zestawu dodaj 4 μl 4% formaldehydu i formaldehydu-D2 do próbki, która ma być oznaczona odpowiednio jako lekka i ciężka. Wykonaj kroki od 2.3 do 2.5, aby zakończyć etykietowanie dimetylu.
3. Wymieszaj lekkie i ciężkie oznakowane próbki.
4. Postępuj zgodnie z krokami od 3.1 do 4.6 dla redukcji, biotynylacji, wzbogacania i wykrywania.

Wyniki

Schemat profilowania nitropeptydów w tym manuskrypcie jest pokazany w Rysunek 1. Rysunek 2, 3, 4 i 5 pokazują widma masowe odpowiednio Angiotensyny II, nitro-Angiotensyny II, nitro-Angiotensyny II znakowanej dimetylem i amino Angiotensyny II znakowanej dimetylem. Masa cząsteczkowa związku może być odzwierciedlona przez wartości m/z piku monoizotopu na każdym rysunku, co wskazuje, że modyfikacja chemiczna angiote...

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje wzbogacanie i profilowanie nitropeptydów. Używając angiotensyny II jako peptydu modelowego, zilustrowaliśmy procedurę pokazaną na rycinie 1. Po uzyskaniu nitro-angiotensyny II, pierwszorzędowa amina na peptydzie powinna zostać zablokowana, aby uniknąć dalszej koniugacji amin, co jest jednym z najbardziej krytycznych kroków w protokole. W obecnym protokole znakowanie dimetylu jest stosowane do blokowania amin pierwszorzędowych z dwóch powodów: po pierwsze, umożliwia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolumna Acclaim pepmap 100 C18	Thermo-Fisher	164534
1 M roztwór TEAB	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroksyloaminy	Thermo-Fisher	90115
Acetonitryl	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775	Biologia molekularna
Klasa formaldehyd-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
kwas mrówkowy	Odczynnik Sigma-Aldrich	695076	ACS
Spektrometr masowy Fusion Lumos	Termo
izoacetamid	Sigma-Aldrich	I1149
Metanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB kolumna (10 mg)	Wody	186000383
nadtlenoazotyn	Merck-Millipore	516620
cyjanoborohydryt sodu	Sigma-Aldrich	42077	Ditionian
sodu	PhamaGrade Sigma-Aldrich	157953	klasa techniczna
Streptawidyna Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo