Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół perfuzji naczyniowej ex vivo matczyno-płodowej, który umożliwia podanie artykułu testowego do układu naczyniowego matki i ocenę transferu przez łożysko cząsteczek ksenobiotycznych lub środków farmakologicznych oprócz zmian w fizjologii łożyska.

Streszczenie

Łożysko jest kluczowym organem podczas ciąży, który służy jako bariera dla ekspozycji płodu na ksenobiotyki i pośredniczy w wymianie składników odżywczych na odpady. Opisano tutaj test perfuzji izolowanego łożyska szczura i oceny translokacji ksenobiotyków z matki na płód ex vivo. Ponadto za pomocą tej metodologii można przeprowadzić ocenę procesów fizjologicznych, takich jak przepływ płynu do płodu i metabolizm łożyska. Technika ta jest odpowiednia do oceny kinetyki kandydatów farmaceutycznych lub zanieczyszczeń środowiskowych od matki do płodu. W przeciwieństwie do obecnych alternatywnych podejść, metodologia ta pozwala na ocenę izolowanego układu naczyniowego matki i płodu, z usuniętym ogólnoustrojowym zajęciem neuronalnym lub immunologicznym, co pozwala na przypisanie wszelkich zaobserwowanych zmian w funkcjach fizjologicznych czynnikom lokalnym w izolowanej tkance.

Wprowadzenie

Zachowując strukturę morfologiczną i fizjologiczną reaktywność, perfuzja narządów stała się akceptowanym podejściem systemowym lub tkankowym do analizy funkcji metabolicznych. Te techniki perfuzji pozwalają na badanie ex vivo reakcji nienaruszonych tkanek na różne bodźce farmakologiczne i mechaniczne. Perfuzja ludzkiego łożyska została po raz pierwszy opisana w 1958 roku w celu zidentyfikowania wpływu hormonów na aktywność metaboliczną cyklu kwasu cytrynowego; Troen i Gordon dostrzegli potrzebę wyjaśnienia aktywności endokrynologicznej przy użyciu nowatorskiego podejścia fizjologicznego¹. W tej samej epoce strategie pojedynczej perfuzji (od matki do płodu lub od płodu do matki) zostały opisane w modelach zwierzęcych large^2,3 i small⁴, aby zrozumieć przenoszenie cukrów, soli i leków antypirynowych przez łożysko. Opisano techniki podwójnej perfuzji in vivo i ex vivo (skoordynowana perfuzja matki i płodu) w celu dokładniejszego scharakteryzowania transferu łożyskowego przy użyciu metodologii in vivo⁵ i ex vivo^6,7^,8. Postęp technologiczny w transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej pozwolił naukowcom zweryfikować strukturalną i funkcjonalną integralność ludzkich tkanek łożyska po perfuzji⁹.

Podczas gdy perfuzja ludzkich tkanek łożyskowych i pojedynczego liścienia jest najbardziej istotna, szybki rozwój środków farmakologicznych i zanieczyszczeń środowiskowych wymaga użycia zwierzęcego modelu perfuzji do wczesnego badania przesiewowego transferu ksenobiotyków przez barierę łożyskową. Ta metoda perfuzji łożyska pozwala na ocenę transferu przez barierę łożyskową przy użyciu łatwiej dostępnego i fizjologicznie istotnego łożyska szczura. Ponadto przepływ płynu przez barierę łożyskową przez pewien czas po ekspozycji można ocenić, mierząc objętość perfuzatu pochodzącego z tętnicy pępowinowej. Ze względu na to, że umożliwia perfuzję łożyskową zarówno z krążenia matczynego, jak i płodowego, to podejście z podwójnym przepływem całego narządu może być korzystne w porównaniu z obecnymi metodami in vitro i in vivo. Metoda ta pozwala na pomiar podawania ksenobiotyku przez aspekt matczyny na podstawie perfuzatu, który wyłania się przez łożysko przez żyłę pępowinową lub odwrotnie. Przedstawiony tutaj protokół będzie opisywał transfer polistyrenu o długości fali 20 nm (powszechnego nanoplastiku stosowanego w żywności i produktach medycznych) z tętnicy macicznej matki do przedziału płodowego i związane z tym zmniejszenie przepływu płynu przez łożysko, aby zilustrować zastosowanie tej metody w wielu warunkach fizjologicznych, farmakologicznych i toksykologicznych w celu oceny transferu łożyska, metabolizm i zmiany fizjologiczne wpływające na przepływ matki i/lub płodu.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rutgers.

1. Przygotowanie przed eksperymentem

UWAGA: Te kroki mogą być wykonane w ciągu kilku dni/tygodni przed eksperymentem.

1. Zmodyfikuj komorę naczynia.
   UWAGA: Rysunek 1A,B pokazuje zmodyfikowaną komorę pojedynczego naczynia.
   1. Przesuń czujnik termistora spod zacisku i zegnij go tak, aby swobodnie zwisał w kąpieli perfuzyjnej (Rysunek 1B).
   2. Zamontuj dwie 4-calowe igły ze stali nierdzewnej z końcówką ze standardowymi piastami połączeniowymi typu luer, jedną 25 G i jedną 23 G zabezpieczoną pod zaciskiem termistora i dodaj 3-kierunkowy kran odcinający, aby umożliwić kaniulację naczynia pępowinowego (Rysunek 1B).
      UWAGA: Złącza luer o różnych rozmiarach są oznaczone kolorami. Ułatwia to identyfikację naczyń w trakcie i po eksperymencie.
2. Zainstaluj dwie szklane mikropipety o średnicy 70−100 μm. Aby uzyskać więcej informacji na temat tych procedur, zapoznaj się z poniższymi źródłami^10,11.
   UWAGA: Średnica końcówki powszechnie stosowana w tych eksperymentach mieści się w zakresie 70−100 μm. Średnice końcówek większe niż ten zakres mogą utrudniać proces kaniulacji, podczas gdy średnice końcówki mniejsze niż 60 μm mogą przebić ścianę naczyniową podczas kaniulacji.
3. Opaski należy przygotować ze sterylnego szwu nylonowego (na bliższy i dalszy koniec tętnicy macicznej) oraz z czarnego plecionego jedwabnego szwu niejałowego (na naczynia pępowinowe). Wykonaj pojedyncze wiązania przez zapętlenie szwu, aby zainicjować kwadratowy węzeł lub zawiązać but, jak opisano wcześniej¹¹.
   UWAGA: Pojedyncze krawaty są zwykle wykonywane i przechowywane na szalce Petriego wypełnionej niewielką warstwą gumy silikonowej, aby pomóc w pracy na lepkim tle.
4. Przygotować 2 l roztworu soli fizjologicznej (PSS) zawierającego w mmol/l 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH₂PO₄, 0,83_MgSO4, 19 NaHCO₃, 1,8 CaCl₂ i 5,5 glukozy. Dostosować pH do 7,40 ± 0,02, powoli dodając kilka kropli kwasu (1 M kwasu solnego) lub zasady (1 N wodorotlenek sodu) do roztworu i odczekać co najmniej 20 s przed odczytaniem dostosowanego pomiaru pH. Przechowuj PSS w lodówce do momentu przygotowania do użycia, aby zmniejszyć zanieczyszczenie, ale nie przechowuj dłużej niż 2 tygodnie.
5. Oznaczyć probówki do mikrowirówek do zbierania ścieków "matczynych" i "płodowych" w każdym punkcie czasowym, tj. "MBaseline, M10, M20, ..." do punktu czasowego 180 min. Przygotuj to samo dla ścieków płodowych (FBaseline, M10, M20, ....).
6. Skalibruj wszystkie urządzenia używane w systemie, w tym temperaturę kąpieli krążącej i ciśnieniomierze krwi związane z utrzymaniem ciśnienia perfuzjatu w macicy (80 mmHg) i pępowinie (50 mmHg).
7. Przygotuj komorę preparacyjną (4 cale średnicy x 1 cala głębokości) lub krążące naczynie grzewcze, wypełniając warstwę (< 0,25") gumy silikonowej. Ta modyfikacja musi być wykonana z wyprzedzeniem, ponieważ wyschnięcie gumy zajmie 12−24 godziny.
   UWAGA: Dla początkujących chirurgów zaleca się stosowanie grzałki recyrkulacyjnej/naczynia chłodzącego, ponieważ naczynie nie będzie się poruszać, a tkanka będzie utrzymywać stałą temperaturę.

2. Przygotowanie stanowiska chirurgicznego i wyrównanie sprzętu

1. Włącz wszystkie urządzenia, które obsługują system perfuzyjny, aby sprawdzić, czy działa prawidłowo. Wyjmij PSS z lodówki i ogrzej do temperatury pokojowej. PSS będzie używany zarówno jako perfuzat, jak i superfusat.
2. Umieść mały bulgoczący kamień, aby dostarczyć mieszaninę gazów do zbiornika superfuzatu. Powszechnie stosowane mieszaniny obejmują 21%_O2, 8%_O2, 3% O₂ i 0%_O2. Włącz gaz, aby dostarczyć małe pęcherzyki do roztworu superbezpiecznika. Dostosuj dopływ gazu, aby uniknąć rozpryskiwania.
3. Zorganizuj stację preparacyjną dla zwierząt, sprawdzając znieczulenie, organizując sprzęt chirurgiczny i przygotowując opaski do szwów. Przygotuj komorę sekcyjną, zbierając szpilki preparacyjne, włączając agregat chłodniczy (lub pobierając lód) i napełniając komorę sekcyjną (wyłożoną gumowym silikonem) zimnym PSS.
4. Delikatnie napełnij wszystkie komory, igły, szklane mikropipety, rurki i zbiorniki podgrzanym PSS, uważnie obserwując i eliminując pęcherzyki powietrza, odsysając je pipetą do przenoszenia z cienką końcówką. Przekręć wszystkie 3-drogowe zawory odcinające z napisem "off" skierowanym w kierunku pipety, aby zabezpieczyć płyn w pipecie.
5. Umieść pojedynczy krawat na każdej z dwóch szklanych mikropipet przygotowanych do kaniulacji macicy oraz na dwóch końcówkach igieł przeznaczonych do kaniulacji pępowinowej. Przymocuj wiązania do pipet i igieł z końcówką, aby zapobiec ich zgubieniu podczas ruchów komory (Rysunek 1C).

3. Pobieranie łożysk

1. Znieczulenie ciężarnej samicy szczura w 20 dniu ciąży 5% izofluranem przez około 4 minuty lub do momentu, gdy zwierzę zacznie oddychać z trudem. Przenieś zwierzę do stożka nosowego i podaj 2,5%-3% izofluranu, aby utrzymać znieczulenie. Potwierdzić utratę przytomności przez brak odruchu szczypania palców u stóp.
   UWAGA: Wykorzystanie szczura w 20 dniu ciąży jest przedstawione w tym protokole. Jednak protokół pozostaje taki sam, jeśli warunki eksperymentalne wymagają, aby ocena łożyska odbyła się wcześniej w ciąży.
2. Zidentyfikuj i wyizoluj wybrany róg macicy (prawy lub lewy), wyjmując i rozkładając go na zewnątrz tuszy szczura. Za pomocą plecionego jedwabnego szwu zwiąż tętnicę maciczną na końcu jajnika i pochwowym końcu rogu. Uwzględnij jajnik wewnątrz szwu z rogiem macicy.
3. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wytnij róg macicy, wykonując nacięcia po bliższej stronie krawata jajnika i dystalnej stronie krawata pochwowego, pozostawiając róg macicy związany szwami na obu końcach. Przenieś róg macicy do naczynia preparacyjnego wyłożonego gumą silikonową i wypełnionego zimnym (4°C) PSS. Niezależnie od tego, czy wybrano prawy czy lewy róg, utrzymuj tę samą stronę do selekcji w każdym eksperymencie dla spójności.
   UWAGA: W celu znieczulenia płodu szczenięta są trzymane w lodowatym PSS. Dlatego temperatura PSS w komorze preparacyjnej jest utrzymywana przez schłodzoną kąpiel obiegową lub komora preparcyjna powinna być utrzymywana na lodzie.
   UWAGA: W tym momencie znieczulona zapora może zostać poddana eutanazji zgodnie z laboratoryjnym zatwierdzeniem protokołu IACUC. W tym przypadku eutanazja następuje poprzez odmę opłucnową (poprzez przecięcie przepony) i usunięcie serca matki.
4. Delikatnie wepchnij szpilkę preparacyjną przez róg macicy w gumę silikonową, stroną jajnika po lewej stronie, a stroną pochwy po prawej, aby uwidocznić unaczynienie macicy. Ustabilizuje to macicę i zapobiegnie przemieszczaniu się tkanki podczas preparacji przedziału płodowego. Wybierz jednostkę matczyno-łożyskowo-płodową centralną dla rogu i podwiąż tętnicę maciczną i żyłę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przeciąć mięsień macicy proksymalny i dystalny do wybranego łożyska i płodu. Mięsień macicy można cofnąć, pociągając go na bok; Ważne jest, aby pozostawić go nienaruszonym, ale odciągnąć go od zakrywania pupy płodu.
   UWAGA: Wybór jednostki matczyno-łożyskowo-płodowej powinien opierać się na długości odcinka tętnicy macicznej po obu stronach tętnicy łukowatej. Dłuższe segmenty pozwolą na bardziej udaną kaniulację.
5. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek usuń błonę owodniową z powierzchni płodu łożyska, uważając, aby ominąć pępowinę.
6. Rozplątać i podwiązać pępowinę, aby oddzielić pępowinę.
7. Zidentyfikuj tętnicę pępowinową (grubsze naczynie) i żyłę (cieńsze naczynie). Oznacz żyłę pępowinową w celu łatwej identyfikacji, przecinając ją nieco krótszą niż tętnica pępowinowa.
8. Delikatnie oddziel tętnicę pępowinową i żyłę od siebie.
9. Cała jednostka łożyskowa, w tym unaczynienie macicy, mięsień macicy, łożysko i pępowina, może zostać przecięta i usunięta.

4. Perfuzja łożyskowa

1. Utrzymuj anatomiczny przepływ krwi, zachowując prawidłową dystalną i proksymalną orientację tętnicy macicznej, umieść jednostkę łożyskową (składającą się z unaczynienia macicy, mięśnia macicy, łożyska i pępowiny) w zmodyfikowanej izolowanej komorze naczynia wypełnionej ciepłym, natlenionym PSS.
2. Używając pary cienkich kleszczyków w każdej ręce, nałóż proksymalny i dystalny koniec tętnicy macicznej na szklane mikropipety.
3. Szczelnie zabezpiecz tętnicę maciczną za pomocą sterylnej nylonowej opaski do szwów, która była wcześniej przymocowana do mikropipety.
   UWAGA: Mogą być konieczne dwie pętle (węzeł); Jednak pojedyncza pętelka do wiązania pozwala na większą regulację.
4. Wprowadzić kaniulację tętnicy pępowinowej (przepływ krwi od płodu do matki) na igle 23 G (większej) i zabezpieczyć ją czarnym plecionym jedwabnym szwem.
5. Wprowadzić żyłę pępowinową (przepływ krwi od matki do płodu) na igle o masie 25 G (mniejszej) i zabezpieczyć ją czarnym plecionym jedwabnym szwem.
6. Przenieś się do stacji perfuzji łożyska i zasyp wszystkie kurki i rurki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Podłącz wszystkie rurki zgodnie z Rysunek 2.
7. Umieść małe łódeczki wagowe pod dystalną kaniulacją tętnicy macicznej matki i kaniulacją igłową żyły pępowinowej płodu, aby złapać ścieki, które pojawią się podczas zabiegu.
8. Włącz pompę perystaltyczną, regulator ciśnienia i monitor ciśnienia i otwórz zawór odcinający, aby umożliwić przepływ płynu przez rurkę w kierunku przetwornika ciśnienia, ale jeszcze nie do łożyska. Powoli zwiększaj ciśnienie do 80 mm Hg.
9. Powoli przekręć kran do łożyska, aby się otworzyło i obserwuj, czy nie ma wycieków wewnątrz komory i wokół opasek.
   UWAGA: Jeśli pompa perystaltyczna pracuje z dużą prędkością, należy ponownie ocenić proksymalną kaniulację macicy i opaski pod kątem wycieków płynu. W przypadku stwierdzenia wycieków należy je usunąć. Należy również pamiętać, że podczas gdy średnie ciśnienie w tętnicy macicznej pozostanie stałe (ustawione na 80 mmHg), natężenie przepływu płynu może być zmienne w zależności od fizjologicznych reakcji naczyniowych i łożyskowych. Kwantyfikacja przepływu płynu może być zidentyfikowana jako zmienna doświadczalna w odpowiedzi na ekspozycję na ksenobiotyki.
10. Przekręć kurek, aby umożliwić przepływ płynu do tętnicy pępowinowej. Ustaw ciśnienie na około 50 mmHg, które można zrealizować za pomocą pompy perystaltycznej (Rysunek 3) lub kolumny hydrostatycznej.
11. Napełnij wszystkie zbiorniki (maciczny, pępowinowy i superfuzyjny), aby utrzymać objętość płynu przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Po rozpoczęciu perfuzji i rozpoczęciu eksperymentu, znieczulone młode pozostające w naczyniu preparacyjnym mogą być oceniane pod kątem żywotności poprzez dotykanie szczeniąt kleszczami w celu wywołania reakcji neurologicznej. Wykrwawienie szczeniąt nastąpi poprzez histerektomię rogu macicy; Dalsza eutanazja może być zakończona za pomocą zatwierdzonych protokołów IACUC. W tym przypadku otwarcie worka owodniowego w zimnym PSS i utworzenie odmy opłucnowej poprzez przecięcie żeber.

5. Próbny eksperyment

1. Po kaniulacji i rozpoczęciu perfuzji PSS pozwól tkankom zrównoważyć się przez 30 minut, aby umożliwić dostosowanie się układu krwionośnego do nowego przepływu płynu. Zassać ścieki za pomocą pipety i zapisać je w odpowiednio oznakowanej probówce do mikrowirówki.
2. Po zrównoważeniu ustalić perfuzję wyjściową, zbierając ścieki przez 10 minut z obu łódek wagowych w probówkach do mikrowirówek i mierząc objętość płynu, który wydostaje się przez tętnicę maciczną i żyłę pępowinową.
3. Rozpocznij pobieranie próbek w 10-minutowych odstępach czasu, zbierając ścieki z dystalnej tętnicy macicznej i żyły pępowinowej. Na przykład, podaj dawkę bolusa 900 μl nanocząstek polistyrenu znakowanych rodaminą o długości 20 nm (8 x^{10 14} cząstek/ml) zawieszonych w 0,01% środku powierzchniowo czynnym do linii perfundującej tętnicę maciczną, aby zidentyfikować przejście nanocząstek ksenobiotycznych przez barierę łożyskową.
   UWAGA: Te próbki ścieków pozwolą na pomiar zanieczyszczeń w płynie (ksenobiotyk, farmakologiczny lub metabolit) i zapewnią szybkość przepływu płynu przez tętnicę maciczną lub przez łożysko i do przedziału płodowego (Rysunek 4).
4. Po infuzji bolusa należy pobierać próbki z dystalnej tętnicy macicznej i ścieków z żyły pępowinowej płodu co 10 minut, łącznie 180 minut po infuzji.

6. Czyszczenie sprzętu

1. Po każdym eksperymencie wyjmij łożysko z pipet. Wszystkie szwy mogą zostać zachowane w celu ponownego wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Tkanka łożyska może zostać zachowana do dodatkowych badań histologicznych lub mechanistycznych.
2. Oczyść wszystkie rurki i kaniule systemu perfuzyjnego 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną i wysusz próżniowo.
   UWAGA: Jeśli rurki lub pipety zaczną się odbarwiać lub wyglądać na uszkodzone, wymień je przed następnym eksperymentem. Ponadto, po zakończeniu kohorty eksperymentalnej (np. wszystkich badań dotyczących pojedynczego zanieczyszczenia), wymień wszystkie rurki w komorze, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia eksperymenty sprawdzające zasadę działania z wykorzystaniem barwnika błękitu Evansa, co pozwoliło nam przetestować system oraz zwizualizować prawidłowe funkcjonowanie bariery płynnej i łożyskowej oraz zapobiec przeniesieniu substancji do przedziału płodowego. Barwnik błękitu Evansa dotarł do tkanki łożyska w tym systemie i ją perfundował (Rysunek 5A). Dalsza analiza wykazała, że błękit Evansa nie przedostał się do żylnej części pępowiny płodu (Rysunek 5B), co jest oczekiwanym rezultatem, ponieważ błękit Evansa wiąże się z albuminami.

Rysunek 6 przedstawia dane z eksperymentu kontrolnego opisanego w niniejszym protokole. Próbki odpływu z dystalnego końca tętnicy macicznej oraz z żyły pępowinowej płodu pobierano w każdym 10-minutowym przedziale czasowym, aby ocenić przepływ płynu w czasie po podaniu dawki bolusa do macicznej tętnicy matki (Rysunek 6). Stwierdzono zmniejszenie transferu płynu do przedziału płodowego w ciągu 10 minut po infuzji polistyrenu. Aby ilościowo określić transfer polistyrenu do przedziału płodowego w czasie jego występowania, 25 µL perfuzowanego płynu z każdego punktu czasowego naniesiono w duplikacie na płytkę 96-dołkową w celu pomiaru fluorescencji próbki. Fluorescencję określono za pomocą odczytu spektroskopowego przy 546/575 nm (ex/em) z wykorzystaniem mikroczytnika płytek fluorescencyjnych. Transfer polistyrenu do przedziału płodowego nastąpił w ciągu 10 minut, osiągnął szczyt w 20 minucie i trwał przez 90 minut (Rysunek 6B).

Podzbiór perfundowanych tkanek łożyska zachowano do badań histopatologicznych i ocen morfologicznych. Tkanki utrwalono w formalinie, zabarwiono hematoksyliną i eozyną, a następnie poddano analizie certyfikowany patolog weterynaryjny. Eksperci nie zidentyfikowali żadnych nieprawidłowości strukturalnych w łożyskach perfundowanych wyłącznie roztworem PSS lub roztworem PSS z dawką bolus polistyrenu znakowanego rodaminą.

Rysunek 1: Zmodyfikowana komora z jednym naczyniem. (A) Przegląd zmodyfikowanej komory. (B) Powiększony obraz igieł o tępym czubku zamocowanych w komorze naczynia. Czerwona strzałka wskazuje klips termistora, który został zmodyfikowany tak, aby utrzymywać igły na miejscu podczas kaniulacji pępowiny. (C) Reprezentatywny obraz czterech kaniul przygotowanych do kaniulacji tkanki. Czerwone strzałki wskazują każdą z czterech kaniul. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Powiększony widok komory do perfuzji łożyska. (A) Przedstawia dren podłączony do przetwornika ciśnienia i kaniulowany w proksymalnej macicznej tętnicy matki, czyli „wpływ”. Ciśnienie jest ustawione na stałą wartość 80 mmHg zgodnie z literaturą. (B) Przedstawia port odpływowy komory dla superfuzatu otaczającego tkankę łożyska podczas perfuzji. (C) Przedstawia wlot superfuzatu do komory w celu obmywania łożyska ogrzanym PSS podczas perfuzji. (D) Przedstawia dystalny port maciczny matki, w którym można zbierać effluent z perfuzji macicy. (E) Przedstawia port temperatury, gdzie komora naczyniowa może zostać podłączona do termometru i grzałki w celu utrzymania stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu. (F) Przedstawia kaniulację tętnicy pępowinowej. Tętnica pępowinowa jest poddawana ciśnieniu 50 mmHg, aby umożliwić przepływ przeciwprądowy na poziomie łożyska. (G) Przedstawia zbiór effluentu z żyły pępowinowej. Płyn przepływający w kierunku przedziału płodowego podczas perfuzji będzie tu zbierany. (H) Jest to centrum systemu perfuzyjnego, w którym łożysko jest kaniulowane i utrzymywane przez cały proces perfuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Widok systemu perfuzji łożyskowej. (A i B) System kontroli ciśnienia używany do monitorowania i utrzymywania ciśnienia 80 mmHg perfuzatu w tętnicy macicznej. (C) Element odpowiedzialny za termoregulację komory perfuzyjnej. (D) Mikroskop. (E) Komora perfuzyjna. (F) Zestaw do perfuzji tętnicy pępowinowej zasilany grawitacyjnie, ustawiony na 50 mmHg. (G) Pompa perystaltyczna używana do napełniania i odprowadzania superfuzatu łożyskowego PSS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Schemat systemu perfuzji łożyska. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Reprezentatywne obrazy eksperymentów dowodzących zasady działania z użyciem barwnika błękitu Evansa. (A i B) Dowód zasady działania, zgodnie z którym błękit Evansa perfunduje naczynia krwionośne macicy, mięsień macicy i łożysko, ale nie przekracza bariery łożyskowej ze względu na wiązanie z albuminą. Zielona strzałka wskazuje niebieski drenaż żylny z łożyska z powrotem do krążenia matki. Czerwona strzałka wskazuje odpływ z żyły pępowinowej w kierunku przedziału płodowego. Należy zwrócić uwagę na brak niebieskiego barwnika. (C) Reprezentatywny obraz zbierania odpływu z żyły pępowinowej. Czerwona strzałka wskazuje formowanie się kropli przed pobraniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Dane pochodzące z eksperymentu pozorowanego. Pomiary fluorescencji nanomateriałów polistyrenowych znakowanych rodaminą, znormalizowane do fluorescencji bazowej, przeprowadzone poprzez pobranie treści (A) tętnicy macicznej oraz (B) żyły pępkowej płodu. Średnia fluorescencja znormalizowana do wartości bazowej ± błąd standardowy (SE). *: p < 0.05 oraz T: p < 0.1 na podstawie analizy wariancji (ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ta metoda perfuzji pozwala na szybką ocenę bariery łożyskowej i funkcji fizjologicznej układu naczyniowego macicy i warstwy trofoblastu. Kaniulacja i perfuzja bliższych i dalszych końców tętnicy macicznej matki symuluje fizjologię przepływu krwi matki przez to główne naczynie odpowiedzialne za wysyłanie krwi do rozwijającego się płodu. Metodologia ta pozwala na fizjologiczną ocenę izolowanego układu naczyniowego matki, łożyska i pępowiny, a zatem zmiany w fizjologii można zidentyfikować jako patologię naczyniową; Unerwienie immunologiczne i nerwowe są usuwane w procedurze ex-vivo. Aby zapewnić prawidłową ocenę, bardzo ważne jest, aby starannie kaniulować te naczynia, aby nie tworzyć żadnych rozdarć ani przebić w ściankach naczynia oraz usunąć pęcherzyki powietrza. Zator gazowy może powodować uszkodzenie śródbłonka układu krwionośnego lub blokować naczynia krwionośne. Utrzymując połączenia naczyniowe między macicą, łożyskiem i płodem podczas sekcji, można zaobserwować ocenę płynu i translokacji do płodu. Po podaniu ksenobiotyku, w tym przypadku polistyrenu o długości fali 20 nm, kinetyka do dystalnego końca tętnicy macicznej i przez łożysko do przedziału płodowego może być oceniana poprzez analizę ścieków w czasie 180 minut.

Chociaż opisano model podwójnej perfuzji, a w tym artykule monitorowano transfer cząstek i płynu z przedziału matki do przedziału płodowego, oceny można również dokonywać w odwrotnej kolejności od przedziału płodowego do matczynego. Jednym z ograniczeń opisanej tutaj metody jest to, że dystalna żyła macicy nie została kaniulowana ani pobrana próbki. W przyszłych badaniach, zwłaszcza tych skoncentrowanych na transferze z płodu na matkę, ważne będzie kaniulowanie i pobieranie próbek z dystalnego naczynia macicy. Ścieki pobrane z tego próbnego eksperymentu wykorzystano do oceny transferu ksenobiotyków; Można jednak przeprowadzić szeroki zakres ocen dotyczących endokrynologicznych i molekularnych funkcji łożyska lub żywienia płodu.

Mocne strony tego protokołu znacznie przewyższają jego drobne ograniczenia. Preparat zachowuje fizjologiczną strukturę i integralność całego narządu w celu oceny warunków doświadczalnych. Perfuzja łożyska ex vivo jest naukowym postępem od komórkowego badania in vitro do narażenia całych zwierząt w celu prawidłowego określenia oceny ryzyka reprodukcyjnego. Można to uznać za cenną technikę w badaniach oceniających rozkład leków farmakologicznych łożyskowych, farmakokinetykę, toksykologię, fizjologię i medycynę matczyno-płodową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pleciony jedwab niewchłanialny szew chirurgiczny niesterylny	Specjalizacje chirurgiczne Wygląd	AACO805
Cienkie kleszcze	FST firmy Dumont Szwajcaria	11252-20
Cienkie nożyczki	FST firmy Dumont Szwajcaria	14060-10
Szklane opakowanie kaniuli	Oprzyrządowanie systemów żywych (LSI)	GCP-75-100
Probówki do mikrowirówek Polipropylenowa probówka z podziałką 2,0 ml z pokrywką blokującą MIESZANE	Fisherbrand	02-681-299
Nieząbkowane, drobno zakrzywione, mikro zaciski zębatkowe	InterFocus	18052-03
Pompa perfuzyjna	ISMATEC	ISM795C
Monitor ciśnienia	Tryb Oprzyrządowania systemów żywych (LSI)	PM-4
Samonagrzewająca się komora	pojedynczego naczyniaOprzyrządowanie systemów żywych (LSI)	CH-1
Serwopompa	Oprzyrządowanie systemów żywych (LSI)	ModelPS-200-P
igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23	Component Supply Co.	04651-01
igła ze stali nierdzewnej o grubości 25 Component	Supply Co.	07116-01
STERYLNY szew nylonowy	AROSurgical Instruments Corporation	T04A00N07-13
Zasób sedacji	kurka	6-205-04
Regulator temperatury	Oprzyrządowanie systemów żywych (LSI)	Model TC-09S