Artykuł metodologiczny

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/59448

⸱

22 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka technik polega na wykrywaniu sygnałów fluorescencyjnych w celu identyfikacji lub badania zjawisk lub wyjaśnienia funkcji. Separacja tych sygnałów fluorescencyjnych okazała się kłopotliwa do czasu pojawienia się obrazowania hiperspektralnego, w którym źródła fluorescencji mogą być oddzielone od siebie, a także od sygnałów tła i autofluorescencji (biorąc pod uwagę wiedzę o ich sygnaturach widmowych). Jednak tradycyjne, emisyjne obrazowanie hiperspektralne cierpi z powodu powolnych czasów akwizycji i niskich stosunków sygnału do szumu ze względu na niezbędne filtrowanie zarówno światła wzbudzonego, jak i emisyjnego. Wcześniej wykazano, że obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia skraca niezbędny czas akwizycji, jednocześnie zwiększając stosunek sygnału do szumu pozyskanych danych. Korzystając z komercyjnie dostępnego sprzętu, protokół ten opisuje, jak zmontować, skalibrować i używać systemu mikroskopii obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia do separacji sygnałów z kilku źródeł fluorescencji w jednej próbce. Chociaż technika ta ma szerokie zastosowanie w obrazowaniu mikroskopowym komórek i tkanek, może być również przydatna w każdym rodzaju eksperymentu wykorzystującego fluorescencję, w którym możliwa jest zmiana długości fal wzbudzenia, w tym między innymi: obrazowanie chemiczne, zastosowania środowiskowe, pielęgnacja oczu, nauka o żywności, nauki sądowe, nauki medyczne i mineralogia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie spektralne może być wykonywane na różne sposoby i jest określane kilkoma terminami1,2,3,4. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie spektralne odnosi się do danych uzyskanych w co najmniej dwóch wymiarach przestrzennych i jednym wymiarze spektralnym. Obrazowanie wielospektralne i hiperspektralne najczęściej rozróżnia się na podstawie liczby pasm długości fal lub tego, czy pasma widmowe są przyległe1. W tym zastosowaniu dane hiperspektralne definiuje się jako dane spektralne uzyskane w ciągłych pasmach długości fal uzyskanych przez odstępy między środkowymi długościami fal nie mniejszymi niż połowa pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM) każdego filtra pasmowoprzepustowego używanego do wzbudzenia (tj. odstęp między długościami fali środkowej 5 nm dla filtrów pasmowoprzepustowych o szerokości pasma 14-20 nm). Ciągły charakter pasm danych pozwala na nadpróbkowanie zbioru danych, zapewniając, że kryteria Nyquista są spełnione podczas próbkowania domeny spektralnej.

Obrazowanie hiperspektralne zostało opracowane przez NASA w latach 70. i 80. w połączeniu z pierwszym satelitą Landsat5,6. Zebranie danych z kilku sąsiadujących ze sobą pasm spektralnych pozwoliło na wygenerowanie widma promieniowania każdego piksela. Identyfikacja i zdefiniowanie widma promieniowania poszczególnych składników umożliwiło nie tylko wykrycie materiałów powierzchniowych na podstawie ich charakterystycznych widm, ale także pozwoliło na usunięcie sygnałów interweniujących, takich jak zmiany sygnału spowodowane warunkami atmosferycznymi. Koncepcja wykrywania materiałów na podstawie ich charakterystycznych widm została zastosowana do systemów biologicznych w 1996 roku, kiedy Schröck i in. wykorzystali kombinacje pięciu różnych fluoroforów i ich znanych widm do rozróżnienia znakowanych chromosomów w procesie zwanym kariotypowaniem spektralnym7. Technika ta została opracowana w 2000 roku przez Tsurui i in. do obrazowania fluorescencyjnego próbek tkanek, przy użyciu siedmiu barwników fluorescencyjnych i dekompozycji wartości osobliwych w celu uzyskania separacji widmowej każdego piksela na liniowe kombinacje widm w bibliotece referencyjnej8. Podobnie jak w przypadku ich odpowiedników teledetekcyjnych, udział każdego znanego fluoroforu można obliczyć na podstawie obrazu hiperspektralnego, biorąc pod uwagę a priori informacje o widmie każdego fluoroforu.

Obrazowanie hiperspektralne było również wykorzystywane w obszarach rolnictwa9, astronomy10, biomedicine11, chemical imaging12, aplikacje środowiskowe13, eye care14, food science15, kryminalistyka16,17, medycyna18, mineralogy19 oraz surveillance20. Kluczowym ograniczeniem obecnych systemów obrazowania hiperspektralnego mikroskopu fluorescencyjnego jest to, że standardowa technologia obrazowania hiperspektralnego izoluje sygnały fluorescencyjne w wąskich pasmach poprzez: 1) najpierw filtrowanie światła wzbudzenia w celu kontrolowania wzbudzenia próbki, a następnie 2) dalsze filtrowanie emitowanego światła w celu rozdzielenia emisji fluorescencji na wąskie pasma, które później można później rozdzielić matematycznie21. Filtrowanie zarówno oświetlenia wzbudzenia, jak i emitowanej fluorescencji zmniejsza ilość dostępnego sygnału, co obniża stosunek sygnału do szumu i wymaga długich czasów akwizycji. Słaby sygnał i długie czasy akwizycji ograniczają możliwość zastosowania obrazowania hiperspektralnego jako narzędzia diagnostycznego.

Opracowano metodę obrazowania, która wykorzystuje obrazowanie hiperspektralne, ale wzmacnia dostępny sygnał, skracając tym samym niezbędny czas akwizycji21,22. Ta nowa metoda, zwana obrazowaniem hiperspektralnym ze skanowaniem wzbudzenia, pozyskuje dane obrazu spektralnego poprzez zmianę długości fali wzbudzenia i zbieranie szerokiego zakresu emitowanego światła. Wcześniej wykazano, że technika ta powoduje wzrost o rzędy wielkości stosunku sygnału do szumu w porównaniu z technikami skanowania emisji21,22. Wzrost stosunku sygnału do szumu wynika w dużej mierze z szerokiego pasma przepustowego (~600 nm) wykrywanego światła emisyjnego, podczas gdy specyficzność zapewnia filtrowanie tylko światła wzbudzającego zamiast emisji fluorescencji. Dzięki temu całe emitowane światło (dla każdej długości fali wzbudzenia) dociera do detektora21. Dodatkowo technika ta może być stosowana do odróżniania autofluorescencji od etykiet egzogennych. Co więcej, możliwość skrócenia czasu akwizycji dzięki zwiększonemu wykrywalnemu sygnałowi zmniejsza niebezpieczeństwo fotowybielania, a także umożliwia skanowanie spektralne z szybkością akwizycji, która jest akceptowalna dla spektralnego obrazowania wideo.

Celem tego protokołu jest służenie jako przewodnik po pozyskiwaniu danych do mikroskopii obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia. Ponadto dołączone są opisy, które pomagają zrozumieć ścieżkę światła i sprzęt. Opisano również implementację oprogramowania open-source dla mikroskopu obrazowania hiperspektralnego ze wzbudzeniem i skaningiem. Na koniec znajdują się opisy, jak skalibrować system do standardu identyfikowalnego przez NIST, dostosować ustawienia oprogramowania i sprzętu w celu uzyskania dokładnych wyników oraz rozdzielić wykryty sygnał na wkłady z poszczególnych komponentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja urządzenia

  1. Źródło światła: wybierz szerokopasmowe spektralne źródło światła o dużej mocy wyjściowej i wysokiej kolimacji (do tych badań użyto lampy łukowej Xe o mocy 300 W).
  2. Migawka (opcjonalnie): dodaj migawkę do ścieżki optycznej, aby zmniejszyć fotowybielanie podczas obrazowania poklatkowego.
  3. Przestrajalny system filtrów: zawiera mechaniczny zespół strojeniowy i zestaw cienkowarstwowego filtra przestrajalnego (TFTF), aby umożliwić pożądany zakres wzbudzenia z regulacją długości fali (np. 360-485 nm).
  4. Mikroskop: użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, w tym zmotoryzowanej wieżyczki z filtrem dichroicznym i kontrolera.
    1. Kostka filtra fluorescencyjnego: zmontuj kostkę filtra fluorescencyjnego długiego przepustu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wybierz zwierciadło dichroiczne i długoprzepustowy filtr emisyjny o tej samej długości fali, aby uzyskać optymalną separację wzbudzenia od światła emisyjnego (np. 495 nm).
    2. Cel: użyj odpowiedniego obiektywu apochromatycznego, aby zapewnić równomierne skupienie w zakresie długości fal użytym w eksperymencie (w tym badaniu użyto obiektywu wodnego o powiększeniu 60x).
    3. Zautomatyzowany etap (opcjonalnie): użyj zautomatyzowanego stolika do szybkiego próbkowania wielu pól widoku i/lub bardzo dużych pól poprzez łączenie obrazów. Skalibruj stolik z obiektywem i aparatem.
  5. Kamera: wybierz odpowiednią kamerę, aby osiągnąć rozdzielczość przestrzenną, czułość i wymagania dotyczące szumu eksperymentu (ten system wykorzystywał kamerę sCMOS o wysokiej czułości).

2. Oprogramowanie do akwizycji

  1. Wybierz pakiet oprogramowania, który umożliwia niezależne sterowanie każdym komponentem sprzętowym, taki jak Micro-Manager.
    1. Tworzenie pliku konfiguracyjnego: plik konfiguracyjny to zapisany zestaw instrumentów i instrukcji, które Micro-Manager załaduje do obsługi sprzętu systemu. Aby utworzyć plik konfiguracyjny, kliknij przycisk Narzędzia > Kreator konfiguracji sprzętu.
      1. W kroku 1 kliknij przycisk Utwórz nową konfigurację > Dalej, aby kontynuować. Należy pamiętać, że użytkownik może zdecydować się na modyfikację lub eksplorowanie istniejącej konfiguracji, jeśli jest już dostępna.
      2. W kroku 2 przejrzyj listę Dostępne urządzenia, aby znaleźć urządzenia, którymi chcesz sterować za pomocą programu Micro-Manager, takie jak mikroskop, lampa, stolik, migawka i kamera. Po podświetleniu kliknij przycisk Dodaj... , aby dodać urządzenie do listy zainstalowanych urządzeń. Spowoduje to otwarcie nowego okna.
        1. Oznacz etykietę urządzenia w polu Etykieta. (np. kamera sCMOS)
        2. W obszarze Wartość wybierz odpowiedni port COM dla każdego urządzenia. Spowoduje to, że w dolnej części okna pojawi się lista właściwości urządzenia.
        3. Pozostaw właściwości urządzenia z ustawieniami domyślnymi. Należy pamiętać, że wartości niestandardowe dla każdej właściwości urządzenia można wprowadzać zgodnie z potrzebami.
        4. Po dodaniu każdego urządzenia kliknij przycisk Dalej, aby przejść do następnego kroku. Należy pamiętać, że jeśli jakiekolwiek urządzenia zostaną pominięte lub wymagają wymiany, plik konfiguracyjny można później zmodyfikować zgodnie z opisem w kroku 2.1.1.1.
      3. W kroku 3 użyj menu rozwijanych, aby wybrać domyślny aparat, migawkę i stopień ostrości. Jeśli wymagana jest automatyczna migawka, kliknij pole wyboru poniżej listy rozwijanej sceny ostrości. Jeśli kierunek ustawiania ostrości na stoliku Z jest znany, wybierz go z listy rozwijanej w obszarze Wskazówki ostrości stołu montażowego (zaawansowane). W przeciwnym razie pozostaw wartość domyślną jako Nieznany.
      4. W kroku 4 kliknij dwukrotnie pola pod nagłówkiem Opóźnienie [ms], aby ustawić opóźnienia związane z automatycznymi urządzeniami, takie jak opóźnienia 100 ms dla lampy, stolika i migawki oraz opóźnienie 250 ms dla poleceń dla zespołu strojenia mechanicznego w celu uwzględnienia czasu mechanicznego przełączania między filtrami.
      5. W kroku 5 przypisz etykiety dla urządzeń stanu. Konfiguracja systemu mikroskopu wzbudzeniowo-skaningowego wykorzystuje etykiety w bloku filtra do identyfikacji każdej kostki filtra fluorescencyjnego (np. stan 0 odpowiada etykiecie Bright, pustej kostce filtra używanej podczas obrazowania w jasnym polu; podczas gdy stan 3 odpowiada etykiecie 495 nm i niestandardowej kostce filtra dichroicznego 495 nm używanej do rozdzielania światła wzbudzenia i emisji przy 495 nm). Etykiety są również używane w zespole strojenia mechanicznego do przechowywania poleceń przełączania dla każdej długości fali wzbudzenia (np. stan 0 odpowiada poleceniu strojenia długości fali wzbudzenia 340 nm dla zespołu strojenia mechanicznego).
      6. W kroku 6 kliknij przycisk Przeglądaj obok pola Plik konfiguracyjny, aby wybrać lokalizację zapisu i nazwę pliku konfiguracyjnego. Kliknij przycisk Zakończ, aby zapisać plik konfiguracyjny.
    2. Grupy startowe i ustawienia wstępne: Micro-Manager może przechowywać różne grupy w każdym pliku konfiguracyjnym, aby aktywować lub zmienić podzbiór sprzętu. Na przykład grupa "uruchamiania systemu" i kombinacja ustawień wstępnych będą przechowywać ustawienia domyślne, takie jak rozmiar kategoryzacji i szybkości odczytu dla kamery.
      1. Utwórz grupę (np. System), klikając + w oknie głównym w podsekcji Grupa.
      2. Sprawdzić dowolne użycie w grupie? pola wewnątrz grupy, które będą wymagały ustawienia wartości domyślnej (np. kategoryzacja w powiązanej kamerze domyślnej).
      3. Utwórz nowe ustawienie wstępne (np. "Uruchamianie"), klikając + w oknie głównym w podsekcji Preset.
      4. Każde pole zaznaczone w kroku 2 pojawi się tutaj jako opcja predefiniowana. Wybierz wartość domyślną, która ma zostać załadowana dla każdego zaznaczonego pola.
    3. Grupowanie i ustawienia wstępne dla długości fal wzbudzenia: Micro-Manager traktuje każdą długość fali wzbudzenia jako osobny kanał z własnym poleceniem przełączania długości fali; dlatego każda z nich musi być zapisana jako osobne ustawienie wstępne.
      1. Utwórz nową grupę, która będzie zawierać zestaw żądanych długości fal wzbudzenia (np. "495 nm dichroiczny")
      2. Zaznacz pole Użyj w grupie? o nazwie Etykieta odpowiadająca urządzeniu VF-5.
      3. Utwórz nowe ustawienie wstępne o nazwie dla każdej długości fali wzbudzenia (np. "340 nm").
      4. Przypisz do każdego ustawienia wstępnego odpowiednią nazwę właściwości i wartość ustawienia wstępnego (np. nazwa właściwości: "Etykieta"; wartość ustawienia wstępnego: "340 nm").
    4. Narzędzie do akwizycji wielowymiarowej: kliknij Multi-D Acq. w lewym górnym rogu okna Micro-Manager, aby otworzyć konfigurowalne narzędzie do przechwytywania obrazu próbki na każdej długości fali wzbudzenia za pomocą jednego kliknięcia. Istnieje kilka opcji dostosowywania, aby skonstruować przejęcie dokładnie tak, jak chcesz.
      1. Punkty czasowe (nieużywane w tym przykładzie): w przypadku badań bez komponentu poklatkowego pozostaw to pole niezaznaczone. Jeśli pożądane są badania poklatkowe, zaznacz to pole. Jeśli ta opcja jest zaznaczona, wprowadź liczbę powtórzeń pozostałych ustawień pozyskiwania w polu Liczba. Ustaw czas między kolejnymi akwizycjami, wprowadzając czas trwania w polu Interwał i wybierz odpowiednią jednostkę (milisekundy, sekundy lub minuty; zwykle sekundy).
      2. Wiele pozycji (XY; nieużywane w tym przykładzie): w przypadku badań pojedynczej pozycji XY pole wyboru należy pozostawić niezaznaczone. Jeśli pożądanych jest wiele pozycji XY, zaznacz pole i kliknij przycisk Edytuj listę pozycji, aby otworzyć osobne okno. Przesuń stolik do każdej żądanej lokalizacji i kliknij przycisk Oznacz, aby zapisać tę pozycję w oprogramowaniu. Powtarzaj, aż wszystkie żądane pozycje XY zostaną zaznaczone. Zamknij to okno, aby kontynuować.
      3. Stosy Z (slajdy; nieużywane w tym przykładzie): w przypadku badań pojedynczej pozycji Z pozostaw to pole niezaznaczone. Jeśli pożądanych jest wiele pozycji Z, zaznacz to pole. Przesuń stolik do żądanej początkowej pozycji Z i kliknij przycisk Set (Ustaw) obok pola Z-start. Przesuń stół montażowy do żądanej pozycji zakończenia Z i kliknij przycisk Set obok pola Z-end (Koniec Z). Wprowadź żądany rozmiar kroku (w mikronach) w polu Z-step.
      4. Kanały: upewnij się, że pole Kanały jest zaznaczone. Tutaj kanały to nazwy nadane poszczególnym długościom fal wzbudzenia. Dostępne "Kanały" odpowiadają "Grupom" opisanym w krokach 2.1.2 i 2.1.3.
        1. Grupa: kliknij listę rozwijaną, aby wybrać grupę, z której chcesz wybrać dostępne długości fal wzbudzenia (np. 495 nm dichroiczne).
        2. Kliknij pole Nie zamykaj migawki, aby migawka była otwarta między pobraniami dla każdego kanału. Zwróć uwagę, że migawka będzie nadal zamykać się między kolejnymi skanami spektralnymi, jeśli to pole jest zaznaczone, zakładając, że opcja automatycznej migawki jest również wybrana w oknie głównym.
      5. Kliknij przycisk Nowy, aby dodać kanały do listy pozyskiwania. Zwróć uwagę, że przycisk Usuń może być użyty do usunięcia dowolnych kanałów, które nie są już pożądane, a Góra i Dół mogą być użyte do zmiany kolejności dowolnych wybranych kanałów.
        1. Upewnij się, że pole wyboru Użyć? jest zaznaczone dla każdej żądanej długości fali w skanowaniu spektralnym.
        2. Konfiguracja: kliknij listę rozwijaną w obszarze Konfiguracja i wybierz pierwszą długość fali w żądanym zakresie widmowym (np. 340 nm).
        3. Ekspozycja: kliknij dwukrotnie pole w obszarze Ekspozycja i wprowadź żądany czas ekspozycji dla wybranej długości fali (np. "100" przez 100 ms). Patrz sekcja 5 ("Akwizycja danych"), aby uzyskać sugestie dotyczące wyboru odpowiednich czasów naświetlania.
        4. Przesunięcie Z (nie ma zastosowania w skanowaniu spektralnym): pozostaw to pole puste (na 0) podczas wykonywania skanowania spektralnego.
        5. Stos Z: upewnij się, że to pole jest zaznaczone dla każdej długości fali w zakresie widmowym, jeśli wykonujesz stos Z.
        6. Pomiń fr. (nie dotyczy skanowania spektralnego): pozostaw to pole puste (na 0) podczas wykonywania skanowania spektralnego. Należy pamiętać, że przydatne może być selektywne pomijanie klatek w przypadku, gdy jedna lub kilka długości fal wzbudzenia jest znacznie silniejszych niż inne lub jeśli poszczególne długości fal wzbudzenia okażą się szczególnie fototoksyczne.
        7. Kolor: pozostaw to pole puste podczas wykonywania skanowania spektralnego. Należy pamiętać, że kolory można wybrać dla poszczególnych pasm długości fal w celu wizualizacji danych, ale kolor jest nieodpowiedni do późniejszego rozmieszania widma.
        8. Powtarzaj te kroki, aż zostanie dodana każda żądana długość fali wzbudzenia w danym zakresie skanowania spektralnego.
      6. Kolejność pozyskiwania: kliknij listę rozwijaną, aby wybrać, w jakiej kolejności zostaną wykonane powyższe opcje (2.1.4.1-2.1.4.5). W przypadku skanów spektralnych, takich jak ten pokazany tutaj, kolejność akwizycji to po prostu Kanał. Zwróć uwagę, że dodatkowe opcje pojawiają się, gdy dodatkowe pola są zaznaczone w narzędziu Akwizycja wielowymiarowa [punkty czasu, Wiele pozycji (XY) i stosy Z (plasterki)] i umożliwiają wybór najpierw pozycji lub czasu, a następnie wycinka lub kanału.
      7. Autofokus (nieużywany w tym przykładzie): W przypadku wybrania opcji Multiple Positions (XY) (Wiele pozycji) dostępnych jest kilka różnych stylów autofokusa. Kliknij przycisk Opcje i wybierz metodę autofokusa z listy rozwijanej obok przycisku zamykania.
      8. Podsumowanie: przejrzyj to okno, aby uzyskać podsumowanie liczby punktów czasowych, pozycji XY, wycinków Z, kanałów, całkowitej liczby obrazów, całkowitej pamięci, czasu trwania skanowania i kolejności pozyskiwania, aby upewnić się, że wymienione informacje są zgodne z oczekiwanymi ustawieniami akwizycji.
      9. Zapisz obrazy: upewnij się, że to pole jest zaznaczone, aby zapisać dane zebrane za pomocą narzędzia Multi-Dimensional Acquisition.
        1. Kliknij przycisk ... obok opcji Katalog główny, aby wybrać katalog główny, w którym zostaną zapisane pliki. Nazwij katalog główny w sposób, który opisuje istotne szczegóły eksperymentu (np. GCaMP Komórki mięśni gładkich dróg oddechowych).
        2. Wprowadź nazwę w polu obok opcji Prefiks nazwy, która opisuje bieżące pobieranie obrazu (np. FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Zaleca się utworzenie prefiksu nazwy, który identyfikuje pole widzenia i czas ekspozycji, a także inne istotne informacje, takie jak zastosowany obiekt i filtr dichroiczny. Zwróć uwagę, że pierwszy stos obrazów zrobiony przy użyciu tych ustawień zostanie zapisany z "_1" po prefiksie nazwy. Każdy kolejny stos pobrany z tym samym katalogiem głównym i prefiksem nazwy zostanie zapisany z "_n", gdzie "n" to liczba pobranych stosów o tej nazwie w katalogu.
        3. Kliknij opcję Oddziel pliki obrazów, aby upewnić się, że obraz wygenerowany dla każdej długości fali wzbudzenia został zapisany.
      10. Zapisz jako: kliknij przycisk Zapisz jako... w prawym górnym rogu narzędzia Akwizycja wielowymiarowa, aby zapisać te ustawienia akwizycji w celu łatwego wykorzystania w przyszłości. Należy pamiętać, że katalog główny katalogu i prefiksy nazw również zostaną zapisane.
      11. Nabywanie: na koniec kliknij przycisk Nabierz! przycisk, aby rozpocząć pobieranie obrazów zgodnie z wybranymi powyżej ustawieniami akwizycji.

3. Korekcja odpowiedzi spektralnej (opcjonalnie):

  1. Korekcję wyjścia spektralnego można przeprowadzić w celu skalibrowania odpowiedzi spektralnej systemu na znany standard, taki jak lampa identyfikowalna przez NIST lub inny identyfikowalny przez NIST standard lub instrument. Ten krok jest szczególnie ważny, jeśli wyniki są porównywane z innymi instrumentami do obrazowania spektralnego, spektrometrami lub między różnymi laboratoriami. Ten proces został wcześniej szczegółowo opisany21,23.
    1. Użyj spektrometru skalibrowanego do źródła światła identyfikowalnego przez NIST (takiego jak LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) lub innego wzorca identyfikowalnego przez NIST, aby uzyskać moc spektroradiometryczną oświetlenia mierzoną na etapie próbki. Wykonaj osobną korekcję dla każdej kombinacji ustawienia źródła światła, lustra dichroicznego i obiektywu. Użyj kuli całkującej sprzężonej ze spektrometrem, aby dokładnie zmierzyć szerokokątne oświetlenie z obiektywu mikroskopu.
    2. Użyj metody całkowania, takiej jak reguła trapezu, aby zintegrować dane spektroradiometryczne na oświetlonych długościach fal. Szerokość pasma 40 nm do całkowania wyśrodkowanego wokół środkowej długości fali jest wystarczająca dla większości filtrów, które mają nominalną szerokość pasma między 14-20 nm przy połowie maksimum (FWHM). Wartość zintegrowana reprezentuje intensywność oświetlenia spektralnego w każdym paśmie długości fali wzbudzenia.
    3. Wykreślić zintegrowane natężenie każdego pasma długości fali w funkcji długości fali centrum wzbudzenia, aby umożliwić wizualizację profilu intensywności oświetlenia spektralnego.
    4. Określ pasmo długości fali o najniższym zintegrowanym natężeniu.
    5. Znormalizuj profil intensywności oświetlenia spektralnego, dzieląc najniższą zintegrowaną intensywność przez zintegrowaną intensywność każdego pasma długości fali, aby wygenerować współczynnik korekcyjny zależny od długości fali.

4. Przygotowanie próbki

  1. Przygotować "ślepą" próbkę (np. umieścić szklane szkiełko nakrywkowe w komorze celi i dodać 1 ml buforu). Ten bufor został opisany wcześniej24.
  2. Przygotuj nieznakowaną próbkę, aby oznaczyć autofluorescencję próbki (np. umieść szklane szkiełko nakrywkowe zawierające nieznakowane komórki mięśni gładkich dróg oddechowych25,26 w komorze komórkowej i dodaj 1 ml buforu).
  3. Przygotować oddzielną, pojedynczo znakowaną próbkę dla każdej etykiety fluorescencyjnej użytej w doświadczeniu w następujący sposób:
    1. Dodać rozcieńczoną etykietę mitochondrialną do buforu, aby osiągnąć stężenie 100 nM. Dodaj ten bufor do szkiełka nakrywkowego zawierającego komórki mięśni gładkich dróg oddechowych. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 20-25 °C. Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory komory komórkowej i dodać 1 ml buforu. Należy pamiętać, że optymalne stężenie etykiety mitochondrialnej będzie się różnić w zależności od takich czynników, jak producent, powiązany kolor i pożądana specyficzność.
    2. Przenieść szkiełko nakrywkowe zawierające komórki mięśni gładkich dróg oddechowych transfekowane sondą GCaMP 27 do komory komórkowej i dodać 1 ml buforu.
  4. Przygotować jedną lub więcej próbek doświadczalnych zawierających mieszaninę pożądanych etykiet fluorescencyjnych.
    1. Dodać 1 ml buforu (stężenie 100 nM znacznika mitochondrialnego) do szkiełka nakrywkowego zawierającego komórki mięśni gładkich dróg oddechowych transfekowanych sondą GCaMP i inkubować przez 20 minut w temperaturze 20-25 °C. Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory komórkowej i dodać 1 ml buforu.

5. Akwizycja danych:

  1. Sprawdź, czy wybrano odpowiedni dichroiczny rozdzielacz wiązki (np. kostkę filtra dichroicznego 495 nm), obiektyw (np. obiektyw wodny 60x) i kamerę (kamera sCMOS).
  2. Załaduj próbkę na stolik.
  3. Kliknij dwukrotnie pole obok opcji Ekspozycja [ms] i wpisz "100", aby ustawić czas ekspozycji na 100 ms. Należy pamiętać, że czas ekspozycji może wymagać wydłużenia lub skrócenia w zależności od intensywności fluorescencji próbki.
  4. Wybierz 475 nm z menu rozwijanego głównego okna Micro-Manager, aby wstępnie wyświetlić próbkę. Należy pamiętać, że 475 nm może nie być optymalną długością fali do oglądania próbki lub określania, czy nastąpi przesycenie w całym stosie obrazów.
  5. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić przykład.
    1. Kliknij przycisk automatycznego zakresu oglądania intensywności Automatycznie obok histogramu u dołu okna, aby przenieść wartości minimalne i maksymalne do znaczących zakresów wizualnych.
  6. Użyj pokręteł ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na próbce. Często przydatne jest znalezienie krawędzi próbki, aby pomóc w ustawieniu ostrości. Próbka zostanie zogniskowana, gdy elementy krawędzi obrazu będą ostrzone. Zwróć uwagę, że może być konieczne kilkakrotne kliknięcie przycisku Auto podczas ustawiania ostrości, aby pomóc w view obraz fluorescencyjny. Ponadto niektórym użytkownikom może być łatwiej ustawić ostrość na próbce, jeśli mikroskop jest w trybie transmisji.
    1. W przypadku ustawiania ostrości w trybie transmisji, ze względów bezpieczeństwa, najpierw upewnij się, że widmowe źródło światła nie przepuszcza światła do okularów przed dostosowaniem ścieżki światła do obrazowania transmisyjnego. Należy również pamiętać, że mogą występować niewielkie odchylenia między ostrością transmisji a obrazami fluorescencyjnymi. Po osiągnięciu akceptowalnej ostrości należy ponownie skonfigurować ścieżkę światła do obrazowania fluorescencji spektralnej.
  7. Kliknij przycisk Multi-D Acq. w lewym górnym rogu okna, aby otworzyć narzędzie Multi-Dimensional Acquisition (opisane i skonfigurowane w sekcji 2).
  8. Wybierz odpowiedni zakres spektralny dla akwizycji spektralnej (np. 360-485 nm dla filtra dichroicznego 495 nm), klikając przycisk Załaduj... w prawym górnym rogu okna narzędzia Akwizycja wielowymiarowa i przechodząc do zapisanych wcześniej ustawień wzbudzenia (w kroku 2.1.4.10). Zobacz dyskusję, aby uzyskać informacje dotyczące odpowiednich zakresów spektralnych.
  9. Uzyskaj tło/pusty obraz, który nie zawiera danych o fluorescencji, które można by wykorzystać do odejmowania tła i szumu. Można to zrobić przy użyciu ślepej próbki (krok 4.1) lub przechodząc do ślepego obszaru próbki eksperymentalnej. Jak opisano w kroku 5.6, najłatwiej jest to osiągnąć, znajdując krawędź próbki, a następnie ustawiając ją tak, aby krawędź była wyśrodkowana w polu widzenia.
    1. Po potwierdzeniu ustawień akwizycji i wyświetleniu obszaru tła kliknij przycisk Uzyskaj!, aby uzyskać stos obrazów spektralnych zawierający tło i szum, który można później odjąć. Należy zauważyć, że próbki mogą mieć intensywniejszą fluorescencję z dala od krawędzi próbki. Wskazane może być poruszanie się po próbce w celu znalezienia "najjaśniejszych" obszarów i wykonanie kilku testowych stosów obrazów w celu określenia odpowiednich czasów akwizycji i uniknięcia prześwietlenia.
  10. Wykonaj pojedynczy stos obrazów w obszarze próbki, który wydaje się mieć intensywną fluorescencję, aby upewnić się, że żadna kombinacja długości fal i czasy ekspozycji nie powodują prześwietlenia.
  11. Użyj ImageJ, aby potwierdzić, że żadne długości fal nie zawierają prześwietlonych pikseli.
    1. W ImageJ kliknij File > Import > Image Sequence (Importuj sekwencji obrazów) i przejdź do folderu zawierającego obrazy spektralne wykonane w kroku 5.10. Spowoduje to otwarcie nowego okna. Kliknij pole obok opcji Liczba obrazów i wprowadź liczbę długości fal uwzględnionych w skanowaniu spektralnym (np. 26). Pozostaw Obraz początkowy i Przyrost jako "1". Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
    2. Naciśnij M na klawiaturze, aby skorzystać z funkcji pomiaru ImageJ. Upewnij się, że liczba podana w polu Maksimum nie jest górną granicą wykrywalności kamery (np. 65 535). Powtórz te czynności dla każdego obrazu w skanie spektralnym. Należy pamiętać, że limit wykrywalności kamery zależy od samej kamery. Górny limit jest wyświetlany w prawej górnej części histogramu w głównym oknie programu MicroManager. Alternatywnie górny limit można określić, otwierając obraz w ImageJ i przechodząc do opcji Image > Adjust > Brightness/Contrast (Obraz Dostosuj jasność/kontrast). Kliknij przycisk Ustaw w wyświetlonym oknie podręcznym, wprowadź zbyt dużą wartość (np. 999,999) w puste miejsce obok opcji Maksymalna wyświetlana wartość i kliknij OK, aby kontynuować. Maksymalna wartość wyświetlana na nowym histogramie powinna być górną granicą wykrywalności kamery.
    3. Jeśli jakiekolwiek obrazy zawierały górną granicę wykrywalności kamery (np. 65 535), dostosuj czas ekspozycji skanowania spektralnego, aby upewnić się, że maksymalny sygnał w całym zakresie widmowym nie przekracza zakresu dynamicznego kamery.
  12. Uzyskaj dane obrazu spektralnego z nieznakowanych próbek, aby określić dowolną autofluorescencję. Pobrać skan dla nieoznakowanych próbek, używając identycznego zakresu długości fali i ustawień kamery, jak w pozostałej części eksperymentu (np. 360-485 nm przy 100 ms na długość fali).
  13. Pozyskiwanie danych obrazów spektralnych z próbek znakowanych pojedynczo w celu wykorzystania ich jako kontrolek spektralnych do zbudowania biblioteki spektralnej. Wykonaj skanowanie dla każdej etykiety przy użyciu identycznego zakresu długości fali, czasu naświetlania i ustawień aparatu. Należy pamiętać, że w przypadku niektórych próbek może być potrzebny dłuższy czas akwizycji, aby umożliwić dokładne wykrywanie widma etykiet przy minimalnym udziale szumów.
  14. Wykonaj pomiary na próbce eksperymentalnej (np. komórkach mięśni gładkich ludzkich dróg oddechowych za pomocą sondy GCaMP i znacznika mitochondrialnego).
    1. Umieścić szkiełko lub szkiełko nakrywkowe zawierające próbkę doświadczalną pod mikroskopem.
    2. Wybierz pole widzenia z odpowiednio oznaczonymi komórkami tkanek.
    3. Uzyskaj dane obrazu spektralnego przy użyciu żądanych ustawień akwizycji, jak opisano powyżej.

6. Analiza obrazu

  1. Korygowanie obrazów do płaskiej odpowiedzi spektralnej.
    1. Odjąć widmo tła otrzymane w sekcji 5.9 i pomnożyć przez współczynnik korekcyjny określony w sekcji 3.1.5. Można to zrobić za pomocą prostego skryptu MATLAB lub procedury ImageJ. Kod MATLAB odejmowania/korekcji (używany w tym przykładzie) jest dostępny na stronie internetowej University of South Alabama Bioimaging Resources.
      1. Załaduj kod odejmowania/korekcji w MATLAB.
      2. Na karcie EDYTOR kliknij przycisk Uruchom. Spowoduje to otwarcie nowego okna zawierającego przycisk Korekta Bsq. Kliknij przycisk Bsq Correction (Korekcja Bsq), aby otworzyć inne okno zawierające opcje katalogu roboczego, pliku tła, pliku współczynnika korekcji i niepoprawionego folderu tiff.
        1. Użyj przycisku Przeglądaj obok katalogu roboczego, aby wybrać ścieżkę do pliku, w którym będą otwierane kolejne okna. Przejdź do folderu zawierającego zapisane widmo tła (w formacie .dat).
        2. Użyj przycisku Przeglądaj obok opcji Plik tła (.dat), aby otworzyć katalog wybrany w kroku 6.1.1.2.1 i wybrać żądany plik tła (w formacie .dat). Kliknij przycisk Otwórz, aby kontynuować.
        3. Użyj przycisku Przeglądaj... obok opcji Współczynnik korekcji (.dat), aby wybrać współczynnik korekcji. Katalog współczynnika korekcyjnego jest domyślnie ustawiony na lokalizację nadrzędnego kodu MATLAB. W razie potrzeby przejdź do podfolderu zawierającego plik współczynnika korekcji (w formacie .dat). Zaznacz właściwy plik współczynnika korekcyjnego i kliknij przycisk Otwórz, aby kontynuować.
        4. Użyj przycisku Przeglądaj... obok Niepoprawiony folder TIFF, aby otworzyć katalog wybrany w kroku 6.1.1.2.1 i wybrać folder do odejmowania tła i korekcji obrazu (zwykle jest to folder Pos0, który bezpośrednio zawiera surowe obrazy spektralne). Kliknij przycisk Otwórz, aby kontynuować.
        5. Kliknij przycisk Kliknij, aby uzyskać korekcję spektralną. Po zakończeniu przetwarzania otworzy się okno z komunikatem "Korekta Bsq zakończona". Kliknij przycisk OK, aby kontynuować. Obrazy korekcyjne są przechowywane w nowym folderze o nazwie odpowiadającej oryginalnemu folderowi surowego obrazu spektralnego i dodatkowemu "_Corrected" (np. Pos0_Corrected).
  2. Wygeneruj bibliotekę spektralną. Do wyodrębniania danych spektralnych z obrazów można użyć kilku pakietów oprogramowania, w tym ImageJ. Aby uzyskać najlepsze wyniki, znormalizuj każdy element końcowy do pasma długości fali o największym natężeniu, określając, które pasmo długości fali ma największą wartość intensywności i dzieląc pomiar w każdym paśmie długości fali przez tę wartość maksymalną. Należy również zauważyć, że kontrolki jednoetykietowe generowane w próbkach autofluorescencyjnych będą wymagały dodatkowych modyfikacji28,29,30,31,32. Zobacz krok 6.2.4 i dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje.
    1. W ImageJ kliknij pozycję Plik > Importuj > sekwencji obrazów. Spowoduje to otwarcie nowego okna. Przejdź do folderu zawierającego skorygowane obrazy spektralne. Kliknij dwukrotnie dowolny plik obrazu w folderze, aby otworzyć nowe okno. Kliknij pole obok opcji Liczba obrazów i wprowadź liczbę długości fal uwzględnionych w skanowaniu spektralnym (np. 26). Pozostaw Obraz początkowy i Przyrost jako "1". Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
    2. W oknie głównym ImageJ kliknij ikonę Wybór wielokąta, a następnie użyj wskaźnika myszy, klikając obraz, aby utworzyć wielokąt wokół obszaru zawierającego dane fluorescencji. Należy pamiętać, że dane dotyczące fluorescencji mogą być niewielkie lub żadne w początkowej długości fali. Przejdź do innego obrazu o długości fali i/lub użyj narzędzia Jasność/Kontrast (Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast > Auto), aby lepiej zobrazować obszary zawierające interesujące Cię dane fluorescencyjne.
    3. Po narysowaniu wielokąta wygeneruj profil osi Z, klikając opcję Obraz > stosy > Drukuj profil osi Z. Spowoduje to otwarcie nowego okna. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać dane spektralne jako plik .csv.
    4. Wykonaj odejmowanie, aby zapewnić odpowiednią bibliotekę spektralną z czystymi etykietami pozbawionymi zanieczyszczenia autofluorescencyjnego. Użyj następującego równania29, aby wyizolować czyste widmo z mieszaniny pojedynczego znacznika i fluorescencji:
      figure-protocol-1 (1)
      gdzie: S pure jest czystym widmem etykiety, Smixed jest zmierzonym widmem próbki zanieczyszczonej autofluorescencją, S autoFL jest zmierzonym widmem autofluorescencji, "a" jest skalarnym mnożnikiem widma autofluorescencji (między 0 a 1; np. 0,4), a "offset" jest przesunięciem (zwykle 0). Zmieniaj składnik "a", aż zostanie osiągnięta wartość bliska zeru dla pozornego udziału autofluorescencji. Dodatkowe informacje można znaleźć w kilku publikacjach28,29,30,31,32.
  3. Rozmieszaj dane obrazu spektralnego. Krok rozmieszania wygeneruje obraz obfitości dla każdej etykiety fluorescencyjnej, gdzie obfitość to ilość względnego sygnału fluorescencji na obrazie z odpowiedniej etykiety. Dostępnych jest kilka algorytmów rozłączania do użytku z ImageJ33,34,35. Dodatkowo, kod MATLAB do rozmieszania spektralnego (użyty w tym przykładzie) jest dostępny na stronie internetowej University of South Alabama Bioimaging Resources. Bardziej wszechstronny przegląd rozmieszania spektralnego jest dostępny36.
    1. Załaduj kod rozmieszania spektralnego w MATLAB.
    2. Edytuj pliki Wavelength.mat i Library.mat tak, aby odpowiadały warunkom eksperymentalnym (np. "Długość fali" jako 360-485 w krokach co pięć).
      UWAGA: Odpowiednie wartości dla tych długości fal należy załadować do "Biblioteki" dla każdej etykiety fluorescencyjnej (i autofluorescencji). Endmember_Name powinien wyświetlić listę etykiet w tej samej kolejności, co wartości kolumn "Biblioteka". Należy pamiętać, że plik Library.mat powinien zawierać zarówno zmienne "Library", jak i "Endmember_Name".
    3. Na karcie EDYTOR kliknij przycisk Uruchom. Spowoduje to otwarcie nowego okna, w którym użytkownik może wybrać katalog. Przejdź do folderu zawierającego obrazy spektralne, które mają zostać rozłączone. Po wybraniu spowoduje to otwarcie nowego okna.
    4. W wynikowych ślepych miejscach wprowadź nazwę obrazu (np. HASMC z GCaMP i Mito FOV1), liczbę pasm długości fal (np. 26), liczbę punktów czasowych (np. 1) oraz to, czy pożądany jest pomiar FRET (np. n) w odpowiednich półfabrykatach. Jeśli dla FRET wybrano wartość "n", pozostaw puste pola Element końcowy pusty. Naciśnij OK, aby kontynuować, co otworzy nowe okno.
    5. Przechodzenie do folderu zawierającego plik Wavelength.mat. Po wybraniu kliknij przycisk Otwórz, aby kontynuować, co spowoduje otwarcie nowego okna.
    6. Przejdź do folderu zawierającego plik Library.mat. Po wybraniu kliknij przycisk Otwórz, aby kontynuować, co spowoduje zapisanie niezmiksowanych obrazów w nowym folderze "Niezmiksowane" w katalogu zawierającym obrazy widmowe.
  4. Sprawdź niezmieszane obrazy spektralne pod kątem jakości.
    1. Otwórz każdy niezmieszany obraz, aby wizualnie sprawdzić rozkład czystych składników.
      1. Porównaj wielkość obrazu błędu z wielkością obrazów niezmieszanych (podobnie jak w kroku 5.11, można to zrobić za pomocą funkcji miary ImageJ). Jeśli wielkość obrazu błędu jest podobna do wielkości niezmieszanych obrazów obfitości, jest prawdopodobne, że w danych obrazu spektralnego znajdują się sygnały, które nie są dokładnie uwzględniane przez bibliotekę spektralną i liniowy proces rozmieszania widma.
      2. Porównaj obraz błędu z niezmieszanymi obrazami, aby sprawdzić, czy istnieją niezidentyfikowane szczątkowe struktury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka ważnych kroków z tego protokołu jest koniecznych, aby zapewnić gromadzenie danych, które są zarówno dokładne, jak i pozbawione obrazowania i artefaktów spektralnych. Pominięcie tych kroków może spowodować, że dane będą wydawać się istotne, ale nie mogą być zweryfikowane ani odtworzone za pomocą żadnego innego systemu obrazowania spektralnego, co skutecznie unieważni wszelkie wnioski wyciągnięte na podstawie tych danych. Najważniejszym z tych ważnych kroków jest właściwa korekcja wyj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalne wykorzystanie zestawu do obrazowania hiperspektralnego ze skaningiem wzbudzenia rozpoczyna się od budowy ścieżki światła. W szczególności wybór źródła światła, filtrów (przestrajalny i dichroiczny), metoda przełączania filtrów i kamera określają dostępny zakres spektralny, możliwą prędkość skanowania, czułość detektora i próbkowanie przestrzenne. Lampy łukowe rtęciowe oferują wiele szczytów długości fali wzbudzenia, ale nie zapewniają płaskiego wyjścia spektralnego i będą wymagały znacznej redukcji sygnału na p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doktorzy Leavesley i Rich ujawniają udziały finansowe w start-upie SpectraCyte LLC, założonym w celu komercjalizacji technologii obrazowania spektralnego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 oraz Abraham Mitchell Cancer Research Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki mięśni gładkich dróg oddechowychNational Disease Research Interchange (NDRI)Izolowane z ludzkich tkanek płuc uzyskane z NDRIWysoce autofluorescencyjne, wrażliwe na wapń komórki
Automated ShutterThorlabs Inc.SHB1Zdalnie sterowana migawka minimalizująca fotowybielanie
Zautomatyzowany stolikPrior ScientificH177P1T4Zdalnie sterowany stolik do automatycznego zbierania obrazów z wieloma polami widzenia lub zszytych.
Zautomatyzowany kontroler stopnia (XY)Prior ScientificProscan III (H31XYZE-US)Do łączenia zautomatyzowanego stolika z komputerem i joystickiem
BuforWykonane we własnym zakresieWykonane we własnym zakresie145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glukozy, 1 mM MgCl2 i 1mM CaCl2, przy pH 7,3
Komora komórkowaThermoFisher Scientific, A7816Uchwyt szkiełka nakrywkowego wykonany z chirurgicznej stali nierdzewnej i gumowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym do uszczelniania mediów i zapobiegania zanieczyszczeniu próbki i/lub obiektywu
Filtry wzbudzeniaSemrock Inc.TBP01-378/16Środkowy zakres długości fali (340-378 nm), szerokość pasma (minimum 16 nm, nominalne FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,88)
Semrock Inc.TBP01-402/16Środkowy zakres długości fali (360-400 nm), Szerokość pasma (minimum 16 nm, nominalne FWHM 20 nm), Współczynnik załamania światła (1,8)
Semrock Inc.TBP01-449/15Środkowy zakres długości fali (400-448,8 nm), szerokość pasma (minimum 15 nm, nominalne FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,8)
Semrock Inc.TBP01-501/15Środkowy zakres długości fali (448,8-501,5 nm), szerokość pasma (minimum 15 nm, nominalne FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,84)
Semrock Inc.TBP01-561/14Środkowy zakres długości fali (501,5-561 nm), szerokość pasma (minimalna 14 nm, nominalna FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,83)
Kostka filtra fluorescencyjnego Dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrock Inc.FF495-Di03Rozdziela światło wzbudzenia i emisji przy 495 nm (>98% odbicia w zakresie 350-488 nm, >93% transmisji w zakresie 502-950 nm), Efektywny indeks filtra (1,78)
Filtr fluorescencyjny Cube Longpass FilterSemrock Inc.FF01 496/LP-25Umożliwia przepuszczanie światła dłuższego niż 496 nm ( >93% średnia transmisja w zakresie 503,2-1100 nm), współczynnik załamania światła (1,86)Sonda
GCaMPAddgeneG-CaMP3; Plazmid #22692Genetycznie kodowany wskaźnik wapnia o pojedynczej długości fali GCaMP2
Integrujący SphereOcean OpticsFOIS-1Używany do dokładnego pomiaru oświetlenia szerokokątnego
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyNikon InstrumentsTE2000Mikroskopy odwrócone umożliwiają bezpośrednie wzbudzenie próbki bez konieczności penetrowania warstw mediów i/lub tkanki.
Mitotracker Green FMThermoFisher ScientificM7514Etykiety mitochondria
Lampa kalibracyjna śledzona przez NISTOpticsLS-1-CAL-INTLampa o znanym widmie do stosowania jako standardowa
fluoresceina identyfikowalna przez NISTThermoFisherScientific F36915Do weryfikacji odpowiedniej odpowiedzi spektralnej systemu
NucBlueThermoFisher ScientificR37605Etykiety jądra komórkowe
Obiektyw (10X)Nikon InstrumentsPlan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105Przydatne przy dużych polach widzenia
Obiektyw (20x)Nikon InstrumentsPlan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205Najczęściej używany do próbek tkanek
Obiektyw (60X)Nikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27Najczęściej używany do próbek komórek
Aparat fotograficzny sCMOSFotometriaPrime 95B (Rev A8-062802018)Do pozyskiwania obrazów cyfrowych o wysokiej czułości
SpektrometrOcean OpticsQE65000Służy do pomiaru wydajności spektralnej układu spektralnego skanowania wzbudzenia
Przestrajalny zmieniacz filtrówInstrument SutterLambda VF-5Zmotoryzowana jednostka do automatycznego strojenia filtra wzbudzenia/ przełączająca
ksenonowa lampa łukowaSunoptic TechnologiesTitan 300HP LightsourceŹródło światła o stosunkowo jednolitej mocy spektralnej
Ocean

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901(2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901(2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802(2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034(2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518(2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207(2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601(2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614(2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017(2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M(2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B(2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Separacja sygna w fluorescencyjnychdemultipleksacja spektralnalaser superkontinuumodwr cony mikroskop fluorescencyjnyoprogramowanie Micromanageranaliza Image Jprzetwarzanie MATLABtworzenie biblioteki widmowejkorekcja autofluorescencji

Powiązane artykuły