Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjne strategie przewlekłej manipulacji aktywnością neuronalną kontrolowaną przez DREADD

DOI:

10.3791/59439

⸱

25 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms (SLCR), National Institute of Mental Health, 2Howard Hughes Medical Institute, Department of Neuroscience, Scripps Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy dwie nieinwazyjne metody chronicznego kontrolowania aktywności neuronalnej za pomocą chemogenetyki u myszy. Krople do oczu stosowano do codziennego dostarczania N-tlenku klozapiny (CNO). Opisano również dwie metody przedłużonego podawania CNO w wodzie pitnej. Te strategie przewlekłej kontroli neuronów wymagają minimalnej interwencji zmniejszającej stres zwierząt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategie chemogenetyczne okazały się niezawodnymi narzędziami do zdalnego sterowania aktywnością neuronalną. Wśród nich receptory projektanta aktywowane wyłącznie przez (DREADDs) stały się najpopularniejszym podejściem chemogenetycznym stosowanym we współczesnej neurobiologii. Większość badań dostarcza N-tlenek ligandu klozapiny (CNO) za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia dootrzewnowego, które jest odpowiednie do ostrej aktywacji/zahamowania docelowej populacji neuronów. Istnieje jednak tylko kilka przykładów strategii przewlekłej modulacji neuronów kontrolowanych przez DREADD, z których większość opiera się na wykorzystaniu systemów dostarczania wymagających interwencji chirurgicznej. W tym miejscu rozwijamy dwie nieinwazyjne strategie dostarczania ligandu CNO w celu przewlekłego manipulowania populacją neuronów u myszy. CNO podawano albo za pomocą powtarzających się (codziennie) kropli do oczu, albo przewlekle przez wodę pitną zwierzęcia. Te nieinwazyjne paradygmaty skutkują silną aktywacją receptorów projektanta, która utrzymywała się przez cały okres leczenia CNO. Opisane tutaj metody oferują alternatywę dla przewlekłej kontroli aktywności neuronalnej za pośrednictwem DREADD i mogą być przydatne w eksperymentach mających na celu ocenę zachowania u swobodnie poruszających się zwierząt, koncentrując się na mniej inwazyjnych metodach dostarczania CNO.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postęp techniczny w dziedzinie neuronauki pozwolił naukowcom na precyzyjne identyfikowanie i kontrolowanie aktywności poszczególnych populacji neuronów1. Przyczyniło się to do lepszego zrozumienia podstaw obwodów neuronalnych i ich wpływu na zachowanie zwierząt, a także do zrewidowania ustalonych dogmatów2,3. Wśród tych nowatorskich narzędzi, strategie optogenetyczne i chemogenetyczne wywarły głęboki wpływ nie tylko na jakość odkryć, ale także na sposób, w jaki eksperymenty są opracowywane i projektowane4. W niniejszym manuskrypcie skupiamy się na chemogenetycznych strategiach kontrolowania aktywacji neuronów za pomocą zmodyfikowanych strategii receptor-ligand. Receptory projektanta aktywowane wyłącznie przez (DREADDs) reprezentują jedno z najpopularniejszych narzędzi chemogenetycznych do zdalnego sterowania aktywnością neuronalną, jak to zostało sprawdzone przez Roth 20165. DREADDs wykorzystują zmodyfikowane muskarynowe receptory acetylocholiny, które są specyficznie aktywowane przez obojętny ligand, N-tlenek klozapiny (CNO)6.

Większość badań używa CNO podawanego przez iniekcje dootrzewnowe (i.p.), które skutecznie kontroluje dawkę i czas aktywacji zmodyfikowanych receptorów w ostry sposób. Jednakże, gdy wymagana jest powtarzająca się lub przewlekła aktywacja DREADD, zastosowanie wielokrotnych zastrzyków i.p. staje się niewykonalne. Aby rozwiązać ten problem, opisano różne strategie przewlekłego dostarczania CNO, w tym wszczepione minipompy7 i kaniule wewnątrzczaszkowe8,9. W różnym stopniu wszystkie te strategie powodują u zwierząt stres i ból10 i wymagają interwencji chirurgicznej, która może mieć również bezpośredni wpływ na testowane reakcje behawioralne11. W tym miejscu opisujemy trzy nieinwazyjne strategie przewlekłego dostarczania CNO.

W tym celu, myszom wstrzyknięto stereotaktycznie do hipokampa wirusa związanego z adenowirusem (AAV) kodującym zmodyfikowaną wersję pobudzającego receptora muskarynowego M3 (hM3Dq), który po aktywacji przez ligand CNO prowadzi do wybuchowego wystrzeliwania neuronów6. Wcześniej wykazano, że pojedyncza kropla do oczu zawierająca CNO może skutecznie wywołać silną aktywację neuronów wykazujących ekspresję DREADD12. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowaną metodę powtarzalnego podawania kropli do oczu. Aby osiągnąć przewlekłą i trwałą kontrolę nad receptorami projektanta, następnie opisujemy nieinwazyjną strategię dostarczania CNO myszom przez wodę pitną. Na koniec opisujemy alternatywny paradygmat dostarczania CNO do wody pitnej w ograniczonym oknie czasowym. Aktywność lokomotoryczna myszy, a także zachowania związane z piciem i spożywaniem słodkich roztworów kalorycznych, są w większości ograniczone do ciemnej części cyklu światło/ciemność13,14. Dlatego przyjęliśmy protokół oparty na preferencjach myszy do sacharozy. Mierząc indukcję natychmiastowego wczesnego genu c-Fos w komórkach zakażonych AAV, jako odczyt aktywacji neuronalnej12,15, odkryliśmy, że te strategie dostarczania CNO silnie aktywują neurony kontrolowane przez DREADD przez dłuższy czas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (NIMH). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować ból i liczbę wykorzystywanych zwierząt.

1. Zastrzyki z wirusa związanego z adenowirusem w hipokampie

UWAGA: Dzikie samce myszy o mieszanym pochodzeniu (hybryda B6/129 F1, 3 miesiące) zostały stereotaktycznie wstrzyknięte z AAV kodującym receptor muskarynowy M3 (hM3Dq) do hipokampa. Podczas całego eksperymentu myszy trzymano pojedynczo, w regularnym cyklu 12 godzin światła: 12 godzin ciemności (T24), z dostępem do pożywienia i wody ad libitum.

  1. Przed wykonaniem operacji stereotaktycznych wyczyść i wysterylizuj ramę stereotaktyczną oraz wszystkie potrzebne instrumenty.
    UWAGA: Obłożenia chirurgiczne mogą być używane do utrzymania sterylnego pola i zmniejszenia utraty ciepła przez mysz.
  2. Głęboko znieczulij mysz za pomocą izofluranu. Aby to zrobić, najpierw wyreguluj przepływomierz tlenu na około 1,5 l/min, a następnie wyreguluj parownik izofluranu na około 3-5% w przypadku indukcji i około 1-3% w celu konserwacji.
    1. Aby upewnić się, że zwierzę jest całkowicie nieprzytomne, uszczypnij łapę myszy; zwierzę jest odpowiednio znieczulane, gdy nie ma reakcji wzdrygania się na szczypanie.
  3. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać stabilność temperatury ciała myszy.
  4. Ogol czubek głowy i przymocuj głowę myszy do ramki stereotaktycznej. Następnie nałóż smar ochronny na oczy, oczyść powierzchnię, szorując powidonem i 70% etanolem, a następnie odsłoń czaszkę za pomocą sterylnego skalpela.
  5. Skalibruj ramę do punktu bregma, a następnie wywierć we współrzędnej przyśrodkowo-bocznej 2,9 mm i współrzędnej przednio-tylnej -2,7 mm, aby celować w hipokamp.
    UWAGA: Jeśli konieczne jest wstrzyknięcie innego celu mózgowego, określ pożądane współrzędne do wstrzyknięcia za pomocą atlasu myszy Paxinos i Franklina16.
  6. Po odsłonięciu mózgu jednostronnie wstrzyknąć 90 nL AAV na głębokość grzbietowo-brzuszną -3,0 mm w hipokampie za pomocą mikroiniektora i wyciągniętych pipet mikrokapilarnych (ryc. 1A).
    UWAGA: Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z mianem AAV użytym w tym eksperymencie. W przypadku innych obszarów mózgu należy w razie potrzeby dostosować objętość wstrzyknięcia AAV.
  7. Pod koniec zabiegu chirurgicznego należy zamknąć nacięcie nylonowymi szwami i nałożyć miejscowo antybiotyki na miejsce rany.
  8. Leki przeciwbólowe (buprenorfina, 0,1 mg/kg) należy podawać ogólnoustrojowo bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym i 4-6 godzin po zabiegu.
  9. Począwszy 4 tygodnie po wstrzyknięciu, poddaj myszy jednemu z paradygmatów opisanych w poniższej sekcji, aby przewlekle kontrolować neurony wyrażające projektowany receptor pobudzający.

2. Powtarzalne dostarczanie CNO za pomocą kropli do oczu

  1. Przyzwyczaj zwierzęta do obchodzenia się z nimi, szorując każdą mysz przez 3 minuty dziennie przez 3-4 dni przed podaniem kropli do oczu.
  2. Rozpuścić N-tlenek klozapiny (CNO, 5 mg) w 1 ml jałowego 0,9% roztworu soli fizjologicznej (roztwór podstawowy: 5 mg CNO/ml). Roztwór należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
  3. Zważ każdą mysz przed rozpoczęciem eksperymentu, aby określić ilość CNO, która ma zostać dostarczona. Użyj 1-3 μl kropli (na oko), aby uzyskać 1,0 mg CNO/ kg masy ciała.
    UWAGA: Na przykład mysz o wadze 20 g powinna otrzymać obustronne (po 2 μl każdy) krople do oczu.
  4. Krople do oczu należy podawać w fazie nieaktywnej (światła) myszy, 2 godziny przed wyłączeniem światła (czas zeitgeber (ZT) 10). W przypadkach, gdy CNO musi być dostarczane w aktywnej (ciemnej) fazie myszy, należy zapewnić obecność słabego czerwonego światła w celu prawidłowego obchodzenia się ze zwierzęciem.
    UWAGA: Należy podjąć środki ostrożności, aby uniknąć zakłócenia cyklu okołodobowego (i światła/ciemności) zwierząt doświadczalnych.
    1. Za pomocą mikropipety P10 załadować wymaganą ilość (1-3 μl) roztworu CNO, aby uzyskać 1,0 mg CNO/kg.
      UWAGA: Do każdej kropli do oczu należy używać nowej i sterylnej końcówki pipety. W tym zestawie eksperymentów wykonano obustronne krople do oczu CNO; jednakże, jeśli wymagane jest niższe stężenie CNO, można również zastosować jednostronne krople do oczu.
    2. Unieruchom mysz za pomocą karku.
    3. Powoli wyrzucaj roztwór, aż na końcówce pipety utworzy się stabilna kropla.
    4. Ostrożnie zbliżyć kroplę do rogówki oka myszy, aż do podania roztworu. Końcówka pipety nigdy nie powinna stykać się z okiem myszy.
    5. Zwolnij mysz, umieszczając ją z powrotem w klatce domowej.
  5. Powtarzaj tę procedurę codziennie przez 5 dni.
    UWAGA: Ten czas trwania można dostosować zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
  6. Do eksperymentów kontrolnych należy użyć myszy, którym wstrzyknięto AAV/DREADD, poddanych pozorowanemu leczeniu (krople do oczu zawierające tylko roztwór soli fizjologicznej) oraz myszy, którym wstrzyknięto pusty wektor (np. AAV/mCherry) poddane opisanemu protokołowi kropli do oczu CNO.

3. Przewlekłe leczenie CNO dostarczane za pomocą wody pitnej

  1. Przygotuj małe butelki za pomocą stożkowych probówek o pojemności 50 ml (plastikowych) i gumowych wylewek z korkiem; przykryj folią aluminiową, aby uniknąć wpływu światła na stabilność CNO.
  2. Trzy dni przed rozpoczęciem leczenia CNO zastąp zwykłe butelki z wodą małymi butelkami zawierającymi 10 ml zwykłej wody, aby myszy mogły się do nich przyzwyczaić. Przymocuj butelki do klatek za pomocą taśmy.
  3. Zmierz dzienne zużycie wody dla każdej myszy.
  4. Zważ każdą mysz przed rozpoczęciem eksperymentu.
  5. Rozpuścić N-tlenek klozapiny (CNO, 5 mg) w 1 ml 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Roztwór podstawowy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
  6. Na podstawie masy ciała i średniej ilości spożytej wody należy określić stężenie roztworu CNO, aby osiągnąć 1,0 mg CNO/kg (masa ciała).
    UWAGA: Dorosłe samce myszy (~20 g masy ciała) spożywają ~ 5 ml wody dziennie (ryc. 2A). Dlatego, aby osiągnąć stężenie CNO 1 mg CNO/kg, należy dodać 6,4 μl roztworu podstawowego CNO do końcowej objętości 8 ml wody (stężenie końcowe: 4 μg CNO/ml). Tak więc dawka CNO dla zwierzęcia o wadze 20 g, które pije 5 ml wody dziennie, daje 1 mg CNO/kg.
  7. Określ optymalną dawkę CNO, która wykazuje maksymalną skuteczność przy minimalnym stężeniu CNO, testując zakres stężeń. Przeprowadzić analizę dawka-odpowiedź, aby określić optymalną dawkę CNO dla metody wody pitnej.
    UWAGA: W tym eksperymencie przetestowano następujące dawki CNO: 1,0 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,1 mg / ml i sól fizjologiczna. Po raz pierwszy przetestowano 1,0 mg CNO/kg mc., w oparciu o protokoły IP i kropli do oczu.
  8. W dniu 1 napełnij butelkę 8 ml zwykłej wody i dodaj wymaganą ilość CNO.
    UWAGA: Taka ilość wody wystarcza na 24 godziny dostępu do wody ad libitum dla dorosłego samca myszy. W przypadku użycia innych gatunków gryzoni, najpierw zmierz ilość wody spożywanej dziennie, aby określić potrzebną objętość.
  9. Monitoruj stan zdrowia zwierząt przez cały czas trwania protokołu, aby upewnić się, że nie ma żadnych niepożądanych skutków ubocznych spowodowanych spożyciem wody + CNO.
  10. Po 24 godzinach zastąp butelki świeżą wodą + roztworem CNO. Zapisz ilość zużytą w poprzednim dniu.
  11. Roztwór woda + CNO, który nie został zużyty, należy wyrzucić do pojemników na odpady. Wyrzuć plastikowe butelki i wymieniaj gumowe korki codziennie, po ich zdezynfekowaniu zgodnie z wytycznymi zakładu dla zwierząt.
    UWAGA: Nie mieszać odpadów wodnych z rozpuszczalnikami organicznymi. Skontaktuj się z Serwisem Utylizacji Chemikaliów, aby uzyskać instrukcje dotyczące przechowywania i odbioru.
  12. Wymieniaj butelki codziennie o tej samej porze przez 5 dni.
    UWAGA: Ten czas trwania można dostosować zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
  13. Uwzględnij grupy kontrolne, zgodnie z opisem w kroku 2.6.

4. Ograniczone leczenie CNO z wykorzystaniem preferencji myszy dla sacharozy

  1. Na 3 dni przed rozpoczęciem kuracji CNO umieść małą butelkę zawierającą 10 ml wody + 1% sacharozy na klatce, najlepiej z dala od oryginalnej butelki z wodą.
    UWAGA: Użyj tych samych małych butelek, które opisano w kroku 3.1.
  2. Wystawić zwierzęta na działanie wody + 1% sacharozy podczas ostatniej porcji ich fazy aktywnej (ZT 18 – 24). Po tej ekspozycji wyjmij butelkę z wodą + sacharozą z klatki.
    UWAGA: Można stosować różne okna czasowe dostawy CNO. Dodatkowo myszy można umieścić w odwróconym cyklu światło/ciemność, w którym początek światła następuje w godzinach wieczornych, aby ułatwić poród CNO.
  3. Zmierz dzienne spożycie wody + 1% sacharozy dla każdej myszy.
  4. Zważ każdą mysz przed rozpoczęciem eksperymentu.
  5. Na podstawie masy ciała i średniej ilości spożywanej wody + 1% sacharozy należy określić dawkę roztworu CNO, aby osiągnąć 1,0 mg CNO/kg (masa ciała).
    UWAGA: Należy przetestować optymalną dawkę CNO, która wykazuje maksymalną skuteczność przy minimalnym stężeniu CNO, jak wyjaśniono w kroku 3.6.
  6. W pierwszym dniu napełnij butelki 5 ml wody + 1% sacharozy + CNO (1 mg CNO/kg) i umieść je na klatce (zawsze w tym samym miejscu) w określonym przedziale czasowym.
  7. Pod koniec ograniczonego okna czasowego wyjmij butelki i zmierz ilość spożytej wody + sacharozy + CNO.
    UWAGA: Materiały i roztwory są odkażane lub wyrzucane, jak opisano wcześniej w kroku 3.11.
  8. Powtarzaj tę procedurę codziennie przez 5 dni.
    UWAGA: Ten czas trwania można dostosować zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
  9. Uwzględnij grupę kontrolną, zgodnie z opisem w kroku 2.6.

5. Analiza danych

  1. Perfuzję dosercową myszy z 4% paraformaldehydem (PFA) należy wykonać 2 lub 6 godzin po otrzymaniu ostatniej powtarzalnej (5 dnia) kropli do oczu CNO. Gdy CNO jest dostarczane przez wodę pitną, zastąp CNO + wodę wodą pod koniec fazy aktywnej myszy, a następnie wykonaj fuzję myszy po 2 lub 6 godzinach od dostępu do CNO.
    UWAGA: Jeśli ekspozycja na światło może wpływać na indukcję c-Fos w obszarze zainteresowania, trzymaj myszy w ciągłej ciemności podczas ostatniego dnia eksperymentów i przed perfuzją.
  2. Ostrożnie wypreparuj mózg i zanurz w 4% roztworze PFA na 9-12 godzin.
  3. Po utrwaleniu PFA należy kriochronić tkankę mózgową za pomocą 30% roztworu sacharozy (poczekaj, aż mózg opadnie), a następnie przeciąć mózg za pomocą kriostatu.
  4. Przenieś koronalne sekcje mózgu (35 μm) do roztworu zawierającego 1x PBS, 10% albuminy surowicy bydlęcej i 0,3% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować skrawki mózgu roztworem przeciwciała anty-c-Fos (1:2500) w temperaturze 4 °C przez noc przy stałym mieszaniu.
  6. Po 3 płukaniach po 5 minut każde roztworem zawierającym 1x PBS i 0,3% Triton X-100, inkubować próbki z roztworem przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z dala od światła i przy ciągłym mieszaniu.
  7. Uzyskiwanie obrazów cyfrowych za pomocą mikroskopu konfokalnego. Składaj i przetwarzaj przechwycone obrazy za pomocą oprogramowania do edycji i analizy zdjęć (np. Adobe Photoshop).
  8. W celu analizy danych nakreśl i zmierz obszar zakażony AAV (komórki mCherry (+)) za pomocą oprogramowania ImageJ i określ ilościowo liczbę komórek c-Fos (+) w tym regionie, aby uzyskać liczbę aktywowanych komórek na obszarze. Połącz wyniki uzyskane z 3 oddzielnych sekcji na zwierzę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaobserwowaliśmy, że powtarzalne dostarczanie CNO za pomocą kropli do oczu wywołało silną indukcję ekspresji c-Fos w większości zainfekowanych neuronów (Rysunek 1C), pokazując, że skuteczność dostarczania CNO utrzymuje się podczas powtarzającej się ekspozycji. Ponadto zaobserwowano znaczącą indukcję c-Fos w próbkach pobranych 2 godziny po podaniu działaniu CNO, w porównaniu z próbkami uzyskanymi 6 godzin po ekspozycji na CNO (ryc. 1D-E), co pokazuje, że zmiany wywołane przez CNO są za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DREADD stały się popularnym i skutecznym podejściem do zdalnego manipulowania aktywnością neuronalną17. Opracowanie alternatywnych strategii dostarczania CNO znacznie zwiększy spektrum opcji dostępnych dla określonych warunków eksperymentalnych. Ponadto nieinwazyjne strategie dostarczania CNO minimalizują potencjalną błędną interpretację wyników poprzez zmniejszenie niepożądanych skutków ubocznych, które mogą bezpośrednio wpływać na zdrowie zwierzęcia. W tym miejscu opisaliśmy dwie nieinwazyjne st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez program badań stacjonarnych w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego (ZIA MH002964-02). Chcielibyśmy podziękować za wsparcie NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BSASigma life science#A2153-100GLiofilizowany proszek ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym)
Myszy C57BL / 6JLaboratorium Jacksona#000664samce myszy, 3 miesiące
KapilaryDrummond Scientific Company#3-000-203-G/XŚrednica zewnętrzna: 1,14 cala
N-tlenek klozapinySigma#C08325 mg
ForaneBaxter#NDC 10019-360-60Izofluran,
mikroiniektor USP IIIDrummond Scientific Company#3-000-207Nanoject III - Programowalny wtryskiwacz Nanolitr
Media montażoweInvitrogen#P36930Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences#1571016% roztwór wodny (bez metanolu), 10 ml
technologia sygnalizacji komórkowejprzeciwciała c-Fos#2250Sc-Fos (9F6) MAb królika ( 100 i mikro; L)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherryUNC Wektor Miano rdzenia: ~3 x 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherryUNC Vector Miano rdzenia: ~3x10e12 vg/mL
Przeciwciało drugorzędoweInvitrogen#A21206Alexa Fluor TM 488 IgG (H+L) Oślica przeciw królikowi, 2mg/ml
Triton X-100americanbio.com#AB02025-00100
Pierwotna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
  2. Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
  3. Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
  4. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
  5. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  6. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  7. Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
  8. Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
  9. Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
  10. Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
  11. Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
  12. Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93(2017).
  13. LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  14. Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
  15. Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
  16. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
  17. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
  18. Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
  19. Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
  20. MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
  21. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kontrola DREADDpodawanie CNOpodawanie w formie kropli do oczupodawanie z wod pitnchroniczna modulacja neuronalnaanaliza ekspresji cFoskonfokalna mikroskopia fluorescencyjnachirurgia stereotaktycznainiekcja AAV do hipokampa

Powiązane artykuły