Artykuł metodologiczny

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

DOI:

10.3791/59408

⸱

5 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie chromatografii jonowymiennej o wysokiej specyficzności z wielokątowym rozpraszaniem światła do dokładnego wyznaczania masy molowej białek, kompleksów białkowych i peptydów w heterogenicznej próbce. Metoda ta jest cenna dla oceny jakości, a także dla scharakteryzowania natywnych oligomerów, wariantów ładunku i próbek białek mieszanych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatografia jonowymienna z wielokątowym rozpraszaniem światła (IEX-MALS) to skuteczna metoda separacji i charakterystyki białek. Połączenie techniki separacji o wysokiej specyficzności IEX z dokładną analizą masy molowej uzyskaną przez MALS pozwala na scharakteryzowanie niejednorodnych próbek białek, w tym mieszanin form oligomerycznych lub populacji białek, nawet o bardzo podobnych masach molowych. W związku z tym IEX-MALS zapewnia dodatkowy poziom charakterystyki białek i jest komplementarny ze standardową techniką chromatografii wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS).

Tutaj opisujemy protokół podstawowego eksperymentu IEX-MALS i demonstrujemy tę metodę na albuminie surowicy bydlęcej (BSA). IEX rozdziela BSA na jego formy oligomeryczne, umożliwiając analizę masy molowej każdej pojedynczej formy za pomocą MALS. Na BSA przedstawiono również i zademonstrowano optymalizację eksperymentu IEX-MALS, która pozwoliła uzyskać doskonałą separację między monomerami BSA a większymi oligomerami. IEX-MALS jest cenną techniką oceny jakości białka, ponieważ umożliwia zarówno dokładną separację, jak i określenie masy molowej wielu gatunków białek występujących w próbce.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa charakterystyka produktów białkowych jest coraz bardziej istotna jako środek kontroli jakości (QC), zarówno dla celów regulacyjnych w przemyśle biofarmaceutycznym, jak i dla zagwarantowania wiarygodności i integralności badań w dziedzinie nauk przyrodniczych1,2. Jak opisano na stronach internetowych sieci białkowych Partnerstwo na rzecz Produkcji i Oczyszczania Białek w Europie (P4EU) oraz Stowarzyszenie Zasobów Badań Biofizycznych w Europie i Biofizyki Molekularnej w Europie (ARBRE-MOBIEU) (odpowiednio https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs i https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control), kontrola jakości białka musi charakteryzować nie tylko czystość produktu końcowego, ale także jego stan oligomeryczny, jednorodność, tożsamość, konformację, struktura, modyfikacje potranslacyjne i inne właściwości3,4.

Jedną z najczęstszych metod charakteryzacji QC jest SEC-MALS. W tej metodzie analityczna kolumna SEC jest sprzężona z MALS oraz detektorami spektrofotometrycznymi i refraktometrycznymi, co umożliwia dokładne pomiary masy molowej białka każdego piku5. SEC-MALS określa masę molową eluowanych pików niezależnie od objętości elucji i przezwycięża niedokładność analitycznego SEC za pomocą kalibracji kolumnowej. Dodanie modułu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zwiększa możliwości pomiaru rozmiaru, umożliwiając określenie promienia hydrodynamicznego. W badaniach akademickich SEC-MALS jest zwykle używany do określania stanu oligomerycznego białka, jego konformacji, poziomu czystości, poziomu agregacji i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny lub rozpuszczalne w tłuszczach białka błonowe (określanie masy molowej białka i sprzęganie składników indywidualnie)6,7,8.

W wielu przypadkach końcowe białko procesu oczyszczania nie jest dobrze zdefiniowanym gatunkiem molekularnym, ale raczej zawiera pewną niejednorodność. Białka w takiej mieszaninie mogą być zróżnicowane pod względem budowy (na przykład różnych form oligomerycznych), konformacji lub izoform białek. Niejednorodność białek może być również wynikiem niewielkich różnic chemicznych spowodowanych C-końcowym przetwarzaniem lizyny lub deaminacją asparaginy/glutaminy, co prowadzi do zmienności ładunku9,10. Różnice w modyfikacjach potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, mogą również prowadzić do niejednorodnych próbek z różnicami ładunku9. Te różne rodzaje niejednorodności znajdują odzwierciedlenie w cechach biofizycznych białka i mogą wpływać na stabilność i aktywność biologiczną docelowego białka11.

Wiarygodne testy kontroli jakości takich niejednorodnych próbek wymagają wysoce precyzyjnej techniki analitycznego rozdzielania. Istnieją przypadki, w których osiągnięcie dobrej separacji za pomocą analitycznych kolumn SEC może być trudne ze względu na ich ograniczoną rozdzielczość i możliwości separacji12, co skutkuje wadliwą analizą SEC-MALS. Połączenie techniki separacji o wysokiej specyficzności, takiej jak IEX, z MALS może przezwyciężyć ograniczenia SEC-MALS w próbkach heterogenicznych i zapewnić komplementarną metodę charakterystyki białek (Tabela 1 w Amartely et al.12). W przeciwieństwie do SEC, który rozdziela makrocząsteczki według ich rozmiaru hydrodynamicznego13, IEX rozdziela makrocząsteczki według ich ładunku powierzchniowego14. Macierze wymiany anionowej (AIEX) i kationowymienności (CIEX) wiążą odpowiednio warianty naładowane ujemnie i dodatnio. Dzięki dokładnemu oddzieleniu między populacjami białek, które mają stosunkowo zbliżoną masę lub kształt, IEX-MALS z powodzeniem określa masę molową każdego pojedynczego stanu białka w próbce mieszaniny12.

Tutaj prezentujemy standardowy protokół przeprowadzania eksperymentu IEX-MALS w celu separacji i analizy oligomerycznych form BSA, które występują w tej samej próbce. Wybór kolumny IEX dla konkretnego białka jest ważny i omówiony, podobnie jak warunki pH i przewodności. Krok po kroku opisano również analizę danych doświadczalnych IEX-MALS. Chociaż separacja oligomerów BSA jest dobra i wystarczająca w SEC-MALS, BSA jest dobrym przykładem do pokazania możliwości IEX-MALS i zademonstrowania optymalizacji eksperymentu. Przykłady słabej separacji osiągniętej przez SEC-MALS oraz prawidłowej separacji i analizy możliwej przez IEX-MALS omówiono w poprzednim badaniu12.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie systemu

  1. Zainstalować system szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i detektory MALS/indeksu refrakcji (RI) (patrz tabela materiałów) wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania do sterowania, gromadzenia danych i analizy zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Podłącz detektory MALS i RI za detektorami UV i przewodności FPLC. Pomiń detektor pH, chyba że jest to absolutnie konieczne w przypadku gradientów pH, aby zminimalizować objętość między detektorami UV i MALS. Należy użyć rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0.25–0.5 mm (id) między kolumną a detektorami oraz rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0.75 mm na wyjściu detektora RI do kolektora odpadów lub frakcji.
  3. Upewnij się, że zostały ustanowione niezbędne połączenia sygnałowe między FPLC a detektorami, w tym wyjście analogowe UV z detektora FPLC do wejścia MALS Aux i wyjście cyfrowe z FPLC do MALS Autoinject In, za pośrednictwem skrzynki I/O.

2. Przygotowanie próbki i bufora

  1. Przefiltrować wszystkie odczynniki, w tym płuczące i elucyjne, za pomocą filtra 0,1 μm. Przefiltruj pierwsze 50–100 ml buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów, a pozostałą część buforu przechowuj w czystej, sterylnej butelce, która została dokładnie umyta przefiltrowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
  2. Dostosuj próbkę BSA do pH i siły jonowej (np. pH = 8, 50 mM NaCl), które umożliwiają wiązanie się z kolumną IEX podczas procedur rozcieńczania, ultrafiltracji lub wymiany buforu.
    UWAGA: Zaleca się wstępną filtrację próbki białka do najmniejszego rozmiaru porów, który nie usuwa interesującego materiału (0,02–0,1 μm). Alternatywnie próbkę można odwirować z dużą prędkością (13 000–16 000 x g) przez 10 minut, aby umożliwić wytrącanie dużych cząstek.
  3. Przygotować co najmniej 0,3–0,5 mg BSA (patrz Tabela Materiałów) do wstrzyknięcia w kolumnie o pojemności 1 ml (5/50 mm) w celu uzyskania dobrej jakości analizy MALS. Należy pamiętać, że objętość wstrzyknięcia jest nieograniczona.

3. Wybór i rozwój metody IEX dla białka

  1. Oblicz punkt izoelektryczny (pI) białka na podstawie sekwencji pierwszorzędowej, dla której można użyć serwerów, takich jak narzędzie Protparam na stronie internetowej ExPASy15. Należy zauważyć, że liczba pI BSA wynosi 5,8.
  2. Wybierz typ kolumny i parametry bufora.
    1. Należy stosować różne dla AIEX i CIEX, w zależności odpK a buforu i jonowego charakteru buforu. Używaj kationowych podczas uruchamiania kolumny AIEX i anionowych podczas uruchamiania kolumny CIEX z małymi przeciwjonami. W tym przykładzie należy użyć 20 mM buforu Tris-HCl o pH 8 do analizy BSA na kolumnie AIEX.
    2. W przypadku białka o pI niższym niż 7, takiego jak BSA, należy użyć kolumny AIEX i buforu o pH wyższym niż pI o co najmniej dwie jednostki. W przypadku białka o pI wyższym niż 7 należy użyć kolumny CIEX i buforu o pH niższym niż pI białka o co najmniej dwie jednostki.
    3. Zoptymalizuj pH buforu zgodnie z siłą wiązania między białkiem a matrycą kolumny. Jeśli białko nie wiąże się dobrze z kolumną, należy użyć pH dalszego od pI. Upewnij się, że białko jest stabilne przy zastosowanym pH.
    4. Użyć niskiego stężenia soli w wiązaniu i przepłukać, aby umożliwić wiązanie białka z matrycą, ponieważ wiązanie białka zależy od siły jonowej załadowanej próbki. Białka zwykle wymagają trochę soli ze względu na ich stabilność; dlatego należy użyć 50 mM NaCl (lub alternatywnej soli) podczas etapów ładowania białka i mycia kolumny.
    5. W przypadku buforu elucyjnego należy użyć maksymalnie 0,5 M NaCl w celu odłączenia białka od kolumny.
      UWAGA: Wyższe stężenia soli nie są zalecane podczas pracy ze standardowym refraktometrem RI ze względu na ograniczony zasięg przyrządu. Można jednak zastosować model o wysokim stężeniu, który pomieści 2 M NaCl.
  3. Wykonaj początkową metodę w następujący sposób.
    1. Załadować 1 mg BSA (170 μL z 6 mg/ml) w ~0,5 ml buforu ładującego 20 mM buforu Tris-HCl, pH 8, zawierającego 50 mM NaCl. Przemyć kolumnę tym samym buforem dla objętości 10–15 kolumny (CV), aby umożliwić całkowitą elucję niezwiązanych cząsteczek i cząstek z układu, aż do pełnej stabilizacji sygnałów rozpraszania światła (LS), UV i RI.
    2. Wykonać krótki, liniowy gradient soli 20–30 CV, używając buforu elucyjnego 20 mM Tris-HCl, pH 8, zawierającego 0,5 M NaCl w celu odłączenia białka od kolumny. Wykonać gradient 0%–100% (lub alternatywny gradient rozległy) buforu elucyjnego lub podzielić go na dwa gradienty: 0%–50% buforu elucyjnego, a następnie dodatkowy gradient 50%–100% buforu elucyjnego, każdy gradient dla 10–20 CV. W przypadku BSA należy zastosować szeroki gradient 15%–70% dla 30 CV dla metody początkowej.
      UWAGA: W niektórych przypadkach metoda początkowa może zapewnić separację w celu uzyskania wiarygodnej analizy MALS i dodatkowe przebiegi nie są konieczne. W wielu przypadkach początkowa metoda zawiera jedynie wskazówki dotyczące dalszej optymalizacji metody.
  4. Zoptymalizuj metodę IEX, aby zwiększyć rozdzielczość i poprawić separację pików poprzez zmianę różnych parametrów.
    1. Zmień nachylenie i długość gradientu. Krótkie nachylenia z dużymi nachyleniami zapewniają intensywne szczyty z mniejszą separacją, podczas gdy długie nachylenia z łagodnymi zboczami zapewniają niższe szczyty z lepszą separacją. Znajdź równowagę między szczytową rozdzielczością a intensywnością sygnału, aby uzyskać optymalną analizę MALS.
      UWAGA: Ładowanie większej ilości białka może zwiększyć sygnały LS, UV i RI, ale odbywa się to kosztem rozdzielczości.
    2. Do elucji należy użyć krokowego profilu stężenia soli. Pamiętaj, że powszechnie stosowana jest kombinacja kroków i gradientu liniowego.
    3. Zmniejsz natężenie przepływu, aby poprawić separację pików.
      UWAGA: W przypadku matryc z bardzo małymi cząstkami nie jest to bardzo istotne.
    4. Zmień pH buforu, aby zwiększyć zmienność ładunku między populacjami białek w próbce i poprawić separację między tymi wariantami. Należy pamiętać, że białka, które nie są prawidłowo oddzielone przy jednym pH, mogą być oddzielone przy innym pH.
    5. Użyj gradientu pH, liniowego lub krokowego, aby odłączyć białka od kolumny IEX. W razie potrzeby należy użyć gradientów elucji, które łączą zarówno zmiany pH, jak i stężenia soli.
    6. Użyj silniejszych soli, takich jak MgCl2, lub słabszych soli, takich jak octan sodu, aby zwiększyć czułość i rozdzielczość16.
    7. Użyj dłuższych kolumn IEX lub innej matrycy kolumnowej z mniejszymi cząstkami, aby poprawić możliwości separacji.
    8. Zmień typ kolumny (AIEX/CIEX), aby zapewnić inny wzór separacji. Należy pamiętać, że dostępne są również matryce z silnymi, słabymi lub połączonymi (w trybie mieszanym) ligandami, które mogą poprawić rozdzielczość niektórych próbek.
    9. Użyj kolumny od innego dostawcy z tym samym ligandem, który jest przyłączony do różnych żywic matrycowych. Sama żywica, niezależnie od liganda, może w różny sposób oddziaływać z białkami i wpływać na profil separacji.
    10. Uwzględnij dodatki (cząsteczki, które stabilizują białko w roztworze) do, aby poprawić stabilność białka i uniknąć agregacji białek, aby usprawnić eksperyment IEX.
      UWAGA: Przykładami takich dodatków są cukry, alkohole, mocznik, detergenty niejonowe lub obojdnio-jonowe oraz sole chaotropowe i kosmotropowe17,18.

4. Eksperyment IEX-MALS

  1. Otwórz New\Experiment from Method w oprogramowaniu MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemowych Light Scattering. Jeśli moduł DLS jest dostępny i dane DLS mają zostać pobrane, wybierz metodę online z podfolderu Light Scattering\With QELS.
  2. Ustaw parametry przebiegu w sekcji Konfiguracja.
    1. Ustaw natężenie przepływu biegu w sekcji Pompa ogólna na natężenie przepływu używane w FPLC (1.5 ml/min), a następnie wprowadź lub sprawdź parametry bufora w sekcji Rozpuszczalnik
      2. .
    2. Nazwę białka (BSA), przyrost indeksu refrakcji (dn/dc; wartość wzorcowa dla białek to 0,185 mL/g), współczynnik ekstynkcji UV przy długości fali 280 nm (0,66 g/L-1·cm-1) oraz stężenie próbki białka (6 mg/mL) należy wprowadzić w zakładce Próbka w sekcji Wtryskiwacz. W tej samej sekcji należy również umieścić objętość próbki do wstrzykiwań (170 μl).
    3. Na karcie Basic Collection, w sekcji Procedure, zaznacz pole wyboru Trigger on Autoinject i ustaw czas trwania przebiegu tak, aby zbieranie danych było kontynuowane przez co najmniej 5 minut po osiągnięciu przez nachylenie wartości końcowej.
  3. Ustaw parametry eksperymentu w oprogramowaniu FPLC.
    1. Utwórz nowy eksperyment na karcie Edytor metod. Początkowym eksperymentem będzie liniowy gradient soli lub pH (patrz krok 3.3). W przypadku metody zoptymalizowanej utwórz bardziej szczegółowy gradient lub program krokowy zgodnie z wynikami elucji podczas metody początkowej (patrz krok 3.4 i Rysunek 1). Dołącz sygnał impulsowy do metody, który uruchomi zbieranie danych w oprogramowaniu MALS.
    2. Przepłukać kolumnę i zawory odpowiednimi: 20 mM Tris-HCl, pH 8, z 50 mM NaCl dla buforu płuczącego (zawór A) i tym samym buforem z 500 mM NaCl dla buforu elucyjnego (zawór B). Upewnij się, że końcowe płukanie kolumny wykorzystuje bufor wiążący, zawierający niskie stężenie soli, aby umożliwić wiązanie białka z matrycą kolumny. W celu masowego przepłukania silnie związanych zanieczyszczeń należy użyć 0,5 M NaOH przed myciem odpowiednimi, a następnie przemyciem buforem neutralizującym.
    3. Umieścić próbkę białka w pętli za pomocą strzykawki. Jeśli załadowano więcej niż 10 ml próbki, należy użyć superpętli lub zaworu pompy przyrządu FPLC, omijając pompę filtrującą i mieszalnik FPLC.
  4. Rozpocznij eksperyment najpierw w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom, a następnie w oprogramowaniu FPLC. Dane będą zbierane po otrzymaniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.
  5. Zastosuj te same parametry przebiegu i instrukcje opisane w krokach 4.1–4.4, jeśli IEX-MALS jest wykonywany ręcznie w trybie ciągłego przepływu, a nie metodą autonomiczną.
  6. Po zweryfikowaniu i uruchomieniu końcowej metody należy wykonać dokładnie tę samą metodę, używając ślepej próby (ładowanie bufora zamiast próbki). Ważne jest, aby czas między impulsem automatycznego wstrzykiwania a gradientem ślepej próby był identyczny jak w przypadku serii próbki.

5. Analiza danych eksperymentalnych IEX-MALS

  1. Wykonaj analizę krok po kroku w sekcji Procedura w oprogramowaniu MALS. W widoku Kolekcja podstawowa jest wyświetlana kolekcja danych pierwotnych eksperymentu.
    1. Użyj zakładki Despiking, aby wygładzić chromatogramy, jeśli wykazują one dużo szumu. Zwykle używaj normalnego poziomu.
    2. Zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów (wszystkich detektorów LS, UV i RI) w widoku Linia bazowa.
    3. Zdefiniuj szczyty do analizy w widoku Szczyty. Sprawdź prawidłowe wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji UV dla białka pod każdym pikiem.
      UWAGA: W przypadku białek zwykle stosuje się standardową wartość przyrostu RI wynoszącą 0,185 ml / g, ale w przypadku innych makrocząsteczek należy stosować różne wartości dn / dc, w zależności od charakteru cząsteczki. Średnia dn/dc polinukleotydów (DNA/RNA) wynosi 0,17 ml/g19, podczas gdy sacharydy, takie jak sacharoza, mają średnią wartość dn/dc 0,145 ml/g20, a wartości dn/dc lipidów i detergentów wahają się między 0,1–0,16 mL/g21.
    4. Analizuj masę molową i promień za pomocą parametrów dopasowania i funkcji korelacji pod Masą molową i promieniem z LS i Rh z widoków QELS.
  2. Sygnał RI zmienia się znacznie podczas pracy IEX-MALS ze względu na wzrost stężenia soli. W związku z tym należy odjąć sygnał linii bazowej od ślepej próby w przypadku obliczeń masy, które wymagają danych RI.
    1. Otwórz zarówno eksperymenty białkowe, jak i ślepe próby IEX-MALS. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę eksperymentu białkowego, wybierz opcję Zastosuj metodę i wybierz folder Odejmowanie linii bazowej z okna dialogowego pliku. Wybierz odpowiedni typ metody (np. online) dla standardowej analizy masy molowej. Należy pamiętać, że parametry i ustawienia zdefiniowane dla eksperymentu białkowego zostaną zapisane w nowo otwartej metodzie.
    2. W widoku Odejmowanie linii bazowej kliknij przycisk Importuj puste miejsce, aby zaimportować sygnały pustego przebiegu. W obszarze Instrumenty (obok przycisku Importuj puste miejsce) zaznacz wszystkie detektory, które chcesz odjąć.
    3. W widoku Piki dostosuj wartości dn/dc (jeśli to konieczne) ze względu na przewodność roztworu w obszarze piku białka, ponieważ RI roztworu zmienia się podczas przebiegu12.
  3. Skalibruj system IEX-MALS za pomocą monomeru BSA.
    UWAGA: Zwykle system IEX-MALS jest okresowo kalibrowany pod kątem wyrównania pików, poszerzenia pasma i normalizacji detektorów kątowych do detektora 90° przy użyciu białka monodyspersyjnego o promieniu bezwładności (Rg) <10 nm, takiego jak monomer BSA. W tym przykładzie BSA służy zarówno jako cząsteczka kalibracyjna, jak i sama jest przedmiotem analizy masy molowej.
    1. Wyrównaj szczyty w widoku Procedury > Konfiguracja.
    2. Wykonaj normalizację w widoku Normalizacja, wprowadzając 3,0 nm jako wartość Rg.
    3. W obszarze Poszerzanie pasma na tej samej karcie Konfiguracja wybierz szczyt i dopasuj sygnały UV i LS do sygnału RI, używając przycisku Wykonaj dopasowanie.
  4. Wykres wyników jest wyświetlany w widoku Dopasowanie wyników. Zmień skale osi i inne parametry wykresu, klikając wykres prawym przyciskiem myszy, wybierając opcję Edytuj, a następnie klikając przycisk Zaawansowane. Wykres z większą liczbą opcji wyświetlania jest również dostępny w zakładce Wykres EASI: wybierz Masa molowa z menu rozwijanego Wyświetlanie w górnej części okna.
  5. Należy pamiętać, że wszystkie wyniki, w tym masa molowa, promień, poziom czystości i inne, są dostępne w widoku Raport (podsumowaniu lub szczegółowym) w sekcji Wyniki. Użyj przycisku Projektant raportów, aby dodać więcej wyników lub parametrów, a także liczb do raportu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BSA jest powszechnie używanym białkiem, które jest używane w chromatografii do kalibracji systemu eksperymentalnego22 i jest wysoce odpowiednie do praktykowania IEX-MALS, jak również SEC-MALS. Jest przede wszystkim monomeryczny o teoretycznej masie monomeru 66,7 kDa i zwykle zawiera niewielką liczbę dimerów i wyższych oligomerów23.

BSA zostało przeanalizowane na IEX-MALS przy użyciu kolumny analitycznej wymiany anionów (patrz Tabela materiałów). Szeroki gradient liniowy składający się z 30 CV od 75 mM do 350 mM NaCl oddzielił monomery BSA od wyższych oligomerów. Dalsza analiza MALS wykazała obliczoną masę molową monomeru wynoszącą 66,8 ± 0,7 kDa oraz obliczoną masę molową dimera wynoszącą 130 ± 5 kDa (rysunek 1A).

Na podstawie przewodności bufora na eluowanych pikach, gradient został zmieniony na inny program: długi krok 175 mM NaCl, po którym następuje gradient liniowy od 175 mM do 500 mM NaCl. Nowy gradient znacznie poprawił rozdzielczość i doskonałą separację między monomerem BSA (o obliczonej masie molowej 66,1 ± 0,7 kDa) a jego wyższymi gatunkami oligomerycznymi (o obliczonej średniej masie 132 ± 2 kDa) (rysunek 1B). Aby skupić się również na gatunkach o wysokiej oligomerii i obliczyć masy molowe każdej pojedynczej oligomerycznej formy BSA, zastosowano stopniowy program 200 mM i 250 mM NaCl. Eksperyment ten zaowocował doskonałą separacją między monomerem BSA (o obliczonej masie 62,4 ± 0,4 kDa), dimerem (o obliczonej masie 130 ± 10 kDa) i trimerem (o obliczonej masie 170 ± 10 kDa) (Rysunek 1C). Wszystkie eksperymenty IEX-MALS pokazują, że BSA eluuje głównie jako monomer o czystości 80%, zgodnie z wynikami SEC-MALS, gdzie monomery BSA eluują z czystością 85%12.

figure-results-1
Rysunek 1: Optymalizacja eksperymentu IEX-MALS dla BSA. (A) Eksperyment IEX-MALS BSA z programem gradientu 75–350 mM NaCl. (B) Eksperyment IEX-MALS BSA z programem kroku 175 mM NaCl, po którym następuje program gradientu liniowego 175–500 mM NaCl. (C) Eksperyment IEX-MALS BSA z programem krokowym 200 mM i 250 mM NaCl. Chromatogramy pokazują UV przy 280 nm (kolor niebieski), rozpraszanie światła pod kątem 90° (kolor czerwony) oraz krzywe współczynnika załamania światła (kolor różowy) i przewodność (kolor szary) wraz z masą molową każdego piku obliczoną za pomocą MALS (kolor). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IEX-MALS to potężna metoda separacji i charakterystyki białek, która umożliwia dokładne oznaczanie masy molowej czystych białek, a także próbek niejednorodnych, charakteryzując natywne oligomery, nienatywne agregaty, kowalencyjne i niekowalencyjne kompleksy oraz białka sprzężone. Program składający się z gradientu liniowego lub serii kroków koncentracji soli może osiągnąć dobrą separację populacji białek i umożliwić właściwą analizę każdego pojedynczego piku przez MALS. Dalsza optymalizacja poprzez zmianę różnych parametrów, takich jak nachylenie gradientu (patrz krok 3.4 protokołu), może być przeprowadzona, jeśli wymagana jest lepsza rozdzielczość. IEX-MALS może być cennym testem kontroli jakości białka, ponieważ zapewnia dodatkowy, krytyczny poziom charakterystyki białka, uzupełniający inne metody, takie jak SEC-MALS.

Chociaż SEC-MALS jest standardową i powszechną techniką oznaczania masy molowej białek, stosunkowo niska rozdzielczość standardowych analitycznych kolumn SEC może ograniczać dokładne pomiary masy molowej osiągane przez MALS12. Niektóre przykłady ograniczeń SEC-MALS obejmują roztwory zawierające kolejne oligomery, wysokie poziomy agregacji, które nie są w pełni oddzielone od piku monomeru, oraz niejednorodne populacje o podobnych masach molowych, takie jak zmodyfikowane białka.

IEX jest bardziej złożoną metodą chromatograficzną do zaprojektowania i przeprowadzenia niż SEC, ale informacje uzyskane z eksperymentu IEX-MALS mogą uzupełniać, a czasem być nawet bardziej pouczające niż analiza SEC-MALS. W ramach projektu IEX-MALS udało się scharakteryzować warianty przeciwciał, które mają tę samą masę molową, oligomery, które nie są całkowicie oddzielone na SEC, oraz krótkie peptydy, które są trudne do analizy przez SEC12,24. Również zespoły makromolekularne, które są zbyt duże, aby można je było rozdzielić za pomocą SEC, takie jak pełne (zawierające wirusowe DNA) i puste cząstki wirusa związanego z adenowirusem (AAV), mogą być rozwiązane przez IEX25 przed analizą MALS. W porównaniu z SEC, IEX oferuje bardziej zróżnicowane możliwości separacji14 i ma elastyczność w dostosowywaniu kilku parametrów w celu zwiększenia rozdzielczości szczytowej, takich jak pH buforu, rodzaje soli, rodzaje i długość kolumny i inne. W przeciwieństwie do SEC, nie ma ograniczeń objętościowych dla wstrzykiwania próbki w IEX, a każda cząsteczka może być analizowana niezależnie od jej wielkości (patrz Tabela 1 w Amartely i wsp.12). Jest to ogromna zaleta IEX-MALS, głównie w przypadku próbek o niskiej intensywności LS, takich jak bardzo małe białka lub rozcieńczone białka z tendencją do agregacji po zagęszczeniu. Ponieważ kolumny analityczne IEX są bardziej stabilne i mają tendencję do uwalniania mniejszej liczby cząstek niż kolumny SEC, IEX-MALS wymaga bardzo krótkiego czasu równowagi, a sygnały LS są stabilizowane bardzo szybko. Pozwala to na przeprowadzenie poszczególnych eksperymentów zgodnie z opisem w niniejszym protokole i zatrzymanie przebiegu w razie potrzeby.

W przeciwieństwie do SEC, który zwykle zapewnia dokładne wyniki za pomocą tylko jednego eksperymentu (przy użyciu kolumny o odpowiednim zakresie frakcjonowania), IEX może wymagać kilku eksperymentów w celu osiągnięcia optymalnej rozdzielczości poprzez dostrojenie parametrów metody. W eksperymentach IEX-MALS, które są wykonywane z gradientem soli, przewodność buforu, a co za tym idzie, RI dramatycznie zmienia się podczas przebiegu, co w konsekwencji prowadzi do zmian sygnału RI. Wymaga to przeprowadzenia dodatkowej ślepej próby dla każdego doświadczenia IEX-MALS oraz analizy z odejmowaniem linii podstawowej (zgodnie z opisem w kroku 5.2 protokołu), chyba że analiza stężenia ogranicza się do wykrywania promieniowania UV (co wymaga wiedzy a priori na temat współczynników ekstynkcji dla każdego piku). Analiza z odejmowaniem linii bazowej jest solidna dla gradientów liniowych, mimo że dalszy rozwój metody jest nadal wymagany do pomyślnego odejmowania linii bazowej w programach krokowych soli. Wartości dn/dc każdego piku należy dostosować do właściwej przewodności buforowej na eluowanym piku (obliczenia można znaleźć w literaturze12). Jeśli białko jest eluowane przy stężeniu NaCl niższym niż 200 mM (jak w przykładzie BSA), dostosowanie to jest nieistotne.

Stosunkowo duża ilość białka użytego w IEX-MALS (jak opisano w kroku 2.3 protokołu) w porównaniu z SEC-MALS jest ważna dla przezwyciężenia dramatycznej zmiany sygnału RI spowodowanej gradientem soli i wahaniami RI spowodowanymi niedoskonałym mieszaniem gradientu. Jeśli do pomiaru masy używana jest tylko detekcja UV, można użyć mniejszych ilości. Ilość białka do wstrzyknięcia zależy od masy molowej białka, jednorodności, czystości i współczynnika ekstynkcji UV. Niezbędna masa wstrzyknięta powinna być wyższa dla mniejszych białek i niższa dla większych białek (~1 mg dla białka 20 kDa i ~0,2 mg dla białka 150 kDa). Próbki niejednorodne wymagają wstrzyknięcia większej próbki, ponieważ ilość jest dzielona między kilka populacji. Analityczna wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może wymagać mniejszej ilości materiału niż system FPLC.

Ostatnio doniesiono o analizie in-line z wykorzystaniem MALS podczas procedur oczyszczania. Taka analiza w czasie rzeczywistym jest bardzo skuteczna w wykrywaniu produktów agregacji, które zachodzą podczas oczyszczania i może wyeliminować potrzebę dalszej analizy białka po oczyszczeniu26. Chromatografia IEX jest często stosowana jako pośredni etap oczyszczania; w związku z tym połączenie preparatywnych kolumn IEX z MALS może być przydatne nie tylko jako metoda charakterystyki analitycznej, ale także jako analiza w czasie rzeczywistym procedur oczyszczania na dużą skalę. Nieanalityczne kolumny IEX są również stabilne, o niskim stopniu uwalniania cząstek, dlatego mogą być używane z MALS. Inne techniki rozdzielania, takie jak chromatografia powinowactwa lub chromatografia z wymianą hydrofobową, mogą być również łączone z MALS po poddaniu ich stosunkowo czystym próbkom (w celu uniknięcia zanieczyszczenia detektorów MALS i RI). Będzie to wymagało adaptacji i optymalizacji metody w celu uzyskania nie tylko dobrej separacji pików, ale także wystarczająco czystych sygnałów LS i RI do udanej analizy MALS.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. jest pracownikiem firmy Wyatt Technology Corporation, której produkty są wykorzystywane w tym protokole. A.T. jest pracownikiem firmy Danyel Biotech, dystrybutora instrumentów Wyatt i ÄKTA.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Hebrew University) za jej rady i współpracę. Autorzy dziękują również firmie Danyel Biotech Ltd. (Rehovot, Izrael) za pomoc i ustanowienie analitycznego systemu FPLC-MALS wykorzystanego w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ä KTA pureGE Healthcare29-0182-26FPLC 
0,02 &mikro; m Filtr Anotop Whatman 10 mmGE Healthcare6809-1002Filtr próbek
0,1 i mikro; m Filtr Anotop Whatman 10 mmGE Healthcare6809-1012Filtr próbek
0,1 i mikro; m Filtr Anotop Whatman 25 mmGE Healthcare6809-2012Mobilny filtr fazowy
BSA (czystość >97%)Sigma A1900Albumina surowicy bydlęcej
miniDAWN TREOS Wyatt TechnologyWTREOSMALS
mono Q HR 5/50 GLGE Healthcare17-5166-01Kolumna analityczna z anionowymiennikiem
Optilab T-rEXWyatt TechnologyWTREXRefraktometr
0,1 mm PES 1000 mL StericupMilliporeSCVPU11RERuchomy filtr fazowy
Chlorek soduSigma 71382Klasa HPLC NaCl
TRISMA bazaSigma T-1503TRIS
Bufor

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585(2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180(2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907(2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Charakterystyka bia ekalbumina surowicy bydl cejwymiana anionowawymiana kationowaanaliza masy molowejwyznaczanie stanu oligomerycznegoodejmowanie linii bazowej

Powiązane artykuły