Artykuł metodologiczny

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

DOI:

10.3791/59394

⸱

19 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Physiology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 2Department of Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 3Department of Stem Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowalna, specyficzna tkankowo ekspresja jest ważnym i potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennej dynamiki perturbacji genetycznych. Łącząc elastyczny i wydajny system klonowania GreenGate ze sprawdzonym i przetestowanym systemem LhGR (tutaj określanym jako GR-LhG4) dla indukowalnej ekspresji, wygenerowaliśmy zestaw transgenicznych linii Arabidopsis, które mogą sterować ekspresją kasety efektorowej w szeregu określonych typów komórek w trzech głównych merystemach roślinnych. W tym celu wybraliśmy opracowany wcześniej system GR-LhG4 oparty na chimerycznym czynniku transkrypcyjnym i pokrewnym promotorze typu pOp, zapewniającym ścisłą kontrolę nad szerokim zakresem poziomów ekspresji. Ponadto, aby uwidocznić domenę ekspresji, w której aktywny jest syntetyczny czynnik transkrypcyjny, w liniach sterownika kodowany jest zlokalizowany przez ER fluorescencyjny reporter mTurquoise2 pod kontrolą promotora pOp4 lub pOp6. W tym miejscu opisujemy kroki niezbędne do wygenerowania linii sterującej lub efektorowej i pokazujemy, w jaki sposób można indukować i śledzić ekspresję specyficzną dla typu komórki w merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium Arabidopsis. Wykorzystując kilka lub wszystkie linie sterujące, można szybko ocenić kontekstowy efekt ekspresji jednego lub wielu czynników (efektorów) pod kontrolą syntetycznego promotora pOp, na przykład w zakładach F1 krzyżowania się jednego efektora i wielu linii sterownika. Przykładem tego podejścia jest ektopowa ekspresja VND7, czynnika transkrypcyjnego NAC zdolnego do indukowania ektopowego wtórnego odkładania się ściany komórkowej w sposób autonomiczny komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym ograniczeniem w biologii w erze postgenomicznej jest rozszyfrowanie specyficznej dla kontekstu roli danego czynnika lub perturbacji genetycznej. Konstytutywne zaburzenia genetyczne, takie jak podejście polegające na utracie funkcji i wzmocnieniu funkcji, często pozwalają jedynie na analizę punktów końcowych procesów adaptacyjnych trwających całe życie, zacierając różnicę między skutkami pierwotnymi i wtórnymi. Ponadto funkcje specyficzne dla kontekstu mogą być maskowane lub osłabiane przez efekty na dużą skalę w odległych tkankach lub podczas innych faz rozwoju. Co więcej, w skrajnych przypadkach śmiertelność może wykluczyć jakikolwiek mechanistyczny wgląd. Idealnie, aby obejść te problemy, można by przeanalizować wpływ ostrych zaburzeń genetycznych w określonym kontekście, takim jak określony typ komórki, w sposób rozwiązany w czasie. Aby to osiągnąć, potrzebne są narzędzia genetyczne do indukowalnej, specyficznej dla typu komórki ekspresji1. Aby zapewnić zasoby do szybkiej oceny czasoprzestrzennej dynamiki odpowiedzi na dany efektor, połączyliśmy łatwość klonowania zapewnianą przez system GreenGate2 z udowodnioną skutecznością systemu GR-LhG43,4,5,6. Wygenerowaliśmy zestaw linii wyrażających chimeryczny czynnik transkrypcyjny LhG4 połączony z domeną wiążącą ligand receptora kortykoidowego szczura (GR) 7 pod kontrolą dobrze scharakteryzowanych promotorów specyficznych dla typu komórki8. W stanie spoczynku czynnik transkrypcyjny pozostaje poza jądrem, ponieważ domena GR jest związana przez cytozolowy HSP90. Po dodaniu syntetycznego ligandu deksametazonu (Dex) indukowana jest translokacja jądrowa, a LhG4 będzie pośredniczyć w transkrypcji kaset ekspresyjnych pod kontrolą pokrewnego syntetycznego promotora typu pOp, takiego jak reporter mTurquoise2 zawarty w liniach sterownika w celu wizualizacji domeny ekspresji po indukcji. W związku z tym linie sterujące technicznie zawierają również kasetę efektorową. Skrzyżowanie zestawu linii sterujących z linią przenoszącą kasetę efektorową z, na przykład, genem będącym przedmiotem zainteresowania pod kontrolą tego samego promotora typu pOp, pozwala zatem na szybką ocenę ostrych lub długoterminowych konsekwencji ekspresji efektorowej w szerokim zakresie typów komórek.

Tutaj udostępniamy protokół opisujący procedury niezbędne do wygenerowania linii sterownika i efektora oraz pokazujemy, jak można indukować i śledzić ekspresję specyficzną dla typu komórki w merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium Arabidopsis. Aby zilustrować sprawność i specyfikę tego podejścia, wykorzystujemy dobrze znany czynnik transkrypcyjny VND7, który jest w stanie ektopowo napędzać wtórne pogrubienia ściany komórkowej podobne do ksylemu9. Traktowanie F1 z krzyżówki między klasą pSCR 10,< sup class="xref">11 linią sterownika a linią efektora pOp6:VND7 prowadzi do powstania ektopowych komórek podobnych do ksylemu w komórkach osłonki skrobiowej łodygi Arabidopsis.

Aby ułatwić generowanie dużych zespołów DNA wymaganych do budowy plazmidów ekspresyjnych sterowników i efektorów, użyliśmy szybkiej i efektywnej metody klonowania GreenGate2. Klonowanie GreenGate opiera się na enzymach restrykcyjnych typu II S, takich jak Eco31I lub jego izoschizomer BsaI2. Enzymy te przecinają kolejne miejsca rozpoznawania asymetrycznego, tworząc nawisy o różnym składzie zasadowym. Poprzez włączenie miejsc restrykcyjnych Eco31I/BsaI do oligonukleotydów i przypisanie określonych sekwencji zwisów do elementów DNA, uzyskuje się klonowanie modułowe, ułatwiając generowanie dużych zespołów. W ramach GreenGate moduły DNA należą do kategorii A-F w oparciu o sekwencję zwisów, które służą jako adaptery i są montowane w tej kolejności. W związku z tym podkłady zaprojektowane w celu wzmocnienia pożądanego produktu powinny być zgodne z wybranym modułem2 (Rysunek 1A). Jeśli istnieje wewnętrzna lokalizacja Eco31I/BsaI, a sekwencja nie jest kompatybilna z modułami wejściowymi i docelowymi GreenGate, można kontynuować bez mutagenizacji, ale z mniejszą wydajnością. Alternatywnie, użyj mutagenezy ukierunkowanej w celu usunięcia miejsc restrykcyjnych Eco31I/BsaI, uważając, aby nie zmieniać aminokwasów w produktach genowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory i moduły można pobrać z repozytorium non-profit, Addgene (https://www.addgene.org).

1. Klonowanie za pomocą GreenGate

  1. Zaprojektuj podkłady, korzystając z nawisów wymienionych w tabeli 1, zastępując "NNNN" sekwencjami adapterów specyficznymi dla typu modułu wymienionymi poniżej: Do przodu: 5'AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + sekwencja specyficzna 3', Odwrotność: 5'AACA GGTCTC A NNNN (n) + odwrotne uzupełnienie określonej sekwencji 3'. Dodaj podkreślone podstawy, aby zapewnić utrzymanie ramki do czytania.
    Zwisy modułów:
    UWAGA: W domyślnej strukturze GreenGate sześć modułów, od Ado F, jest połączonych ze szkieletem wektora transformacji roślin w jeden plazmid ekspresyjny ( Rysunek 1C). Zazwyczaj moduł A będzie zawierał sekwencje promotorowe, moduł B znacznik N-terminala lub sekwencję "fikcyjną"6, moduł C CDS, moduł D znacznik lub manekin C-terminal, moduł E terminator, a moduł F kasetę rezystancyjną do wyboru roślin transgenicznych. Adapter do łączenia z innymi wstępnie zmontowanymi jednostkami jest dostępny do użycia zamiast modułu F2.
  2. Amplifikacja PCR
    1. Wzmocnij interesującą sekwencję za pomocą zaprojektowanych starterów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie ze standardowymi protokołami.
    2. Oddziel produkt PCR od żelu agarozowego. Akcyza i kolumna oczyszczają właściwy fragment za pomocą zestawu handlowego (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Tworzenie modułu wejściowego
    1. Oddzielnie trawić wektor modułu i fragment PCR (krok 1.2.) (Rysunek 1 A, B) z Eco31I/BsaI przy użyciu 100-500 ng DNA (wektora lub fragmentu), 3 μL 10x buforu wytrawiającego i 5-10 U Eco31I w probówce i doprowadzić objętość do 30 μL za pomocą ddH2O.
    2. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwirować do 1 000 x g. Inkubować w temperaturze 37 °C na bloku grzewczym przez 15 minut (lub zgodnie z zaleceniami czasowymi zakupionego enzymu restrykcyjnego).
    3. Po mineralizacji w kolumnie należy oczyścić każdą próbkę za pomocą dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) i określić ilościowo otrzymane DNA, oznaczając gęstość optyczną przy 260 nm (OD260) za pomocą spektrofotometru.
    4. Wymieszać wytrawioną wkładkę o stężeniu 30 – 100 ng i wektor strawiony o stężeniu 10 – 50 ng, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować z 1 μl ligazy T4 (5 U/μl i 3 μl buforu do ligacji 10 x T4 w całkowitej objętości 30 μl w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (zgodnie z zaleceniem dostawcy ligazy T4) (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Oblicz pożądany stosunek molowy moduł wejściowy:wektor docelowy (np. 3:1) dla podwiązania w zależności od stężenia i długości wkładek modułu wejściowego.
    5. Aby zwiększyć wydajność przemiany, ciepło dezaktywuje ligazę T4 poprzez inkubację reakcji w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
    6. Użyj produktu do ligacji, aby przekształcić kompetentne komórki E. coli zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi i rozprowadzić bakterie na płytkach agarowych uzupełnionych ampicyliną (100 μg/ml)
    7. Inkubować płytkę z bakteriami w temperaturze 37 °C przez noc.
    8. Badanie przesiewowe kolonii z pożądanym modułem wejściowym przez PCR kolonii przy użyciu starterów 86A1 (5′-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′) i 86A2 (5′-GTTTTCCCAGTCACGACG-3′) oraz standardowych warunków PCR.
      UWAGA: Ta kombinacja starterów jest ważna dla wszystkich modułów wejściowych, ponieważ startery wiążą się ze szkieletem wektora wejściowego.
    9. Wybierz pojedyncze kolonie do izolacji plazmidu. Użyć 2 ml płynnej kultury LB uzupełnionej ampicyliną (100 μg/ml) i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 37 °C.
    10. Wyizoluj plazmidy z nocnej hodowli płynnej za pomocą zestawu Mini-Prep Kit lub żądanego protokołu ekstrakcji (patrz tabela materiałów).
    11. Aby zidentyfikować plazmidy z właściwą wkładką, przeprowadź analizę enzymów restrykcyjnych, na przykład wybierając dwa enzymy, które tną się unikalnie we wstawce, mieszając 200 ng plazmidu, 2 μL 10 x bufor trawienny, 5-10 U wybranych enzymów restrykcyjnych i ddH2O do 20 μL.
    12. Sekwencjonuj wybrane plazmidy za pomocą starterów 86A1 i 86A2 (patrz krok 1.3.9.).
  4. Tworzenie modułu docelowego:
    UWAGA: Jako plazmid docelowy użyj żądanego modułu docelowego pGGZ001, pGGZ002 lub pGGZ0032 (Rysunek 1C).
    1. W probówce dodać i wymieszać 50 – 150 ng pustego wektora docelowego (np. pGGZ003), 50-300 ng każdego napełnionego modułu wejściowego, 2 μl 10 x bufor buforowy wytrawiania, 1,5 μl 10 mM ATP, 1 μL Ligazy T4 (30 U/μL), 5-10 U μL Eco31I i dH2O do całkowitej objętości 20 μl.
      UWAGA: Oblicz żądany stosunek molowy moduł wejściowy:wektor docelowy (np. 3:1) dla podwiązania w zależności od stężenia i długości wkładek modułu wejściowego.
    2. Wymieszaj i przeprowadź reakcję GreenGate2 za pomocą termocyklera PCR, zmieniając 30 razy temperaturę 37 °C przez 5 minut i 16 °C przez 2 minuty, a następnie pojedyncze kroki 5 minut w temperaturze 50 °C i 5 minut w temperaturze 80 °C.
    3. Aby zwiększyć wydajność, dodać do reakcji 1 μl ligazy T4 (30 U/μL) i 1,5 μl 10 mM ATP i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inaktywować termicznie ligazę DNA T4 w temperaturze 65 °C przez 20 min.
    4. Wykorzystać reakcję ligacji do przekształcenia kompetentnych bakterii E. coli i rozprowadzić bakterie na płytkach agarowych uzupełnionych odpowiednim środkiem selektywnym spektynomycyną (50 μg/ml).
    5. Przekształcone bakterie E. coli inkubować na płytce w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Aby potwierdzić transformację, należy ponownie umieścić każdą z wybranych pojedynczych kolonii na płytkach zawierających spektynomycynę (50 μg/ml) i ampicylinę (100 μg/ml). Używaj tylko kolonii, które rosną na spektynomycynie, ale nie na płytkach ampicyliny.
    7. Inkubować kolonie E. coli przez noc w temperaturze 37 °C.
    8. Wybierz pojedyncze kolonie do izolacji plazmidu. Użyć 2 ml płynnej kultury LB uzupełnionej spektynomycyną (50 μg/ml) i inkubować przez noc w wytrząsarce o temperaturze 37 °C.
    9. Wyizoluj odpowiednie plazmidy za pomocą zestawu Mini-Prep Kit (patrz Tabela materiałów).
    10. Sprawdzić za pomocą analizy enzymów restrykcyjnych (patrz 1.3.12) i zsekwencjonować wybrane konstrukty dodatnie przy użyciu starterów 88C3 (5′-ACCTCTCGGCGGCTTCTGG-3′), 88C4 (5′-CCTTTTTACGGTTCCTG-3′). Jeśli wkładka nie może być w pełni zsekwencjonowana za pomocą tych starterów, należy zaprojektować wewnętrzne startery do sekwencjonowania.
      UWAGA: Aby zidentyfikować klony z prawidłową liczbą sekwencji powtórzeń pOp (patrz Dyskusja), startery pOp6 (pOp6_F, 5′-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3′; i pOp6_R, 5′-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3′), które wiążą się w krótkich sekwencjach flankujących, można użyć do amplifikacji PCR, a następnie elektroforezy żelowej w celu rozróżnienia według wielkości.
  5. Tworzenie supermodułu pośredniego
    1. Aby połączyć dwa niezależne zestawy modułów wejściowych, zgodnie z wymaganiami do generowania linii sterownika GR-LhG4 ze zintegrowaną kasetą reporter-efektor, najpierw zbuduj dwa pośrednie plazmidy, zwane supermodules2, zanim złożysz plazmid końcowego wyrażenia w pGGZ001 lub pGGZ003.
    2. Upewnij się, że dodałeś adapter F-H na końcu pierwszego supermodułu i adapter H-A na początku drugiego supermodułu (służą one jako połączenia między dwoma konstrukcjami) zgodnie z opisem2.
      UWAGA: Tylko moduł pośredni pGGN000 przenosi kasetę rezystancyjną. Aby wygenerować plazmid ekspresyjny, należy przeprowadzić reakcję GreenGate z wektorem docelowym oraz pośrednimi supermodułami pGGN000 i pGGM000. Alternatywnie, wymieszaj wektor docelowy, pośredni supermoduł pGGN000 i pozostałe pojedyncze moduły, aby wykonać GreenGate reaction2. Ta druga metoda jest mniej wydajna niż pierwsza, ale może być szybsza.
    3. Aby utworzyć supermoduł pGGM000/pGGN000, należy zmieszać 1,5 μl (100-300 ng/μL) każdego z modułów wejściowych z 1 μL (30 ng/μL) pustego wektora pośredniego (pGGM000 lub pGGN000), 2 μL 10 x bufor mineralizacyjny, 1,5 μL 10 mM ATP, 1 μL Ligazy T4 (30 U/μL), i 5-10 U Eco31I o łącznej objętości 20 μL.
      UWAGA: Oblicz pożądany stosunek molowy moduł wejściowy:wektor docelowy (np. 3:1) dla podwiązania w zależności od stężenia i długości wkładek modułu wejściowego
    4. Wymieszaj i przeprowadź reakcję GreenGate jak w kroku 1.4.2
    5. Aby zwiększyć wydajność, dodaj 1 μl ligazy T4 i 1,5 μl ATP (10 mM) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inaktywuj termicznie w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
    6. Użyj 10 μl reakcji ligacji, aby przekształcić kompetentną E. coli i smugi na płytkach zawierających kanamycynę (50 μg/ml).
    7. Przeprowadzić nocną inkubację przekształconej E. coli na płytce w temperaturze 37 °C.
    8. Ponownie narysuj każdą z wybranych pojedynczych kolonii na płytkach zawierających kanamycynę (50 μg/ml) i ampicylinę (100 μg/ml).
    9. Przeprowadzić nocną inkubację kolonii E. coli na płytce w temperaturze 37 °C.
    10. Wybierz pojedyncze kolonie, które rosną tylko na kanamycynie, ale nie na ampicylinie, do izolacji plazmidu. Użyć 2 ml płynnej kultury LB uzupełnionej kanamycyną (50 μg/ml) i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 37 °C.
    11. Wyizoluj odpowiednie plazmidy za pomocą mini-zestawu przygotowawczego (patrz Tabela materiałów).
    12. Sprawdzić plazmidy za pomocą analizy enzymów restrykcyjnych (patrz 1.3.12).i potwierdzić przez sekwencjonowanie przy użyciu starterów 87E2 (5'-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3') i 87E3 (5'-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3') wyżarzających do szkieletu pGGM000/pGGN000. Jeśli wkładka nie może być w pełni zsekwencjonowana za pomocą tych starterów, należy zaprojektować wewnętrzne startery do sekwencjonowania.
      UWAGA: Jeśli klonowanie do wektorów pGGM000 lub pGGN000 nie powiedzie się, jednym z możliwych rozwiązań jest strawienie pGGM000 lub pGGN000 za pomocą Eco31I, uruchomienie na żelu i oczyszczenie z żelu fragmentu szkieletu pGGM000 lub pGGN000 (około 2000 pz) bez kasety ccdB (około 1400 pz). Następnie postępuj normalnie z reakcją podwiązania.
  6. Przekształć szczep A. tumefaciens pSOUP+ (np. ASE), ponieważ początek replikacji pSa (ori A. tum.) w wektorach docelowych wymaga obecności plazmidu pomocniczego pSOUP12. Na płytkach LB należy usunąć bakterie zawierające chloramfenikol (34 μg/ml), kanamycynę (50 μg/ml), spektynomycynę (50 μg/ml) i tetracyklinę (12,5 μg/ml). Przekształcić A. tumefaciens inkubować na płytce w inkubatorze o temperaturze 28 °C przez dwa do trzech dni.

2. Generacja transgenicznych roślin Arabidopsis

  1. Przemiana rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana).
    UWAGA: Przekształć rośliny A. thaliana według Zhang et al., 200613.
  2. Selekcja linii transgenicznych.
    1. Aby wybrać przekształcone rośliny, użyj schematu wyboru użytego w GABI-Kat14 dla odporności na sulfadiazynę15.
    2. Aby wybrać stabilne linie z możliwym pojedynczym zdarzeniem integracji, należy wybrać te w generacji T2, które pokazują współczynnik segregacji 3:1 w znaczniku rezystancji. Propaguj te linie do pokolenia T3 i wybierz rośliny homozygotyczne pod względem genu odporności. Alternatywnie, wykonaj analizę Southern Blot lub standardową ilościową PCR w czasie rzeczywistym (SA-qPCR)16, aby wybrać pojedyncze linie insercji.

3. Indukcja transaktywacji w liniach napędowych Arabidopsis

  1. korzeń
    1. Aby przetestować ekspresję reporterową w liniach sterujących A. thaliana wygenerowanych w krokach 1 i 2, wysterylizuj nasiona zgodnie z poniższym opisem.
      1. Dodać 0,5-1,0 ml 70% etanolu + 0,01% niejonowego detergentu do około 100 nasion (20 mg) w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i kilkakrotnie odwrócić probówkę. Wirować z prędkością 1000 x g przez 15 s i zassać supernatant.
      2. Dodaj 0,5-1,0 ml absolutnego alkoholu etylowego. Odwróć probówkę kilka razy, odwiruj w dół przez 1 000 x g przez 15 s i wyrzuć supernatant.
      3. Dodać 0,5-1,0 ml absolutnego etanolu i kilkakrotnie odwrócić probówkę t, a następnie odwirować do 1000 x g przez 15 s i wyrzucić supernatant.
      4. Pozostaw nasiona do wyschnięcia wewnątrz kaptura. Jeśli nasiona mają być rozwarstwione w probówkach, przejdź do kroku 3.1.1.6.
      5. Dodaj 0,5-1,0 ml sterylnej wody i kilkakrotnie odwróć probówkę. Wirować z prędkością 1 000 x g przez 15 s i wyrzucić supernatant.
      6. Dodaj 0,5-1,0 ml sterylnej wody i kilkakrotnie odwróć probówkę. Wirować z prędkością 1 000 x g przez 15 s i wyrzucić supernatant.
      7. Dodaj 0,5-1,0 ml sterylnej wody.
    2. Przygotuj pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog, pH 5,8 i dodaj 0,9% agaru roślinnego i 1% sacharozy. Po autoklawowaniu dodać deksametazon (Dex), rozpuszczony w DMSO, do końcowego stężenia 10 - 30 μM odpowiednio do płytek indukcyjnych i równej ilości DMSO do płytek kontrolnych.
    3. Nasiona do obrazowania korzeni umieścić na płytkach i rozwarstwiać je przez 48 godzin w ciemności i zimnie (4 °C).
    4. Umieść płytki w pozycji pionowej w inkubatorze roślin (długi dzień (16/8 h), 22 °C, wilgotność, 65 %) i hoduj je przez pięć dni.
    5. Pięć dni po wykiełkowaniu (dag) zobrazuj sadzonki za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.
  2. łodyga
    1. Wysterylizować nasiona zgodnie z opisem w ppkt 2.1.1. i umieścić nasiona na płytkach 1/2 MS, 0,9% agarze roślinnym i 1 % sacharozy. Rozwarstwiać przez 48 godzin w ciemności i zimnie (4 °C).
    2. Sześć do siedmiu dni po wykiełkowaniu przenieś sadzonki do gleby, każdą roślinę w jednej doniczce (długi dzień (16/8 h), 22 °C, wilgotność, 65%).
    3. Wywołać trans-aktywację w łodygach przez podlewanie roztworem Dex lub roztworem makietowym lub przez zanurzenie roślin odpowiednio w roztworach Dex lub makietach.
    4. Do podlewania użyj roztworu 25 μM Dex w wodzie przygotowanej z zapasu 25 mM Dex rozpuszczonego w etanolu. Podlewaj co 2-3 dni, aż do pożądanego czasu indukcji.
    5. Do zanurzania przygotuj zlewkę o pojemności 1 l, 750 ml wody zawierającej 0,02% silwet L-77 z 25 μM Dex lub równoważną ilością DMSO odpowiednio do leczenia Dex i próby. Zanurz pojedyncze rośliny na 30 s w roztworze indukcyjnym lub próbnym. Powtarzaj co 2-3 dni, aż do pożądanego czasu obrazowania.
      UWAGA: Po zanurzeniu rośliny należy utrzymywać w wysokiej wilgotności przez godzinę.
  3. Strzelaj do merystemu wierzchołkowego (SAM)
    1. Sterylizować nasiona zgodnie z opisem w ppkt 2.1.1. Przygotuj płytki z 1/2 MS, 0,9 % agarem roślinnym i 1 % pożywką sacharozową i umieść nasiona na talerzach. Przechowuj płytki przez dwa dni w ciemności i zimie w celu rozwarstwienia.
    2. Umieść płytki w pozycji pionowej w inkubatorze roślin. Sześć do siedmiu dni po wykiełkowaniu przenieś sadzonki do gleby, każdą roślinę w jednej doniczce (długi dzień (16/8 h), 22 °C, wilgotność, 65
      3. %).
    3. Gdy łodyga osiągnie około 1 cm długości (25-30 dag), spryskaj kwiatostan SAM 10-50 μM Dex w H20 zakładając maskę na twarz. W celu indukcji i obrazowania w późniejszych stadiach rozwoju należy indukować SAM o dłuższych łodygach lub pędach bocznych.
      UWAGA: SAM można również wywołać za pomocą pędzla w roztworze Dex, aby zapobiec kropelkom rozpylonego sprayu. Używaj maski, gdy Dex jest nakładany przez natryskiwanie.
    4. 24-48 godzin po indukcji należy przeprowadzić sekcję SAM i przystąpić do obrazowania (patrz 4.3).
      UWAGA: Do rozmnażania użyto tylko roślin nieindukowanych, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wyciszenia genów. Do obrazowania wykorzystano rośliny w T2/T3.

4. Obrazowanie ekspresji reportera w liniach sterujących Arabidopsis.

  1. korzeń
    1. Przenieś sadzonki z płytki do roztworu jodku propidyny (PI) o stężeniu 10 μg/ml i przeciwbarwić je przez 5 minut.
    2. Umieść korzenie w komorze obrazowania mikroskopowego (1-dołkowa komora do hodowli tkankowej na szkle nakrywkowym II, patrz Tabela materiałów) i zobrazuj je za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem 63-krotnego zanurzenia w wodzie (patrz Tabela materiałów).
    3. Aby zobrazować fluorescencję PI, użyj długości fali wzbudzenia 488 nm i zbierz emisję między 590 a 660 nm. Do fluorescencji mTurquoise2 należy użyć wzbudzenia 458 nm i zebrać emisję między 460 a 615 nm.
  2. łodyga
    1. Wykonaj poziome, ręcznie wycięte odcinki łodyg roślin za pomocą żyletki, wycinając segment o długości około 3 cm. Przymocuj łodygę palcem po przeciwnej stronie żądanej sekcji do cięcia. Wykonaj sekwencyjnie kilka drobnych cięć, ale pamiętaj, że należy porównywać tylko sekcje z podobnej pozycji w trzpieniu.
    2. Po każdym cięciu zanurz żyletkę w szalce Petriego zawierającej wodę z kranu i zbierz części łodygi. Wybarwić skrawki w tym miejscu lub bezpośrednio zamontować na szkiełkach mikroskopowych.
    3. Do barwienia przygotuj 1 ml 250 μg/ml roztworu wody PI na małej szalce Petriego (patrz Tabela materiałów). Zanurz sekcje na 5 minut i opłucz je w wodzie. Przenieś je na szkiełka mikroskopowe za pomocą cienkich kleszczyków lub cienkiego pędzla. Należy uważać, aby nie ściskać próbek szkiełkiem nakrywkowym.
    4. Próbki obrazowe należy obrazować za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z soczewką zanurzaną w wodzie z 25-krotnym zanurzeniem (patrz tabela materiałów). Użyj światła laserowego o długości fali 561 nm, aby wzbudzić fluorescencję PI i zebrać od 570 do 620 nm. Użyj 405 nm do wzbudzenia efektora fluoroforowego mTurquoise2 kodowanego przez konstrukty linii sterującej i zbierz emisję od 425 do 475 nm.
  3. Strzelaj do merystema wierzchołkowego
    1. Odetnij łodygę 2 cm poniżej końcówki pędu za pomocą kleszczy. Trzymaj łodygę jedną ręką i użyj drobnych kleszczyków, aby usunąć pąki kwiatowe i duże zawiązki. W celu usunięcia młodych zawiązków, umieścić SAM w pozycji pionowej na szalce Petriego zawierającej 3 % agarozy. Użyj lornetki i kleszczy, aby usunąć młode zawiązki w pobliżu SAM. Alternatywnie należy użyć kaniuli iniekcyjnej (patrz tabela materiałów), aby odciąć te zawiązki.
    2. Wybarwić wypreparowany SAM w roztworze PI o stężeniu 250 μg/ml przez 5-10 minut. Barwienie należy przeprowadzić bezpośrednio, pipetując kilka kropel roztworu barwiącego na przygotowany roztwór barwnikowy lub przenieść próbkę do probówki wypełnionej roztworem barwiącym. Utrzymuj SAM całkowicie zanurzony podczas procedury barwienia.
    3. Umieścić poplamiony SAM na małej szalce Petriego (patrz Tabela Materiałów) z 3 % pożywką agarozową i przykryć SAM ddH2O.
    4. Obraz wypreparowanych SAM za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w 25-krotną soczewkę zanurzeniową w wodzie (patrz tabela materiałów).
    5. Użyj światła laserowego o długości fali 561 nm, aby wzbudzić fluorescencję PI i zebrać od 570 do 620 nm. Użyj 405 nm do wzbudzenia fluoroforu mTurquoise2 i zbierz emisję od 425 do 475 nm.
      Nagrywaj stosy obrazów o długości 50 μm w kierunku z krokiem 0,5 μm.
      UWAGA: Obrazowanie SAM, jak opisano tutaj, wymaga pionowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i soczewki (w tym przypadku soczewki zanurzającej w wodzie) o dużej odległości roboczej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie linii sterownika i efektora poprzez klonowanie GreenGate

System klonowania GreenGate jest oparty na klonowaniu GoldenGate i wykorzystuje endonukleazę restrykcyjną typu IIS BsaI lub jej izoschizomer Eco31I. Ponieważ enzym wytwarza zwisy odległe od asymetrycznego miejsca rozpoznawania, skład podstawowy nawisów można dowolnie wybierać, co stanowi podstawę modułowości systemu. Każdy element generowany przez PCR, na przykład sekwencja promotora, CDS lu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy kroki niezbędne do wygenerowania i zastosowania wszechstronnego i wszechstronnego zestawu narzędzi do indukowalnej, specyficznej dla typu komórki transaktywacji. Krzyżowanie się linii przenoszących kasety efektorowe pod kontrolą promotora pOp z liniami sterującymi pozwala na badanie efektów błędnej ekspresji w pokoleniu F1, umożliwiając szybką ocenę zaburzeń genetycznych w szerokim zakresie typów komórek. Alternatywnie, konstrukty efektorowe mogą być używane do przekształcania li...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w naszych laboratoriach jest wspierana przez granty Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) WO 1660/6-1 (dla S.W.) i GR 2104/4-1 (dla T.G.) i SFB1101 (dla T.G. i J.U.L) oraz przez grant konsolidacyjny Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (PLANTSTEMS 647148) dla T.G. S.W. jest wspierany przez stypendium Emmy Noether DFG poprzez Grant WO 1660/2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.1
ATPSigma-AldrichA9187
ChloramfenikolSigma-AldrichC1919
Oczyszczanie kolumny Zestaw do oczyszczaniaQiagenQIAquick PCR (250)
Komora hodowlana do obrazowaniaSarstedt AG & Co. KG1-dołkowa komora do hodowli tkankowej, na szkle nakrywkowym II
DesamethazonSigma-AldrichD4903
DMSOFisher Scientific, Wielka BrytaniaD139-1
Eco31IThermo Fisher ScientificFD0294
(0,30 x 12 mm, 30 G x 1/2)Sterican, Braun
KanamycinCarl Roth GmbH + Co. KGT832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda niebieski 63x zanurzenie w wodzie objectivLeica, Wetzlar, Niemcy
MS mediumDuchefa, Haarlem, HolandiaM0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA Obiektyw do zanurzenia w wodzieNikon, Minato, Tokio, Japonia
Szalka Petriego 35/10 mmGreiner Bio-One GmbH, Niemcy627102
szalka Petriego 60/150 mmGreiner Bio-One GmbH, Niemcy628102
szalka Petriego 120/120/17Greiner Bio-One GmbH, Niemcy688102
Agar roślinnyDuchefa, Haarlem, HolandiaP1001
Ekstrakcja plazmiduQiagenQIAprep Spin Miniprep Zestaw
jodku propidyny (PI)Sigma-AldrichP4170
RazorbladeClassic, Wilkinson Sword GmbH7005115E
Probówki reakcyjneSarstedt AG & Co. KG72.690.001
Silwet L-77Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Niemcy
SpectinomycinAppliChem GmbH3834.001
SpektrofotometrThermo Fisher ScientificNanoDrop 2000c
SacharozaCarl Roth GmbH + Co. KG4621.1
SulfadiazynaSigma-AldrichS6387
TetracyklinaAppliChem GmbH2228.0025
T4 Ligaza 5 U/&mikro; lThermo Fisher ScientificEL0011
T4 Ligaza 30 U/&mikro; lThermo Fisher ScientificEL0013
Kaniula iniekcyjna do przygotowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489(2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9(2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ekspresja indukowalnasystem LhGRklonowanie GreenGatemikroskopia konfokalnaindukcja deksametazonemmerystem wierzcho kowy p dumerystem wierzcho kowy korzeniaanaliza kambium

Powiązane artykuły