Artykuł metodologiczny

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

DOI:

10.3791/59433

⸱

23 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowa agregacja białka tau jest patogennie zaangażowana w wiele chorób neurodegeneracyjnych, w tym chorobę Alzheimera (AD). Chociaż mysie modele tauopatii dostarczyły cennego źródła do badania neurotoksycznych mechanizmów zagregowanego tau, staje się coraz bardziej oczywiste, że ze względu na międzygatunkowe różnice w neurofizjologii, mózg myszy nie nadaje się do modelowania kondycji ludzkiej. Postępy w metodach hodowli komórkowych sprawiły, że ludzkie hodowle neuronów stały się dostępne do użytku eksperymentalnego in vitro i pomogły w opracowaniu neuroterapeutyków. Jednak pomimo adaptacji kultur ludzkich komórek nerwowych, modele ludzkiej tauopatii in vitro nie są jeszcze powszechnie dostępne. Protokół ten opisuje komórkowy model agregacji tau, w którym ludzkie neurony są transdukowane wektorami pochodzącymi z lentiwirusa, które kodują patogennie zmutowane tau połączone z reporterem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP). Transdukowane kultury wytwarzają agregaty tau, które barwią się dodatnio dla tioflawiny i wykazują markery neurotoksyczności, takie jak zmniejszona długość aksonów i zwiększona objętość lizosomów. Procedura ta może być użytecznym i opłacalnym modelem do badania ludzkich tauopatii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patologiczna agregacja białka tau związanego z mikrotubulami jest cechą charakterystyczną wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym AD, otępienia czołowo-skroniowego (FTD), choroby Picka i postępującego porażenia nadjądrowego (PSP)1. W stanie niechorobowym tau wiąże się i stabilizuje włókna mikrotubul w aksonach neuronalnych2. Jednak związana z chorobą hiperfosforylacja tau sprzyja agregacji tau, dysocjacji od mikrotubul i toksyczności neuronalnej3. Toksyczne działanie zagregowanego tau może obejmować nieprawidłową aktywację cholinergicznego4 i receptorów glutaminergiczne5, co prowadzi do rozregulowania wewnątrzkomórkowego wapnia i ostatecznie do śmierci komórki. W modelach zwierzęcych zmniejszenie tau w mózgu poprawia patologię u myszy z AD6 oraz w mysich modelach powtarzających się łagodnych urazowych uszkodzeń mózgu7.

Coraz więcej dowodów pokazuje, że struktura i powinowactwo wiązania tau pochodzącego od myszy różnią się od tau pochodzącego od człowieka i że tau myszy nie nadaje się do modelowania ludzkich tauopatii8. Jednak modele tauopatii komórek ludzkich nie są powszechnie dostępne na rynku. Ogólnym celem tej pracy jest opisanie modelu agregacji tau in vitro, w którym ludzkie neurony są transdukowane wektorami pochodzącymi z lentiwirusa zawierającymi zmutowane ludzkie konstrukty tau9. Agregacja Tau powodująca konstrukty lentiwirusowe koduje domenę powtórzeń tau zawierającą mutacje P301L i V337M połączone z reporterem YFP (Tau-RDLM-YFP), podczas gdy kontrola konstruuje kod dla domeny powtórzeń tau typu dzikiego (Wt) połączonej z reporterem YFP (Tau-Wt-YFP). Kultury neuronalne transdukowane tą metodą wyrażają około dziewięć razy więcej tau niż kultury nietransdukowane. Chociaż ilość nadekspresji tau jest mniej więcej równa między komórkami transdukowanymi Tau-RDLM-YFP i Tau-Wt-YFP, tylko neurony transdukowane Tau-RDLM-YFP wykazują agregacje. Kultury transdukowane Tau-RDLM-YFP barwią się dodatnio dla tioflawiny i wykazują zmniejszenie długości aksonów i gęstości synaptycznej. Dlatego ten model komórkowy może być użytecznym narzędziem do badania agregacji tau in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

  1. Rozmrozić powłokę matrycy błony podstawnej dla płytek hodowlanych w temperaturze 4 °C (nie dopuścić do rozgrzania się matrycy membrany podstawnej, ponieważ spowoduje ona zestalenie). Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C lub -70 °C.
  2. Rozpuść zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w stężeniu 10 μg/ml i przygotuj 10 μl podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Do nowej, nieotwartej, 500 ml butelki DMEM/F12 z glutaminą dodaj B27 (10 ml), N2 (5 ml) i penicylinę-streptomycynę (5 ml). Umieść 50 ml tej pożywki z nerwowych komórek macierzystych (NSC) w stożkowej probówce i dodaj 10 μl 10 μg/μL (2 μg/ml final) bFGF. Przechowywać pożywkę NSC (+)bFGF w temperaturze 4 °C.
  4. Aby zrobić pożywkę (-)bFGF, użyj tej samej receptury, jak opisano w kroku 1.3, ale nie dodawaj bFGF. Pożywka ta zostanie wykorzystana do różnicowania NSC do neuronów i do utrzymania kultur neuronalnych po różnicowaniu.

2. Konstrukty lentiwirusowe

UWAGA: Zanim rozpoczniesz pracę z konstruktami lentiwirusowymi, upewnij się, że laboratorium zostało zatwierdzone do stosowania środków o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Ponadto podczas pracy z wektorami lentiwirusowymi należy stosować kaptury hodowlane BSL-2, środki ochrony osobistej (PPE) i metody utylizacji.

  1. Uzyskaj konstrukty tau spakowane w lentiwirusa z preferowanego źródła (zobacz Sanders et al.10 dla informacji o konstrukcie).

3. Hodowla ludzkich nerwowych komórek macierzystych

UWAGA: NSC są zazwyczaj wysiewane po 100 000–150 000 komórek/cm2, a większość dostępnych na rynku NSC jest sprzedawana jako 1 x 106 komórek/fiolkę. Protokół ten został zoptymalizowany dla 10-centymetrowych naczyń do hodowli komórkowych (chociaż można stosować inne rozmiary szalek); w związku z tym, jeśli stosowane są dostępne na rynku NSC, może być konieczne rozszerzenie NSC poprzez uprzednie wyhodowanie w sześciodołkowych szalkach, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do zasiania 10-centymetrowych szalek. Protokół ten może być alternatywnie dostosowany do różnych rozmiarów naczyń do hodowli komórkowych (ale nie zawiera instrukcji dotyczących przechodzenia NSC, ponieważ te protokoły są dostępne gdzie indziej11,12).

  1. W celu przygotowania płytek do hodowli komórkowych należy usunąć jedną podwielokrotność zamrożonej powłoki macierzy błony podstawnej dla płytek do hodowli komórkowych i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze 4 °C (podwielokrotności można umieścić w temperaturze 4 °C na noc w dniu poprzedzającym wysiewanie komórek). Dodać 385 μl powłoki macierzy błony podstawnej do 5 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna.
    UWAGA:     5 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna wystarcza do pokrycia pojedynczego 10-centymetrowego naczynia (1 ml tego roztworu do powlekania macierzy błony podstawnej wystarcza do pokrycia jednego dołka z sześciodołkowego naczynia). Alternatywnie, jeśli komórki mają być utrwalone i wybarwione immunologicznie lub wybarwione na tioflawinę, hoduj komórki na szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych szalkach hodowlanych.
    1. Utrzymuj pożywkę i powłokę matrycy w niskiej temperaturze przed i podczas dodawania ich do naczyń hodowlanych. Dodać powłokę macierzy błony podstawnej do szalek hodowlanych i umieścić płytki w inkubatorze (w temperaturze 37 °C) na 1 godzinę. W celu uzyskania optymalnego powlekania nie należy inkubować macierzy błony podstawnej dłużej niż lub krócej niż 1 godzinę. Po 1 godzinie odessać powłokę macierzy błony podstawnej z szalek kultur komórkowych. Upewnij się, że zbiega się to w czasie z przygotowaniem NSC do platerowania.
      nuta: Jeśli komórki nie są rozmrażane z zamrożonych zapasów, pomiń krok 3.2 i przejdź do kroku 3.3.
  2. Jeżeli komórki są rozmrażane z zamrożonych zapasów NSC, należy pobrać fiolkę z zamrożonymi komórkami i ogrzać ją w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 37 °C, przesuwając fiolkę w przód i w tył w wodzie. Po rozmrożeniu spryskaj fiolkę 70% etanolem i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowych. Przenieś komórki do ~10 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przy 1,000 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce NSC.
  3. Rozcieńczyć komórki w pożywce NSC, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu dla używanego naczynia do hodowli komórkowych.
    nuta: Na przykład, jeśli NSC są posiewane na sześciodołkowej płytce - jedna studzienka na sześciodołkowej szalce hodowlanej ma powierzchnię 9 cm2 - do wysiewu potrzeba od 900 000 do 1 350 000 komórek. Tak więc jedna fiolka zawierająca 1 000 000 komórek może być ponownie zawieszona w 2 ml pożywki i dodana do pojedynczego dołka sześciodołkowego naczynia.
  4. Dodaj wystarczającą ilość komórek zawieszonych w pożywce NSC, aby wysiać szalki hodowlane pokryte matrycą błony podstawnej (100 000 komórek/cm2) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień (jeśli używasz zamrożonego bulionu, zmieniaj pożywkę dzień po posiewaniu, a następnie co drugi dzień). Hoduj komórki, aż będą zlewać się w 75%–80%.
    nuta: Komórki prawdopodobnie osiągną 75%-80% konfluencji wkrótce po posiewaniu, ale może to potrwać dłużej, jeśli używane są zamrożone zapasy.
  5. Gdy NSC zlewają się w 75%-80%, rozpocznij różnicowanie neuronów, usuwając pożywkę NSC (+)bFGF i zastępując ją pożywką NSC (-)bFGF. Hodować komórki w tej pożywce (wymieniając pożywkę co drugi dzień) przez co najmniej 4 tygodnie.
    nuta: Komórki będą się dzielić przez kilka dni po wycofaniu bFGF; W związku z tym komórki mogą osiągnąć 90–100% konfluencji. Po 4 tygodniach hodowli komórki osiągną neuronalny los i będą gotowe do leczenia lentiwirusem.

4. Transdukcja i utrzymanie kultur neuronalnych

  1. Aby transdukować neurony za pomocą lentiwirusa, użyj liczby mian 3,4 x 105 jednostek transdukowalnych / komórkę (100% zlewająca się 10-centymetrowa miska będzie zawierała ~10 milionów neuronów). Rozcieńczyć jednostki transdukowalne do wymaganego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych i dodać je do komórek (użyć normalnej objętości pożywki do naczynia do hodowli komórkowych). Dwa dni po dodaniu lentiwirusa umyj komórki 1x świeżą pożywką (-)bFGF (bez lentiwirusa) i kontynuuj hodowlę w pożywce (-)bFGF jak zwykle.
  2. W przypadku leczenia po lentiwirusie należy karmić transdukowane neurony, zmieniając pożywkę do hodowli komórkowej ([-]pożywkę bFGF) co drugi dzień. Utrzymuj komórki przez ~ 8 tygodni po transdukcji. Rutynowo wizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby zapewnić żywotność.
    nuta: Rzadkość lub pęknięcia dendrytyczne są oznakami, że komórki nie są już zdolne do życia.

5. Obrazowanie komórek

  1. Obrazowanie żywych komórek
    1. Po transdukcji (4 dni po dodaniu lentiwirusa) obserwuj sygnały YFP pod mikroskopem fluorescencyjnym zdolnym do obrazowania żywych komórek. Wyjmij szalki z kultur komórkowych z inkubatora i upewnij się, że studzienki hodowlane pozostają sterylne, trzymając pokrywkę na szalkach hodowlanych. Wizualizacja komórek za pomocą obiektywu 10x o długości fali wzbudzenia ~514 nm i filtrze emisyjnym ~527 nm.
      nuta: Agregaty są zwykle widoczne w transdukowanych hodowlach komórkowych 6–8 dni po zastosowaniu lentiwirusa.
  2. Barwienie komórek utrwalonych (znakowanie β-tubuliną III i barwienie tioflawiną)
    1. Aby utrwalić komórki w paraformaldehydzie (PFA), usuń pożywkę hodowlaną z transdukowanych neuronów wyhodowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Przemyj komórki 1x PBS, usuń płukanie i dodaj 300–500 μl (jeśli używasz płytek 24-dołkowych) 4% PFA (rozcieńczonego w PBS) do szkiełek nakrywkowych przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i umyj szkiełka nakrywkowe 2x PBS.
    2. Przygotować roztwór blokujący składający się z PBS, 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,3% Triton X-100. Dodać 300–500 μl roztworu do studzienek i inkubować szkiełka nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Po 2 godzinach rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (w stężeniu przeciwciał 1:500) w roztworze blokującym i dodać 300–500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Umieść talerz na kołyszącej się lub obracającej się platformie (z małą prędkością) na noc w temperaturze 4 °C.
    3. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyj szkiełka nakrywkowe 3x przez 5 minut każdy PBS. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w blokującym roztworze buforowym (o stężeniu 1:1 000) i dodać roztwór przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Wybierz odpowiednie przeciwciało drugorzędowe za pomocą znacznika fluorescencyjnego, który nie nakłada się na sygnał YFP (na przykład CY-3). Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na kołyszącej się lub obracającej się platformie. Po 2 godzinach usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć szkiełka nakrywkowe 3x po 10 minut za pomocą PBS.
    4. Myć szkiełka nakrywkowe w podwójnie dejonizowanej wodzie (DDW) przez 10 minut. Usunąć DDW i dodać 300 μl/studzienkę 0,015% tioflawiny-S rozcieńczonej w 50% etanolu przez 10 minut. Usunąć roztwór tioflawiny i umyć szkiełka nakrywkowe 2x po 4 minuty 50% etanolem, a następnie jedno 4-minutowe płukanie 30% etanolem i dwa płukania po 5 minut każde 30% etanolem. Umyj szkiełka nakrywkowe 1x DDW przed montażem.
      nuta: Barwienie tioflawiną opisane w kroku 5.2.4 jest fakultatywne.
    5. Aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych, umieść pojedynczą kroplę nośnika montażowego po stronie "+" szkiełka podstawowego. Usuń cały płyn z dołka zawierającego szklane szkiełko nakrywkowe i za pomocą drobnych kleszków ostrożnie usuń szklane szkiełko nakrywkowe, śledząc, po której stronie znajdują się hodowane komórki.
    6. Delikatnie dociśnij krawędź szkiełka nakrywkowego do Kimwiste, aby usunąć nadmiar wilgoci. Nadal chwytając szkiełko nakrywkowe cienkimi kleszkami, przyłóż krawędź (stroną z ogniwem skierowaną w stronę spadku nośnika montażowego) szkiełka nakrywkowego do nośnika montażowego, a następnie delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym (umieszczając hodowane komórki w podłożu montażowym i umieszczając je między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym). Pozwól nośnikowi montażowemu stwardnieć przez 30 minut przed obrazowaniem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    7. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i odpowiednich widm wzbudzenia/emisji (YFP = ~514/527 nm, CY-3 = ~555/568 nm i tioflawina S = ~390/426 nm).

6. Metody opcjonalne

  1. Co 2 dni zbierać kondycjonowane podłoża z kultur i przechowywać je w temperaturze -20 °C do przyszłych analiz gatunków tau uwolnionych przez kultury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony transdukowane Tau-RDLM-YFP były fluorescencyjnie oznaczone YFP, a kultury transdukowane RDLM wyświetlały agregaty po transdukcji. Inkluzje te wybarwione na obecność tioflawiny (Ryc. 1). Jak pokazuje Rysunek 1, protokół ten wytwarza hodowle neuronów, które wykazują tioflawinowo-dodatnie agregaty tau. W początkowych eksperymentach zaleca się potwierdzenie różnicowania neuronów poprzez immunoznakowanie specyficznego dla neuronu markera β-tubuliny III w hodowlach. Co ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje generowanie modelu ludzkiej tauopatii in vitro, który wykazuje agregaty dodatnie do barwienia srebra i splątki neurofibrylarne tioflawinowo-dodatnie (NFT). Co więcej, transdukowane komórki wykazują patologie wywołane przez tau, takie jak defekty morfologiczne, zmniejszona synaptogeneza i zwiększona objętość lizosomów. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia on dostępny i opłacalny model tauopatii neuronalnej, który może być wykorzystany do badań przesiewowych leków, a także do analizy toksy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Peterowi Daviesowi z Albert Einstein College of Medicine za dostarczenie przeciwciał PHF-1 i CP13 oraz dr Marc Diamond z University of Texas, Southwestern, za dostarczenie konstruktów tau. Praca ta była wspierana przez granty Stowarzyszenia Alzheimera (NIRG-14-322164) dla S.H.Y. oraz z Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (TB1-01193) dla PR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia hodowlane 10 cmThermofisher12556002
probówki 15 mlBiopioneerCNT-15
16% paraformaldehydThermofisher50-980-487
24-dołkowe płytki hodowlaneThermofisher930186
probówki 50 mlBiopioneerCNT-50
70% etanol w butelcez rozpylaczemRóżne źródłaNA
suplement B27Thermofisher17504044
Macierz błony podstawnej (Matrigel)Corning356231
Basic FGFBiopioneerHRP-0011
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
Inkubator do hodowli komórkowychRóżne źródłaNA
WirówkaRóżne źródłaNA
Pożywki hodowlane DMEM-F12 z glutaminąThermofisher10565042
Etanol (stężenie 50% lub wyższe)Różne źródłaNA
Przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnieRóżne źródła, zależne od eksperymentuNA
Mikroskop fluorescencyjnyRóżne źródłaNA
Szkiełka nakrywkowe szklaneThermofisher1254581
Szkiełka szklaneThermofisher12-550-15
Ludzkie nerwowe komórki macierzysteRóżne źródłaNA
Wektory lentiwirusoweRóżne źródłana zamówienie
Media montażoweSuplement ThermofisherP36934
N2Thermofisher17502048
Penicylina-StreptomycynaThermofisher15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermofisher14190250
Przeciwciała pierwszorzędoweRóżne źródła, zależne od eksperymentuNA
Platforma kołysząca lub obrotowaRóżne źródłaBRAK Sterylny
kapturdo hodowli komórkowychRóżne źródłaNA
Tioflavin SSigmaT1892-25G
Triton X-100ThermofisherBP151-100
Łaźnia wodnaRóżne źródłaNA
: niestandardowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  3. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
  6. DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).
  8. Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
  9. Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).
  12. Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).
  13. Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).
  14. Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

transdukcja lentiwirusowamikroskopia fluorescencyjnabarwienie tioflawindegeneracja aksonalnaobj to lizosom wbeta tubulina IIIr nicowanie neuronalnepo ywki do hodowli kom rkowej

Powiązane artykuły