Artykuł metodologiczny

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59419

⸱

16 grudnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 2Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 3Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to populacja komórek multipotencjalnych, które mogą być izolowane z różnych tkanek dorosłych i płodowych, w tym tkanki tłuszczowej. Ze względu na klinicznie istotny typ komórek, potrzebne są optymalne metody izolowania i namnażania tych komórek in vitro. Większość metod izolacji MSCs pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) opiera się na ostrych enzymach, takich jak kolagenaza, w celu trawienia tkanki tłuszczowej. Jednakże, chociaż są skuteczne w rozbijaniu tkanki tłuszczowej i zapewniają wysoki odzysk ADSC, enzymy te są drogie i mogą mieć szkodliwy wpływ na ADSC - w tym ryzyko związane ze stosowaniem składników ksenogenicznych w zastosowaniach klinicznych. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę izolowania ADSC ze świeżych próbek lipoaspiratu i abdominoplastyki bez enzymów. Krótko mówiąc, metoda ta opiera się na mechanicznej dysocjacji dowolnej tkanki masowej, po której następuje system hodowli typu eksplantowego. ADSC mogą migrować z tkanki na płytkę do hodowli tkankowej, po czym ADSC mogą być hodowane i namnażane in vitro do dowolnej liczby zastosowań badawczych i/lub klinicznych.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to klasa multipotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą być izolowane z różnych tkanek dorosłych i płodowych, w tym z tkanki tłuszczowej. Komórki te są atrakcyjnym typem komórek zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań klinicznych ze względu na ich plastyczność w różnicowaniu się w komórki wszystkich listków zarodkowych in vitro, przekraczaniu barier allogenicznych, domu dla obszarów zapalnych i tłumieniu stanu zapalnego (recenzowane w Sherman, et al.1). MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są szczególnie atrakcyjne ze względu na łatwość ich uzyskania, ponieważ tkanka tłuszczowa jest ogólnie uważana za tkankę odrzuconą po rutynowych zabiegach liposukcji i plastyki brzucha. Jednak po uzyskaniu próbki są zazwyczaj poddawane trudnym warunkom – albo warunkom enzymatycznym, albo wirowaniu – w celu wyizolowania ASCs2,3. Metoda ta ilustruje prostą procedurę izolowania ASC przy użyciu metody eksplantacyjnej, przy braku ostrych etapów enzymatycznych lub wirowania.

Najczęstsza metoda izolacji ASC polega na myciu próbki tłuszczu, enzymatycznym trawieniu próbki za pomocą kolagenazy, odwirowaniu próbki i wreszcie lizie czerwonych krwinek przed hodowlą ASCs4. Chociaż jest to skuteczne w izolowaniu wysokiej wydajności ASC, stosowanie składników ksenogenicznych (np. trawienie enzymatyczne z kolagenazą) jest uważane przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków za więcej niż "minimalnie zmanipulowane" i może stwarzać ryzyko, takie jak reakcja immunologiczna, zabraniająca stosowania komórek w klinice5,6. Aby zminimalizować ryzyko związane ze składnikami ksenogenicznymi, wiele grup zasugerowało enzymy niepochodzące od zwierząt, wytwarzane do trawienia tkanki tłuszczowej. Jednak enzymy te są nadal ostre i mogą zmieniać fenotyp komórki7.

Inne metody izolowania ASC obejmują wirowanie z dużą prędkością, przy użyciu sił tak dużych jak 1,200 x g, oraz wirowanie w celu odizolowania ASCs8. Nawet siły tak małe jak 400 x g były wystarczające do odizolowania zdolnych do użytku ASCs9. Chociaż komórki te produkują dużą ilość żywotnych komórek, wielu protokołom nie udało się namnażać dłużej niż 14 dni8. Co więcej, izolacja mechaniczna daje mniej odzyskanych komórek niż trawienie enzymatyczne, ale większy odsetek izolowanych komórek stanowiły ASC w porównaniu z innymi komórkami endogennymi do tkanki tłuszczowej przy przejściu 010.

Izolacja czystszej, bardziej żywotnej populacji ASC w krótszym czasie, w połączeniu z kosztami i ryzykiem związanym ze składnikami ksenogenicznymi, sprawia, że trawienie enzymatyczne staje się coraz mniej atrakcyjne do zastosowania w klinice. Chociaż izolacja mechaniczna jest początkowo korzystnym podejściem, istnieje znaczna rozbieżność w stosowanych metodach, a objętość przetwarzanej tkanki jest ograniczona do rozmiaru wyspecjalizowanych jednostek odśrodkowych i może zależeć od spójności operatora2.

Podczas gdy zarówno trawienie enzymatyczne, jak i wirowanie szybko dają dużą ilość ASC, te izolowane komórki wykazują zmiany fenotypowe, co rodzi pytania o ich zachowanie po powrocie do pacjenta2. Metoda izolacji ASC oparta na eksplantach, opisana w tym protokole, jest zatem stosowana przez niektóre grupy, w której ASC migrują z małych kawałków stałej tkanki tłuszczowej3,11,12. Ta migracja jest prawdopodobnie efektem przyciągania komórek do pożywki bogatej w składniki odżywcze. Podobnie jak inne populacje MSC, ASC przylegają do plastiku, przeżywają i namnażają się w używanych pożywkach do hodowli tkankowych (składniki poniżej), co pozwala na ich izolację od innych typów komórek z tkanki tłuszczowej. Podczas gdy początkowo odzyskiwanych jest mniej komórek - często zajmuje to > 1 tygodnia, zanim komórki będą widoczne na płytce hodowli tkankowej - te niezmodyfikowane ASC będą się namnażać in vitro, umożliwiając ekspansję komórek do klinicznie istotnych objętości11,12,13.

Protokół

Użycie próbek lipoaspiratu i abdominoplastyki zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) Uniwersytetu Rutgers — Kampus Newark.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli tkankowej

  1. Sterylnie przygotować 500 ml pożywki do hodowli tkankowej przed wyizolowaniem ASC. Aby przygotować pożywkę hodowlaną, dodaj 10% zdefiniowanej płodowej surowicy cielęcej (FCS) i penicyliny-streptomycyny (10 000 U/100 ml) do minimalnej pożywki niezbędnej (DMEM) Dulbecco z wysoką glukozą i 2 mM L-glutaminą. Podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni i należy go zawsze używać w cieple (od temperatury pokojowej do 37 °C).
    1. Jeśli do hodowli komórek macierzystych preferowane jest inne podłoże, należy je przygotować.

2. Izolacja ASC od tkanki tłuszczowej

  1. Pobrać lipoaspiraty lub próbkę (próbki) do abdominoplastyki. Po zatwierdzeniu przez IRB należy pobrać takie próbki, jak tkanka odrzucona po różnych zabiegach chirurgicznych. Przetransportować lipoaspiraty do laboratorium, w dowolnym naczyniu, w którym chirurg usunął tkankę; Próbki do abdominoplastyki należy transportować w torbie lub pojemniku na próbki na sali operacyjnej.
  2. Próbkę (próbki) należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 6 godzin lub w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny, jeżeli nie zostanie ona natychmiast przetworzona. Próbki tkanek przetworzone po wyżej wymienionych czasach prawdopodobnie będą miały zmniejszoną wydajność komórek. Utrzymuj próbki abdominoplastyki w stanie wilgotnym przez dodanie 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
  3. Od tego momentu wszystkie kroki należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym w warunkach aseptycznych. Nosić rękawice do ochrony osobistej. Trzymaj w pobliżu 10% wybielacza, 70% etanolu i ręczniki papierowe, aby szybko usunąć wszelkie rozlane płyny biologiczne. Nadmiar tkanek należy usunąć jako odpady biomedyczne.
  4. Próbki pokroić na < kawałki o średnicy 1 mm. Jeśli blok do plastyki brzucha jest zbyt duży, aby z nim pracować, przed zmieleniem odetnij z niego łatwy do opanowania rozmiar tkanki. Przenieś tkankę do plastyki brzucha na pokrywkę sterylnej płytki o średnicy 100 mm. Użyj sterylnej igły, aby przytrzymać kawałek tkanki na miejscu i użyj sterylnego skalpela, aby zmielić kawałki, odcinając lub delikatnie rozdrabniając tkankę luzem.
    1. Ten krok na ogół nie jest wymagany w przypadku lipoaaspiratów. Jeśli jednak w lipoaspiracie zaobserwuje się duże fragmenty tkanki, usuń takie fragmenty za pomocą sterylnych kleszczy i postępuj jak powyżej.
  5. Przenieś tkankę do świeżej probówki i odwróć lub potrząśnij próbką 5–6 razy, aby zapewnić wymieszanie wszystkich warstw. Opcjonalnie: jeśli lipoaspirat całkowicie osiadł, przed zmieszaniem należy usunąć i wyrzucić warstwę oleju.
  6. Przenieś 2,5–5 ml tkanki na płytkę do hodowli tkankowej poddanej działaniu plazmy próżniowej o średnicy 100 mm (tabela materiałów). Zmierzyć objętość próbki, wlewając ją do świeżej probówki wirówkowej. W razie potrzeby użyj sterylnej szpatułki, aby pomóc w przenoszeniu tkanki.
  7. Dodać równoważną objętość pożywki do hodowli tkankowych na płytkę. Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać zawartość.
  8. Inkubować pasztety w temperaturze 37 °C w 5% CO2 do momentu, gdy na podstawie płytki pojawi się wystarczająca liczba komórek. Z biegiem czasu komórki będą migrować z wnętrza tkanki na powierzchnię płytki, w którym to momencie przylgną do plastiku. Gdy wyjdą z tkanki, komórki pojawią się jako małe skupiska wokół kawałków tkanki.
  9. Co 24 godziny usuwaj jak najwięcej płynu i zastąp podobną ilością pożywki. Jeśli to możliwe, pozostaw kawałki tkanki na miejscu.
  10. Po odnotowaniu wystarczającej liczby komórek na płytce (>10 skupisk > 15–25 komórek na płytce) lub po 7 dniach, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, usuń wszystkie pozostałe kawałki tkanki.
  11. Hodować ASC w pożywkach do hodowli tkankowej, aż osiągną 70% zbiegu lub do momentu, gdy skupiska staną się gęste (>5 gęstych skupisk komórek na płytce, każde o średnicy około > 500 μm), w którym to momencie komórki mają zostać pasażowane.

3 Kultura ASC

  1. Przejdź przez ASC, gdy płytka macierzysta osiągnie około 70% zbiegu. Uważaj, aby nie dopuścić do nadmiernej zbieżności kultur ASC.
  2. Delikatnie przepłucz płytkę 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i trypsynizuj przylegające komórki. Aby wytrypsynizować komórki, odessać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i dodać 1 ml trypsyny z 0,25% EDTA do każdej płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach potwierdzić usunięcie zaleceń lekarskich pod mikroskopem. Jeśli komórki nadal przylegają, włóż je z powrotem do inkubatora na dodatkowe 5 minut.
  3. Dodaj niewielką ilość pożywki (około 25% całkowitej objętości trypsyny) do płytki, aby dezaktywować trypsynę, i delikatnie umyj podstawę płytki za pomocą pożywki/trypsyny. Aby umyć płytkę, trzymaj ją pod niewielkim kątem i delikatnie odpipetuj pożywkę/trypsynę od góry płytki w dół, poluzowując wszelkie cotygodniowe komórki przyczepione z płytki. Komórki można ponownie posiać w stosunku 1:3 lub wysiać z gęstością 120 000–500 000 komórek na płytkę.
    1. W przypadku wysiewu opartego na liczbie komórek, przenieś trypsynę/pożywkę z płytki do stożkowej probówki wirówkowej i osadzaj komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 7 minut. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli tkankowej (około 1 ml na początkową płytkę) i policzyć komórki przed wysiewem. Aby policzyć komórki, przenieś 10 μl zawiesiny komórek do hemocytometru i policz komórki znajdujące się w kwadrancie 4 x 4 w każdym rogu siatki. Zsumuj te wartości razem i pomnóż wartość przez 104, aby obliczyć liczbę komórek.
    2. Dodaj pożywkę do płytki przed wysianiem komórek. Dodaj komórki kroplami, a następnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na płytce.
      UWAGA: Po 3 przejściach przylegające komórki powinny wydawać się asymetryczne i wrzecionowate. Fenotyp i zachowanie ASC można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej i testów różnicowania.
  4. Potwierdzenie fenotypu i zachowania ASC za pomocą cytometrii przepływowej i testów różnicowania
    1. Cytometria przepływowa
      1. Zbierz i zagnieźdź ogniwa, jak opisano powyżej. Umyj granulat 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i oznacz komórki zalecanymi przez producenta objętościami przeciwciała. Szczegółowy protokół cytometrii przepływowej, powszechnej procedury laboratoryjnej, można znaleźć tutaj12,14,15.
      2. Wybierz panele znaczników powierzchni spośród poniższych, aby potwierdzić fenotyp ASC: ujemny dla CD14, CD31, CD34, CD45 i CD106; i dodatni dla CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 i CD10516,17,18,19. Obecność CD36 i brak CD106 pozwalają na rozróżnienie ASC od MSCs pochodzących ze szpiku kostnego20.
    2. Testy różnicowania: Potwierdź różnicowanie wieloliniowe za pomocą zestawu do różnicowania MSC. Zestawy są dostępne u wielu producentów w celu potwierdzenia zdolności różnicowania adipogennego, osteogennego i chondrogennego. Zmieniaj pożywkę dostarczoną w zestawie co 3-4 dni zgodnie z protokołami producenta przez 3 tygodnie lub do momentu zaobserwowania zróżnicowania morfologicznego.
  5. Hoduj komórki dla wielu pasaży; liczba potrzebnych pasaży będzie zależeć od aplikacji (aplikacji). Przy każdym pasażu należy potwierdzić morfologię i fenotyp komórek MSC za pomocą wyżej wymienionych markerów powierzchni komórki i upewnić się, że zdolność różnicowania wieloliniowego nie została utracona. Chociaż potencjał ekspansji różni się w zależności od dawcy, większość próbek można rozszerzyć do 6-9 pasaży.
  6. Kriokonserwuj komórki i przechowuj je w ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.

4 Kriokonserwacja ASC

  1. Przygotuj 10 ml roztworów zamrażających A i B.
    1. W przypadku zamrażania roztworu A dodaj 20% FCS do DMEM o wysokiej zawartości glukozy.
    2. W przypadku zamrażania roztworu B dodaj 20% FCS i 20% siarczku dimetylu (DMSO) do DMEM o wysokiej zawartości glukozy.
  2. Granulować komórki przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości roztworu zamrażającego A i policzyć komórki za pomocą hemocytometru, jak w kroku 3.3.1.
  3. Oblicz końcową objętość, w której komórki zostaną ponownie zawieszone, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek 500 000–1 000 000 komórek/ml. Użyj roztworu zamrażającego A, aby ponownie zawiesić osad w 50% tej końcowej objętości. Powoli dodawać kroplami równą objętość roztworu zamrażającego B, mieszając probówkę, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek.
  4. Natychmiast zamroź komórki w kriowialiach o pojemności 1–2 ml. Zamrażać kriowiale w zamrażarce o kontrolowanej szybkości lub w pojemniku do zamrażania umieszczonym w temperaturze -80 °C, co powoduje obniżenie temperatury o 1 °C/min. Po kontrolowanym zamrożeniu (na noc w przypadku pojemnika do zamrażania) przenieś komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Wyniki

Korzystając z opisanej tutaj metody, udało się wyizolować ASC z próbek lipoaspiratu i abdominoplastyki (Rysunek 1). Po trzech pasażach stwierdzono, że izolowane komórki mają morfologię MSC (asymetryczny, wrzecionowaty kształt) i fenotyp, podobny do ASC po trawieniu enzymatycznym (Ryc. 2). Wcześniejsze badania przeprowadzone przez naszą grupę i inne wykazały, że te ASC różnicują się w adipocyty, osteocyty i neurony, podobnie jak inne MSC, w tym ASC wyizolowane w inny sposób11,21.

W większości przypadków, migracja ASC na płytkę hodowli tkankowej może być zwizualizowana w ciągu 3-5 dni za pomocą mikroskopii jasnego pola. Jednak w niektórych przypadkach po 7 dniach widoczne będą tylko rzadkie komórki. W rzadkich przypadkach komórki nie migrują na płytkę i/lub nie rozmnażają się aż do trzeciego pasażu. Wynik ten na ogół koreluje z opóźnieniem w przetwarzaniu próbki tkanki.

figure-results-1
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie izolacji ASC z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu. Próbki abdominoplastyki i lipoaspiratu uzyskano jako tkankę odrzutową po rutynowych zabiegach chirurgicznych. Próbki abdominoplastyki rozdrobniono, po czym próbki abdominoplastyki lub lipoaspiratu posiewano jako eksplantaty w pożywkach do hodowli tkankowych. ASC migrowały z tkanki w kierunku pożywki bogatej w składniki odżywcze. Po 1 tygodniu eksplantaty zostały usunięte, a ASC wyhodowane w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów i/lub zastosowania klinicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Izolowane ASC z morfologią i fenotypem MSC. ASC wyizolowane metodą eksplantatyczną, bezenzymatyczną, mają morfologię i fenotyp MSC w pasażu 3. (A) Podobnie jak inne MSC, te ASC mają asymetryczny, wrzecionowaty kształt, niezależnie od tego, czy są izolowane eksplantatem, czy metodą enzymatyczną (np. kolagenaza). ASC wyizolowane metodą enzymatyczną dają dłuższą, węższą morfologię w porównaniu z eksplantatycznie izolowanymi ASC; te ostatnie bardziej przypominają MSCs pochodzące z innych metod izolacji bezenzymatycznej, takich jak MSC pochodzące ze szpiku kostnego. (B) Podobnie jak inne MSC, izolowane ASC eksplantatywne są ujemne dla CD45 i dodatnie dla CD73, CD90 i CD105. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

ASC są atrakcyjnym źródłem MSCs ze względu na łatwy dostęp do tkanki. Zarówno w przypadku zastosowań klinicznych, jak i badawczych, naukowcy muszą pamiętać o zmienności dawców podczas izolowania i hodowli tych komórek. Z przyczyn, które nie zostały jeszcze wyjaśnione, MSCs od różnych dawców wykazują różne zdolności do namnażania się in vitro, co z kolei wpływa na migrację ASC z eksplantatu tkanki tłuszczowej i zdolność do proliferacji. Podczas gdy zmienność można zaobserwować w czasie potrzebnym do osiągnięcia konfluencji przez ASC wyizolowane z tych bezenzymatycznych eksplantatów, rzadko zdarzało się, aby próbka nie namnażała się in vitro.

Poza zmiennością dawcy, najbardziej prawdopodobnym źródłem niepowodzenia komórek w migracji z tkanki i/lub proliferacji in vitro jest czas, w którym tkanka była przechowywana przed przetwarzaniem. Gdy próbki pozostawiono na >12 godzin przed przetworzeniem lub gdy nie były utrzymywane w stanie wilgotnym między zbiorem a przetwarzaniem, zaobserwowano gorsze tempo migracji i proliferacji. Jedynymi próbkami, które często nie ulegały namnażaniu się, były próbki z plastyki brzucha, które nie były utrzymywane w wilgoci roztworem soli fizjologicznej: w takich przypadkach tkanka w środku bloku tkankowego była często wystarczająco wilgotna, aby można ją było przetworzyć, ale czasami trzeba było ją wyrzucić. Dlatego tak ważne jest, aby tkanka była wilgotna od momentu zbioru do przetworzenia.

W przypadkach, gdy ASC nie są obserwowane na płytce po 1 tygodniu, eksplantaty tkanki tłuszczowej powinny być nadal usuwane z płytek kultur tkankowych, aby nie doszło do martwicy tkanek. Czasami jest zbyt mało komórek, aby można je było łatwo zidentyfikować, ale te kilka komórek będzie zdolnych do ekspansji w systemie hodowlanym. Jeśli komórki nadal nie są obserwowane po 3 tygodniach, izolację należy uznać za nieudaną.

W niektórych przypadkach, szczególnie w przypadku plastyki brzucha, nie jest możliwe uzyskanie prawdziwie aseptycznej próbki ze względu na ograniczenia na arenie chirurgicznej. Jeśli nie jest możliwe użycie sterylnego naczynia do transportu tkanki z sali operacyjnej do okapu z przepływem laminarnym, usunięcie zewnętrznego 1 cm tkanki jest na ogół wystarczające, aby zapobiec skażeniu mikroorganizmami. Jeśli próbka abdominoplastyki jest przymocowana do skóry, skórę można przetrzeć 70% etanolem, aby wysterylizować tę powierzchnię przed zmieleniem tkanki tłuszczowej.

Podczas procesu mielenia bardzo ważne jest, aby tkanka została zmielona na małe, drobne kawałki. Jeśli eksplantaty są zbyt duże, nie będzie wystarczającej powierzchni, aby ASC mogły wydostać się z tkanki na płytkę. Ponadto bardzo ważne jest, aby tkanka nie pozostawała na płytce dłużej niż to konieczne, aby tkanka nie uległa martwicy.

Ograniczeniem tej metody jest zastosowanie enzymu (w opisanym protokole trypsyny) do odłączania ASC podczas procesu hodowli tkankowej. Inne enzymy niepochodzenia zwierzęcego, takie jak Accutase, można zastąpić, aby wyeliminować potrzebę stosowania produktów pochodzenia zwierzęcego, jednak zwiększy to koszt hodowli tkankowej. Między innymi z tego powodu liczne grupy badają niedwuwymiarowe metody hodowli tkankowej, takie jak bioreaktory i systemy oparte na rusztowaniach, w celu zwiększenia potencjału wzrostu MSC przy jednoczesnym zminimalizowaniu konieczności odłączania komórek od ich substratu22.

Przy przenoszeniu ASC do kliniki głównym ograniczeniem metody izolacji eksplantatów jest poleganie na urządzeniu do hodowli tkankowej na poziomie dobrej praktyki produkcyjnej (GMP), którego brakuje wielu ośrodkom medycznym. W takich przypadkach konieczne byłoby zastosowanie którejkolwiek z samodzielnie dostępnych na rynku metod opartych na enzymach lub wirowaniu. Oczekuje się jednak, że w miarę jak urządzenia GMP stają się coraz bardziej rozpowszechnione, efekt ten będzie ograniczony. W międzyczasie, nawet takie ośrodki, w których brakuje urządzeń do hodowli tkankowych GMP, mogą rozważyć zastosowanie metody eksplantacji do badania ASC in vitro: im mniej manipulacji, tym bardziej komórki te są zbliżone do swoich odpowiedników in vivo11.

Metoda ta zapewnia prosty sposób izolowania ASC z tkanki tłuszczowej - zarówno lipoaspiratów, jak i abdominoplastyki - przy braku ostrych enzymów lub etapów wirowania. Podczas gdy początkowa wydajność ASC jest niższa niż w przypadku innych metod, ASC będą się rozmnażać in vitro, minimalizując efekt niższej początkowej wydajności. Brak nadmiernej lub wymuszonej manipulacji sprawia, że ASC izolowane w taki sposób są szczególnie istotne, ponieważ jest mniej pytań (tj. czy obserwowane efekty są spowodowane samymi komórkami, czy też manipulacją komórek podczas procesu izolacji).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dimethyl SulfoxideFisher BioreagentsBP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - płytki do hodowliSigma-AldrichD5671
Falcon 3003oCorning Corning
Płodowa surowica bydlęca SurowicaSigma-AldrichF2442jest testowana wsadowo, aby upewnić się, że wspiera wzrost MSC
L-glutamina roztwórSigma-AldrichG7513
Mr. FrostyNalgene5100-0001
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT4049
tkankowych wysokiej zawartości glukozy

Bibliografia

  1. Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective. Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).
  2. Conde-Green, A., et al. Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  3. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), (2017).
  4. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  5. Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
  6. Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
  7. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  8. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  9. Palumbo, P., et al. In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).
  10. Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
  11. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).
  12. Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy. Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).
  13. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons. Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).
  14. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241(2014).
  15. Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).
  16. Munoz, J. L., et al. Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs. Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).
  17. Amati, E., et al. Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14(2017).
  18. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), (2015).
  19. Palumbo, P., et al. Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
  20. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  21. Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method. Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).
  22. Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja bez u ycia enzym wmechaniczna dysocjacja tkaneksystem hodowli eksplantat wanaliza cytometrycznatesty r nicowaniamarkery CD73 CD90 CD105ekspansja hodowli tkankowychprotok metody rozdrabnianiaprocedura trypsynizacji

Powiązane artykuły