Artykuł metodologiczny

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

DOI:

10.3791/59434

⸱

3 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W procesie rozwoju, embriony wykazują niezwykłą zdolność do dopasowywania swojego wzorca ciała do rozmiaru ciała; ich proporcje ciała są zachowane nawet w zarodkach, które są większe lub mniejsze, w pewnych granicach. Chociaż zjawisko skalowania przyciąga uwagę od ponad stu lat, zrozumienie mechanizmów leżących u jego podstaw jest ograniczone, częściowo z powodu braku ilościowego opisu dynamiki rozwoju zarodków o różnych rozmiarach. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy nową technikę chirurgicznego zmniejszania rozmiaru zarodków danio pręgowanego, która ma ogromne zalety w obrazowaniu na żywo in vivo. Wykazaliśmy, że po zrównoważonym usunięciu komórek i żółtka w stadium blastuli w oddzielnych etapach, zarodki mogą szybko odzyskać siły w odpowiednich warunkach i rozwinąć się w mniejsze, ale poza tym normalne zarodki. Ponieważ technika ta nie wymaga specjalnego sprzętu, można ją łatwo dostosować i wykorzystać do badania szerokiego zakresu problemów związanych ze skalowaniem, w tym niezawodności wzorców za pośrednictwem morfogenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naukowcy od dawna wiedzą, że embriony mają niezwykłą zdolność do tworzenia stałych proporcji ciała, chociaż rozmiar zarodka może się znacznie różnić zarówno w warunkach naturalnych, jak i eksperymentalnych1,2,3. Pomimo dziesięcioleci badań teoretycznych i eksperymentalnych, ta odporność na zmienność wielkości, określana jako skalowanie, i jej mechanizmy leżące u jej podstaw pozostają nieznane w wielu tkankach i narządach. Aby bezpośrednio uchwycić dynamikę rozwijającego się systemu, opracowaliśmy powtarzalną i prostą technikę zmniejszania rozmiaru w grybona4, która ma wielką zaletę w obrazowaniu na żywo in vivo5.

Danio pręgowany służył jako modelowy kręgowiec do badania wielu dyscyplin biologii, w tym biologii rozwojowej. W szczególności danio pręgowany jest idealny do obrazowania na żywo in vivo6, ponieważ: 1) rozwój może przebiegać normalnie poza matką i skorupką jaja, oraz 2) zarodki są przezroczyste. Ponadto zarodki mogą wytrzymać pewne wahania temperatury i środowiska, co pozwala na ich badanie w warunkach laboratoryjnych. Ponadto, oprócz konwencjonalnych zaburzeń ekspresji genów poprzez wstrzykiwanie morfolina i mRNA7,8, ostatnie postępy w technologii CRISPR/Cas9 sprawiły, że genetyka odwrotna u danio pręgowanego jest bardzo wydajna9. Ponadto można zastosować wiele klasycznych technik embriologicznych, takich jak przeszczep komórek lub chirurgia tkanek4,10,11.

Techniki zmniejszania rozmiaru zostały pierwotnie opracowane u i innych zwierząt niebędących kręgowcami12. Na przykład w Xenopus laevis, innym popularnym modelu kręgowców zwierzęcych, bisekcja wzdłuż osi zwierzęco-roślinnej w stadium blastuli może prowadzić do powstania zarodków o zmniejszonych rozmiarach12,13. Jednak w naszych rękach to jednoetapowe podejście skutkuje zarodkami grzbietowymi lub brzusznymi u danio pręgowanego, prawdopodobnie dlatego, że determinanty grzbietowe są rozmieszczone nierównomiernie i nie można poznać ich lokalizacji na podstawie morfologii zarodków. Tutaj demonstrujemy alternatywną dwuetapową technikę siekania danio pręgowanego, która wytwarza normalnie rozwijające się, ale mniejsze zarodki. Dzięki tej technice komórki są najpierw usuwane z bieguna zwierzęcego, obszaru naiwnych komórek pozbawionych aktywności organizatora. Aby zrównoważyć ilość żółtka i komórek, co jest ważne dla epibolii i późniejszej morfogenezy, żółtko jest następnie usuwane. Tutaj szczegółowo opisujemy ten protokół i podajemy dwa przykłady niezmienności wielkości w tworzeniu formacji; tworzenie somitów i wzorce brzusznej cewy nerwowej. W połączeniu z obrazowaniem ilościowym wykorzystaliśmy technikę zmniejszania rozmiaru, aby zbadać, w jaki sposób rozmiary somitów i cewy nerwowej wpływają na zarodki o zmniejszonej wielkości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z rybami zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Harvard Medical School.

1. Przygotowanie narzędzi i odczynników

  1. Zrób drucianą pętlę, aby posiekać zarodki
    1. Weź 20 cm drutu ze stali nierdzewnej, który jest sztywny i nie powoduje korozji o średnicy 40 μm. Przełóż drut do szklanej kapilary (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm, bez żarnika), tworząc małą pętlę u góry (długość pętli wynosi 1,0 mm)
    2. Umieść małą kroplę przezroczystego lakieru do paznokci na końcówce szklanej kapilary między drucianą pętlą, aby utrzymać ją na miejscu. Pozostaw do wyschnięcia. Uważaj, aby nie nałożyć lakieru do paznokci na część pętelkową, ponieważ może to uszkodzić zarodki.
    3. Przymocuj szklaną kapilarnę z pętlą do drewnianej pałeczki (9-calowe bambusowe jednorazowe pałeczki złamane na pół) za pomocą taśmy laboratoryjnej. Pozostaw około 2,5 cm szklanej kapilary wystającej poza pałeczkę, aby pałeczka nie zanurzała się w wodzie. Dostosuj tę długość do preferencji.
  2. Alternatywnie zrób szklaną igłę do siekania zarodków
    1. Ściśnij jeden koniec szklanej pipety Pasteura kleszczami, trzymając drugą stronę ręką. Podgrzej cienką część pipety nad lampą spirytusową lub palnikiem Bunsena.
    2. Pociągnij ręcznie szklaną pipetę. Idealna pipeta o średnicy około 30 μm i łagodnym łuku (promień krzywizny = około 5 mm). Odpowiednią średnicę i krzywiznę uzyskuje się przy wprawie i pewnym przypadku.
  3. Przygotować metylocelulozę
    1. Metyloceluloza służy do przytrzymywania zarodków podczas siekania. Przygotować 2% roztwór metylocelulozy w 1/3x roztworze Ringera (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2 i 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES; pH 7,2)). Wstrząsnąć proszkiem metylocelulozy w 1/3x roztworze Ringera w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Opcjonalnie dodaj ~1,5 ml czerwieni fenolowej (0,5% w roztworze podstawowym DPBS) do 10 ml 2% roztworu metylocelulozy, aż do uzyskania czerwieni, aby roztwór był widoczny. Potrząśnij nim, aż kolor stanie się jednolity.

2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do chirurgicznego zmniejszenia rozmiaru

  1. Zbieraj zarodki
    1. Umieść jednego lub dwóch samców i jedną lub dwie samice danio pręgowanego w komorze godowej wypełnionej dużą ilością wody. Oddziel samce i samice za pomocą plastikowej przegrody. Użyj linii AB do obrazowania somitów (sekcja 4) i transgenicznej linii reporterowej wzorca cewy nerwowej (nkx2.2:mem-gfp, dbx1b:gfp lub Olig2:dsred) do obrazowania cewy nerwowej. Pozostaw je w komorze na noc.
      nuta: Wybór dorosłych osobników jest ważny dla uzyskania komórek jajowych, które dobrze przetrwają operację. Zazwyczaj młode, zdrowe samice produkują zdrowe jaja.
    2. Następnego ranka przenieś komorę do płytkiej wody i umieść komorę z lekkim przechyleniem. Usuń przegrodę, aby ryba mogła się kojarzyć.
    3. Zbierz jajka, wlewając je do sitka do herbaty. Przenieś jajka na szalkę Petriego z wodą jajeczną (na 20x woda jajeczna, 6 g soli morskiej instant, 1,5 gCaSO4 i 1 L H2O; stosować 1x). Aby uzyskać lepszą inscenizację, zbierz jaja zaraz po tarle. Umieścić zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
    4. Jeśli to konieczne, wstrzyknij morpholino, mRNA itp., w 1-4 stadiach komórkowych zgodnie ze wspólnym protokołem7,8. Wstrzyknąć mRNA do fluorescencyjnego znacznika błonowego (mem-mCherry, mem-mBFP1 lub mem-mCitrine) do obrazowania cewy nerwowej (sekcja 5).
  2. Dechorionate za pomocą pronazy
    1. Wokół stadium od 128 do 256 komórek przenieś zdrowe zarodki do szklanego naczynia o średnicy 35 mm wypełnionego wodą jajeczną. Usuń jak najwięcej wody jajecznej z naczynia
      2. .
    2. Dodać 1 ml 20 mg/ml pronazy. Delikatnie obracaj zarodki, przesuwając płytkę i delikatnie pipetuj roztwór w górę iw dół, aby wspomóc dechorionację za pomocą szklanej pipety.
    3. Gdy kosmówka zaczyna tracić elastyczność (zwykle 1-4 minuty po dodaniu pronazy, w zależności od ilości jaj i wody), dodaj jak najwięcej wody jajecznej, aby rozcieńczyć pronazę. Oceń utratę elastyczności, delikatnie dotykając kosmówki kleszczami; kosmówka powinna utrzymywać wgniecenie bez natychmiastowego odbijania się do tyłu. Przenieś jajka do innego naczynia z wodą jajeczną za pomocą szklanej pipety (w tym momencie większość kosmówki nie jest złamana).
      1. Alternatywnie, delikatnie wlej zarodki z naczynia do dużej szklanej zlewki o pojemności 400 ml wypełnionej wodą jajeczną, nie wystawiając zarodków na działanie powietrza. Następnie pozwól zarodkom całkowicie się uspokoić. Przechylić zlewkę, aby zarodki opadły na bok. Zbierz te zarodki za pomocą szklanej pipety i przenieś do nowego szklanego naczynia o średnicy 35 mm wypełnionego 1/3x roztworem Ringera.
    4. Odczekaj kilka minut, aż większość kosmówki całkowicie straci elastyczność. Usuń pozostałą kosmówkę z zarodków, delikatnie pipetując komórki jajowe. Usunąć uszkodzone zarodki i inkubować je w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

3. Chirurgiczne zmniejszenie rozmiaru i rekonwalescencja

  1. Przygotuj jedno czyste naczynie ze szkła o średnicy 35 mm. Rozprowadź około 0,5 ml 2% metylocelulozy (w 1/3x roztworze Ringera, z czerwienią fenolową dla ułatwienia wizualizacji) w pobliżu środka dna większego naczynia za pomocą plastikowej szpatułki. Cienko i równomiernie rozprowadzić metylocelulozę na grubość około 0,5 mm.
  2. Wlej około 30 ml 1/3x roztworu Ringera na bok naczynia i pozostaw do rozprowadzenia na resztę naczynia, przykrywając metylocelulozą.
  3. Umieść zdekorionowane zarodki w stadium 256 komórek-1k komórek na 2% metylocelulozie. Dostosuj orientację zarodków na bok, aby uwidocznić zarówno komórki, jak i żółtko. (Rysunek 1)
  4. Odetnij około 30%-40% komórek z blastodermy w pobliżu słupa zwierzęcego, przecinając prostopadle do osi zwierzę-roślina za pomocą drucianej pętli (lub szklanej igły) (Rysunek 1, górne panele). Po usunięciu komórek delikatnie postukaj końcami o siebie, aby pozostałe komórki przykleiły się z powrotem. W ciągu kilku minut martwe komórki powinny złuszczyć się, gdy zarodek zacznie się goić.
  5. Zrób małą ranę na żółtku w pobliżu bieguna roślinnego zamiast "siekać" żółtko (Rysunek 1 środkowe panele). Zwiń żółtko, nacinając błonę jaja zamontowanym drutem. Żółtko będzie sączyć się przez kilka minut po zranieniu, a następnie rana się zagoi (Rysunek 1 dolne panele).
  6. Kiedy żółtko przestanie wyciekać, przenieś zarodek za pomocą pipety na zewnątrz metylocelulozy w tym samym naczyniu, aby umożliwić im lepszą regenerację.
  7. Powtórzyć kroki 3.4-3.6 dla wszystkich zarodków. Pozostaw naczynie stabilne na 30 minut, aż zarodki dojdą do siebie.
  8. Przenieś zarodki do nowego naczynia ze świeżym 1/3x roztworem Ringera i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C, aby mogły całkowicie wyzdrowieć.
    1. (Opcjonalnie) Jeżeli etap zainteresowania jest wczesnym stadium somitowym, zarodki mogą być inkubowane w temperaturze 20 °C po inkubacji w temperaturze 28,5 °C aż do etapu tarczy, w celu dostosowania czasu do eksperymentów i obrazowania.

4. Obrazowanie na żywo somitogenezy danio pręgowanego

  1. Przygotuj 100 ml 1% roztworu agarozy, dodając 1 g agarozy do 100 ml wody jajecznej, podgrzewając aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Pozostawić do ostygnięcia na 5-10 minut do temperatury 62-72 °C.
  2. Przygotuj montaż do obrazowania.
    UWAGA:     Ten przewodnik został opracowany do użytku z odwróconym mikroskopem szerokokątnym.
    1. Wlej ~15 ml 1% agarozy do plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm.
    2. Delikatnie umieść szablon formy do montażu grzbietowego V15 na dnie szalki Petriego. Trzymaj formę na dnie, używając ciężarka, takiego jak tubka 15 ml z wodą.
      nuta: Dzieje się tak, aby zarodki znajdowały się jak najbliżej dna szalki Petriego, podczas korzystania z odwróconego mikroskopu. Chociaż zarodki są montowane bocznie w celu obrazowania somitów, tutaj stosuje się metodę grzbietową V15, ponieważ lepiej utrzymuje zarodki we wczesnych stadiach somitu.
    3. Ostudzić, aż agaroza całkowicie się zestali. Wlej ~30 ml wody jajecznej z 0,01% tricainą i ostrożnie usuń pleśń, delikatnie podważając kleszczami.
  3. Zamontuj zarodki do obrazowania somitów
    1. Przygotuj 1% niskotopliwą agarozę w 1/3x roztworze Ringera (lub wodzie jajecznej) i utrzymuj w temperaturze 42 °C. Poczekaj, aż temperatura spadnie do 42 °C.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść jeden zarodek na studzienkę. Odpipetować około 1 μl niskotopliwej agarozy do studzienki, aby dokładnie dostosować wielkość studzienki do wielkości poszczególnych zarodków, które różnią się wielkością, zwłaszcza między tymi z zmniejszoną wielkością i bez niej.
    3. Szybko zorientuj zarodki, zanim niskotopliwa agaroza zestali się, tak aby zarodki były skierowane całkowicie bokiem do naczynia. Po zamontowaniu zarodków delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe w uchwycie agarozowym, aby utrzymać zarodki na miejscu. Orientacja jest szczególnie ważna w przypadku długoterminowego obrazowania somitowego, ponieważ zarodki muszą być dokładnie zamontowane z boku, aby wszystkie granice somitów były wyraźnie zobrazowane na późniejszych etapach.
    4. Zanurz się z dala od obszaru montażowego i manipuluj szkłem nakrywkowym o wymiarach 25 mm x 25 mm tak, aby było przesunięte o 45 stopni w stosunku do orientacji kwadratowego wcięcia utworzonego przez formę. Nasuń szkiełko nakrywkowe na formę w tej orientacji, aż każdy róg będzie opierał się o inną stronę formy.
      nuta: Chociaż protokół ten dotyczy mikroskopu odwróconego, umieszczenie szkła nakrywkowego na wierzchu formy jest nadal ważne, aby zarodki nie poruszały się podczas przenoszenia do mikroskopu.
  4. Obrazowanie procesu powstawania somitów
    1. Rozgrzej mikroskop do temperatury 28 °C w inkubatorze zbudowanym z płyt piankowych i grzałki szafkowej.
    2. Umieścić szalkę Petriego z zamontowanymi zarodkami na stoliku mikroskopowym. Znajdź zarodek zamontowany w lewym górnym dołku mocowania agarozy z soczewką o mniejszym powiększeniu, a następnie przełącz obiektyw na 10x.
    3. Konfigurowanie pobierania obrazów.
      nuta: Ta instrukcja dotyczy jasnego pola.
    4. Znajdź warunki dla mocy światła, czasu ekspozycji i kondensatora, aby granica somitów była wyraźnie widoczna. Korzystając z ustawień z-stack, ustaw najniższą i najwyższą żądaną płaszczyznę obrazowania. Ustaw całkowity czas i przedział czasu. Znajdź i zarejestruj pozycje xy wszystkich zamontowanych zarodków, aby można było wykonać zdjęcie poklatkowe wielu zarodków jednocześnie.
  5. Zmierz długość PSM i somitów za pomocą Fiji16.

5. Obrazowanie wzorców cewy neuronowej

  1. Przygotuj 100 ml 1% roztworu agarozy, dodając 1 g agarozy do 100 ml wody jajecznej, podgrzewając aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Pozostaw do ostygnięcia na 5-10 minut w temperaturze 62-72 °C. Ustaw tricainę na 0,01%.
  2. Przygotuj mocowanie grzbietowe do obrazowania.
    UWAGA:     Ten przewodnik został opracowany do użytku z pionowym mikroskopem fluorescencyjnym. W przypadku mikroskopów odwróconych konieczne są płytki dolne szkiełka nakrywkowego, a orientacja montażu w kroku 3 jest odwrócona.
    1. Wlej ~15 ml 1% agarozy do plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Delikatnie unieś formę do montażu grzbietowego V1 na powierzchni agarozy, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza. Ostudzić, aż agaroza całkowicie się zestali.
    2. Ostrożnie usuń pleśń kleszczami lub żyletką. Napełnij naczynie wodą jajeczną z 0,01% tricainą i przykryj do użycia.
  3. Zamontuj zarodki do obrazowania cewy nerwowej.
    1. Pozwól transgenicznym lub wstrzykniętym zarodkom fluorescencyjnym o zmniejszonej wielkości i kontrolnym rozwijać się do etapu 20-25 somitów (około 18-22 godzin po zapłodnieniu). Do obrazowania wykorzystuje się zarodki wykazujące ekspresję fluorescencyjnego znacznika błonowego (mem-mCherry, mem-mBFP1 lub mem-mCitrine) oraz transgeniczny reporter wzorca cewy nerwowej (nkx2.2:mem-gfp, dbx1b:gfp lub Olig2:dsred).
    2. Zastąp pożywkę z wodą jajową w przygotowanym wierzchowcu grzbietowym 0,01% roztworem roboczym tricainy. Delikatnie pipetować zarodki, które mają być zobrazowane w dołkach mocowania grzbietowego.
    3. Manipuluj zarodkami w prawidłowej orientacji tak, aby głowa była skierowana do przodu w wierzchowcu, a ogon był skierowany do tyłu, a część grzbietowa była skierowana w stronę powierzchni wody.
    4. Ustaw zarodek tak, aby ogon leżał płasko i nie był skierowany w dół w kierunku dna naczynia. Czasami pomocne jest oparcie tylnej części ogona na bocznej półce studni montażowej, aby zapobiec zapadnięciu się ogona i przypadkowemu obrazowaniu tyłomózgowia. Powtórz te czynności dla każdego zarodka. Upewnij się, że zarodki o zmniejszonej wielkości nie wpadają zbyt głęboko do studzienek, które mają być zobrazowane.
    5. Zanurz się z dala od obszaru montażowego i manipuluj szkłem nakrywkowym o wymiarach 25 mm x 25 mm tak, aby było przesunięte o 45° w stosunku do orientacji kwadratowego wgłębienia utworzonego przez formę. Nasuń szkiełko nakrywkowe na formę w tej orientacji, aż każdy róg będzie spoczywał po innej stronie formy.
    6. Powoli obracaj szkiełko nakrywkowe, aż delikatnie opadnie na obszar montażowy. Sprawdź, czy zarodki są nadal zamontowane we właściwych pozycjach i orientacjach. Jeśli opadanie szkła nakrywkowego powoduje zbyt duży ruch, delikatnie zdejmij i powtórz montaż od kroku C.
  4. Obraz w 3D rozwijającego się rdzenia kręgowego.
    1. Delikatnie przetransportuj naczynie zawierające zamontowane zarodki do mikroskopu konfokalnego. Do długotrwałego obrazowania na żywo należy używać mikroskopu inkubacyjnego. W przeciwnym razie niskie temperatury są tolerowane.
    2. W jasnym polu oświetlonym przejdź do zarodka, aby wykonać obraz i wyśrodkować pole widzenia na preferowanej pozycji przedniej-tylnej. Aby umożliwić szczegółowe porównanie między zarodkami, pozycja ta na każdym zarodku musi być spójna.
    3. Ustaw parametry obrazowania, aby wzbudzić i przechwycić sygnał z obrazowanych białek fluorescencyjnych. Parametry można dostroić na oko, aby uzyskać pożądany obraz na początkowej próbce. Aby zapewnić spójność pomiaru, zastosuj te ustawienia do wszystkich zarodków w zestawie danych. Jeśli wymaganych jest wiele stosów z, zoptymalizuj ustawienia pod kątem szybkości.
    4. Korzystając z ustawień z-stack, ustaw najniższą i najwyższą żądaną płaszczyznę obrazowania. Aby uzyskać optymalną jakość obrazu w stosie z, ustaw rozdzielczość z na najwyższą, która jest optymalna dla ustawienia przysłony. Dobre obrazy można generować przy odstępach 1 μm.
  5. Analizuj dane obrazowania dowolną preferowaną metodą.
    nuta: W tym przypadku analiza została przeprowadzona za pomocą niestandardowych skryptów MATLAB, które umożliwiają prostą segmentację neuronalnych części obrazu i kwantyfikację sygnału obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmniejszenie objętości żółtka jest ważne dla prawidłowej morfologii
Jak niedawno opisali Almuedo-Castillo et al.17, zmniejszenie wielkości zarodków można osiągnąć bez zmniejszania objętości żółtka. Aby porównać ze zmniejszeniem objętości żółtka i bez niego, przeprowadziliśmy zarówno dwuetapowe siekanie (zarówno blastula, jak i żółtko), jak i siekanie tylko blastulą (Rysunek 2 i film uzupełniający 1). Dwuetapowe rozdrobnione zarodki wykazywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historycznie rzecz biorąc, wśród kręgowców zmniejszanie rozmiaru odbywało się głównie przy użyciu embrionów, poprzez przecięcie zarodków wzdłuż osi zwierzęco-roślinnej w stadium blastuli12. Jednak istnieją głównie dwie różnice między zarodkami żaby i danio pręgowanego, gdy dzielimy zarodki na pół. Po pierwsze, na etapie, w którym zarodki danio pręgowanego stają się tolerancyjne na przecięcie na pół (stadium blastuli), organizator znajduje się w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez program PRESTO Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JPMJPR11AA) oraz grant National Institutes of Health (R01GM107733).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
60 mm PYREX szalka PetriegoCORNING  3160-60
Agarozaaffymetrix75817Do wykonania montażu do obrazowania na żywo
Agaroza, niska temperatura żelowania Typ VII-ASIGMA-ALDRICHA0701-25G
CaCl2EMDCX0130-1Do 1/3 roztworu Ringera
CaSO4Do wody jajecznej
Szkiełko nakrywkowe (25 mm x 25 mm, Grubość 1)Jednorazowa szpatułka CORNING2845-25
VWR 80081-188
Płyta piankowaELMER'S951300Do inkubatora mikroskopowego
Forcept (nr 55)FST11255-20
Pipeta szklanaVWR14673-043
HEPESSIGMA Life ScienceH4034Do 1/3 roztworu Ringera
INCUKIT XL do inkubatorów kubowychINKUBATOR Warehouse.comDo inkubatora mikroskopowego
Sól morska instantOcean138510Do wody jajecznej
KClSIGMA-ALDRICHP4504Do 1/3 roztworu Ringera
MetylocelulozaSIGMA-ALDRICHM0387-100G
NaClSIGMA-ALDRICHS7653Do 1/3 roztworu Ringera
szalka PetriegoFalcon351029Dla wykonanie uchwytu do obrazowania na żywo
Czerwień fenolowaSIGMA Life ScienceP0290
Pompa do pipetBEL-ART PRODUCTSF37898
PronaseEMD Millipore Corp53702-250KU
Tricaine-S (MS222)WESTERN CHEMICAL INC
Ultra cienkie, jasno wyżarzane druty 316L o średnicy 0,035 mm SandraDrut, którego użyliśmy, został pozyskany ~20 lat temu i nie mogliśmy znaleźć dokładnie takiego samego. Ten produkt ma taki sam materiał i średnicę jak ten, którego używamy.
NC0135573

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217(2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113(2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394(2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zebrafish EmbryosSize Reduction TechniqueBlastula ChoppingYolk WoundingEmbryo RecoverySomite FormationNeural Tube ScalingLive ImagingMethyl CelluloseRinger Solution

Powiązane artykuły