Artykuł metodologiczny

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59449

⸱

22 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Neuroscience, University of Virginia School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Streszczenie

Inaktywacja chromosomu X (XCI) to losowe wyciszenie jednego chromosomu X u kobiet w celu osiągnięcia równowagi dawkowania genów między płciami. W rezultacie wszystkie samice są heterozygotyczne pod względem ekspresji genów sprzężonych z chromosomem X. Jednym z kluczowych regulatorów XCI jest Xist, który jest niezbędny do inicjacji i utrzymania XCI. Wcześniejsze badania zidentyfikowały 13 czynników inaktywacji chromosomu X (XCIF) działających w trans za pomocą wielkoskalowego genetycznego badania przesiewowego pod kątem utraty funkcji. Hamowanie XCIF, takich jak ACVR1 i PDPK1, za pomocą krótkiego RNA lub inhibitorów małocząsteczkowych, reaktywuje geny związane z chromosomem X w hodowanych komórkach. Jednak wykonalność i tolerancja reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo pozostaje do ustalenia. W tym celu wygenerowano mysi model XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp z nielosowym XCI z powodu delecji Xist na jednym chromosomie X. Korzystając z tego modelu, określono ilościowo zakres nieaktywnej reaktywacji chromosomu X w mózgu myszy po leczeniu inhibitorami XCIF. Niedawno opublikowane wyniki pokazują po raz pierwszy, że farmakologiczne hamowanie XCIF-ów reaktywuje Mecp2 z nieaktywnego chromosomu X w neuronach korowych żywego mózgu myszy.

Wprowadzenie

Inaktywacja chromosomu X (XCI) to proces kompensacji dawkowania, który równoważy ekspresję genów sprzężonych z chromosomem X poprzez wyciszenie jednej kopii chromosomu X u kobiet1. W rezultacie nieaktywny chromosom X (Xi) kumuluje charakterystyczne cechy heterochromatyny, w tym metylację DNA i hamujące modyfikacje histonów, takie jak trimetylacja histonu H3-lizyny 27 (H3K27me3) i ubikwitynacja histonu H2A (H2Aub)2. Głównym regulatorem wyciszania chromosomu X jest region centrum inaktywacji chromosomu X (Xic), około 100−500 kb, który kontroluje liczenie i parowanie chromosomów X, losowy wybór chromosomu X do inaktywacji oraz inicjację i rozprzestrzenianie się wyciszania wzdłuż chromosomu X3. Proces inaktywacji chromosomu X jest inicjowany przez nieaktywny specyficzny transkrypt X (Xist), który powleka Xi w cis, aby pośredniczyć w wyciszaniu całego chromosomu i przebudowie trójwymiarowej struktury chromosomu X4. Ostatnio kilka proteomicznych i genetycznych badań przesiewowych zidentyfikowało dodatkowe regulatory XCI, takie jak białka oddziałujące z Xist5,6,7,8,9,10,11,12. Na przykład poprzednie badanie wykorzystujące bezstronne badanie przesiewowe interferencji RNA całego genomu zidentyfikowało 13 transakcyjnych czynników XCI (XCIFs)12. Mechanicznie, XCIF-y regulują ekspresję Xist, a zatem zakłócenie funkcji XCIFs powoduje wadliwe XCI12. Ostatnie postępy w tej dziedzinie dostarczyły ważnych informacji na temat maszynerii molekularnej, która jest niezbędna do zainicjowania i utrzymania XCI.

Identyfikacja regulatorów XCI i zrozumienie ich mechanizmu w XCI jest bezpośrednio związane z chorobami ludzkimi sprzężonymi z chromosomem X, takimi jak zespół Retta (RTT)13,14. RTT jest rzadkim zaburzeniem neurorozwojowym spowodowanym heterozygotyczną mutacją w białku wiążącym metylo-CpG 2 sprzężonym z chromosomem X (MECP2), które dotyka głównie dziewcząt15. Ponieważ MECP2 znajduje się na chromosomie X, dziewczęta RTT są heterozygotyczne pod względem niedoboru MECP2 z ~50% komórek wykazujących ekspresję typu dzikiego i ~50% eksprymujących zmutowany MECP2. Warto zauważyć, że zmutowane komórki RTT zawierają uśpioną, ale dziką kopię Mecp2 na Xi, stanowiąc źródło funkcjonalnego genu, który w przypadku reaktywacji może potencjalnie złagodzić objawy choroby. Oprócz RTT istnieje kilka innych chorób u ludzi sprzężonych z chromosomem X, w przypadku których reaktywacja Xi stanowi potencjalne podejście terapeutyczne, takich jak zespół DDX3X.

Hamowanie XCIFs, kinazy białkowej zależnej od 3-fosfoinozytydu-1 (PDPK1) i receptora aktywiny A typu 1 (ACVR1), zarówno przez krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), jak i inhibitory małocząsteczkowe, reaktywuje geny sprzężone z Xi12. Farmakologiczną reaktywację genów sprzężonych z Xi obserwuje się w różnych modelach ex vivo, które obejmują linie komórkowe fibroblastów myszy, dorosłe neurony korowe myszy, fibroblasty embrionalne myszy i linie komórkowe fibroblastów pochodzące od pacjenta RTT12. Nie wiadomo jednak, czy farmakologiczna reaktywacja genów sprzężonych z Xi jest możliwa in vivo. Jednym z czynników ograniczających jest brak skutecznych modeli zwierzęcych do dokładnego pomiaru ekspresji genów z reaktywowanego Xi. W tym celu wygenerowano mysi model XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp, który przenosi genetycznie znakowany Mecp2 na Xi we wszystkich komórkach z powodu heterozygotycznej delecji w Xist na matczynym chromosomie X16. Korzystając z tego modelu, ekspresję Mecp2 z Xi określono ilościowo po leczeniu inhibitorami XCIFs w mózgu żywych myszy. W tym miejscu opisano generowanie mysiego modelu XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp oraz metodologię ilościowego oznaczania reaktywacji Xi w neuronach korowych przy użyciu testów opartych na immunofluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Praca z udziałem myszy została zatwierdzona przez University of Virginia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC; #4112).

1. Wygeneruj nielosowy model myszy XCI z genetycznie oznaczonym Mecp2 na Xi

UWAGA: Szczepy myszy użyte w badaniu były następujące: Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp (Mecp2tm3.1Bird, Tabela materiałów) i Xist/ΔXist (B6; 129-Xist; dostarczone przez Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle). Strategie hodowlane między odpowiednimi szczepami zostały zaprojektowane tak, aby rozszerzyć kolonie myszy dla każdego szczepu.

  1. Przeprowadzić genotypowanie PCR na wszystkich szczepach myszy i odpowiednich potomkach uzyskanych po hodowli przy użyciu starterów specyficznych dla genów wymienionych w tabeli 1.

2. Zaprojektuj strategię hodowli myszy, aby wygenerować XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-gfp

  1. Stwórz parę lęgową, trzymając razem samca Mecp2-Gfp/Y i samicę XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 (12 godzin/12 godzin: cykl jasny / ciemny) (Rysunek 1A). Najlepiej ustawić co najmniej 5 par lęgowych na raz, używając żywotnych i płodnych myszy. Po urodzeniu ciężarnej samicy pozwól jej wychować swój pierwszy miot z samcem.
    nuta: Ponieważ ojcowski nokaut Xist upośledza wdrukowane XCI, kompensację dawki i szlaki różnicowania17, użycie myszy XistΔ-Mecp2/Y w hodowli nie pozwoli na wyprodukowanie samic szczeniąt o wymaganym genotypie.
  2. Po odsadzeniu miotu w 21 dniu po urodzeniu (P21), zidentyfikuj i oznacz młode samice XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp za pomocą testu genotypowania opartego na PCR (Rysunek 1B).
    nuta: Jeśli chodzi o liczbę zwierząt potrzebnych w grupie, dla wyników przedstawionych poniżej, stworzono 5 par hodowlanych, które wygenerowały około 10 samic myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp.
  3. We wszystkich proponowanych eksperymentach należy używać żeńskich modeli mysich.
    nuta: Płeć jest ważną zmienną biologiczną w badaniach XCI, a model męski nie uwzględnia mylących skutków losowego XCI.
  4. Aby zachować spójność we wszystkich badaniach na zwierzętach i wykluczyć wszelkie skutki wieku zwierząt, wykonaj wszystkie eksperymenty na 5-8-tygodniowych samicach myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp.

3. Izoluj samice XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)

  1. Ustaw krycie czasowe między samcem Mecp2-Gfp/Y a samicą XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2. Ustaw co najmniej 3-4 klatki godowe, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zajścia w ciążę.
  2. Po potwierdzeniu czopa pochwowego rano po kryciu, oddziel samicę i ten dzień uważa się za dzień embrionalny 0,5 (E0,5). Monitoruj przyrost masy ciała potencjalnej ciężarnej samicy i sprawdź wzrokowo brzuch myszy, aby potwierdzić ciążę. Na E14.5−15.5 poddać eutanazji ciężarne samice myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Pod laminarnym kapturem przetrzyj brzuch ciężarnej samicy 70% etanolem. Za pomocą sterylnych nożyczek przeprowadź sekcję jamy brzusznej i usuń rogi macicy zawierające zarodki. Za pomocą kleszczy delikatnie wyjmij zarodki, odcinając pozostałą tkankę brzuszną (zwykle oczekuje się 6-12 zarodków).
  4. Umieścić rogi macicy zawierające zarodki w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 10 mm. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie wzdłuż rogów macicy, aby wyizolować poszczególne woreczki z zarodkiem. Ostrożnie umieść rogi macicy zawierające resztę zarodków w 30 ml sterylnego roztworu soli Hanksa (HBSS) na lodzie.
  5. Delikatnie rozetnij worek i odizoluj zarodek za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Usuń łożysko, przecinając pępowinę.
  6. Odetnij głowę zarodkowi.
    nuta: Podczas gdy reszta tkanki embrionalnej będzie dalej przetwarzana, tkanka z głowy zarodka zostanie wykorzystana do wyizolowania DNA do genotypowania.
  7. Otwórz brzuch, przecinając linię środkową zarodka za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Usuń narządy trzewne, takie jak serce, wątroba i płuca.
  8. Pozostałą tkankę zarodkową przenieść na sterylną płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i pokroić na małe kawałki za pomocą nożyczek lub żyletki. Aby rozbić grudki komórek, dodaj 3 ml trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  9. Zneutralizuj trypsynę-EDTA, dodając 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 10 μg/ml penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowca) do płytki i dysocjuj tkankę przez powtarzalne pipetowanie (około 20-30 razy).
  10. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś osad komórkowy w 4 ml DMEM z 10% FBS i 10 μg/ml długopisu/paciorkowca. Umieścić komórki na naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i wyhodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .
  11. Wykonaj kroki 3.5−3.10 dla każdego zarodka.
  12. Hodowle MEF uzyskane w kroku 3.11 przez co najmniej 3-4 dni.
    nuta: Na tym etapie MEF-y mogą być również kriokonserwowane do przyszłych eksperymentów.
  13. W celu określenia płci i genotypu każdego zarodka należy przeprowadzić genotypowanie PCR przy użyciu DNA wyizolowanego z głów zarodków przy użyciu starterów i warunków PCR wymienionych w tabeli 1.

4. Potwierdź brak ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) w mózgu myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp za pomocą testu opartego na sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją

  1. Za pomocą nożyczek oddziel korę mózgową od reszty półkul mózgowych i umieść w 1 ml lodowatego buforu do izolacji jąder (NIM) zawierającego 250 mM sacharozy, 25 mM chlorku potasu (KCl), 5 mM chlorku magnezu (MgCl2), 10 mM Tris-Cl, uzupełnionego 2% paraformaldehydem (PFA) i 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (Tabela materiałów).
  2. Homogenizować za pomocą homogenizatora ze szkła lodowatego.
  3. Odwirować homogenizowaną tkankę w temperaturze 600 x g, 4 °C przez 5 min.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 25% jodiksanolu w roztworze NIM.
  5. Dodać 1 ml 29% lodiksanolu w roztworze NIM do probówki ultrawirówki o pojemności 4 ml (przechowywać na lodzie do momentu, aż próbki będą gotowe) i ostrożnie ułożyć warstwę 1 ml próbki (w 25% lodiksanolu).
  6. Wirować w temperaturze 9 000 x g, 4 °C przez 10 minut w ultrawirówce.
  7. Odessać supernatant i zawiesić osad w 500 μl buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] uzupełniona 1 mM EDTA, 0,05% azydkiem sodu i 2% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]).
    nuta: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C lub do 1 tygodnia.
  8. Dodać 5 μl 7-amino-aktynomycyny D (7-AAD; 50 mg/ml) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wybarwić DNA.
  9. Analizuj próbki pod kątem sygnału 7-AAD i białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Określ wykonalność modelu myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp dla reaktywacji Xi

  1. Nasiona 1 x 105 komórek/ml żeńskie XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs, MEFy Mecp2/Mecp2-Gfp i Xist-Mecp2/Y otrzymane w kroku 3.12 w formacie 6-dołkowym i na szkiełkach komorowych, w DMEM z 10% FBS i 10 μg/ml długopisu/paciorkowca, w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2,
    UWAGA: MEF Mecp2/Mecp2-Gfp i Xist-Mecp2/Y są używane jako kontrole pozytywne i negatywne w eksperymentach.
  2. Po 24 godzinach dodać świeżą pożywkę do komórek. W przypadku XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFów dodać pożywkę uzupełnioną inhibitorami XCIFs (np. 0,5 μM LDN193189 i 2,5 μM GSK650394) lub sam nośnik. Pożywkę uzupełnioną nowym inhibitorem lub samym nośnikiem należy wymieniać co 2 dni. W przypadku MEFów Mecp2/Mecp2-Gfp i Xist-Mecp2/Y dodawaj świeże podłoże co 2 dni.
  3. Po 1 tygodniu leczenia inhibitorem należy pobrać MEF-y do izolacji RNA (płytka 6-dołkowa) lub utrwalić komórki do immunofluorescencji (szkiełka komorowe). Stosować MEF wyizolowane z zarodków Mecp2/Mecp2-Gfp jako zarodki dodatnie i zarodki Xist-Mecp2/Y jako kontrolę ujemną.
    1. W celu izolacji RNA należy wyizolować całkowity RNA za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny i dokonać odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Zmierz ekspresję Mecp2-Gfp za pomocą ilościowej odwrotnej transkryptazy-PCR (qRT-PCR) przy użyciu Mecp2-WT i Mecp2-GFP oraz starterów wymienionych w Tabeli 1, jak opisano wcześniej12.
    2. W przypadku immunofluorescencji należy zabarwić MEF pierwszorzędowym przeciwciałem anty-GFP (1:100), jak opisano wcześniej12,16. Zmierz intensywność GFP za pomocą ilościowej immunofluorescencji w MEF XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp, jak opisano wcześniej18.

6. Zademonstruj farmakologiczną reaktywację Xi w mózgu mysiego modelu XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp

  1. Przygotuj leki i kontrolę pojazdu.
    1. Przygotować świeży, sterylny roztwór podłoża (0,9% NaCl, 0,5% metylocelulozy, 4,5% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do wstrzykiwań do mózgu.
    2. Przygotować inhibitory chemiczne, w tym 1,5 mM LDN193189 (małocząsteczkowy inhibitor ACVR1) i 1,6 mM GSK650394 (małocząsteczkowy inhibitor SGK1, efektor PDPK1) ponownie zawieszone w podnośniku (0,9% NaCl, 0,5% metylocelulozy, 4,5% DMSO) lub sam nośnik. Całkowita objętość wstrzykniętych inhibitorów chemicznych lub nośnika wynosi 10 μl na dawkę na zwierzę.
  2. Przygotuj zwierzę do wstrzyknięć do mózgu.
    1. Przygotuj obszar operacyjny, przecierając ławkę i poduszkę grzewczą środkiem dezynfekującym (10% roztwór podchlorynu sodu).
    2. Znieczulić 4-tygodniową mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny ketaminy/ksylazyny w dawce odpowiednio 140 mg/kg i 10 mg/kg. Użyj odruchu wycofania pedału, aby określić poziom znieczulenia.
    3. Nałóż maść okulistyczną na oczy po indukcji znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    4. Zgolić sierść od szyi do czubka głowy myszy.
    5. Ustaw mysz na platformie stereotaktycznej, zaczepiając siekacze myszy o belkę zgryzową ogranicznika pyska i dokręcając zacisk nosowy nad pyskiem, upewniając się, że głowa myszy znajduje się na płaskiej płaszczyźnie.
    6. W razie potrzeby dostosuj wysokość nauszników, aby dotrzeć do ogonowej części przewodu słuchowego, zabezpieczając je tak, aby głowa myszy znajdowała się w płaszczyźnie poziomej i była unieruchomiona przy dotknięciu palcem.
    7. Zdezynfekuj głowę myszy naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak powidon-jod i 70% etanol.
  3. Podawać leki.
    1. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj poziome nacięcie o długości 0,75 cm w środkowej części skóry głowy.
    2. Za pomocą zadzioru 0,45 mm wywierć dwa symetryczne otwory nad prawą i lewą półkulą korową (2 mm od szwu strzałkowego i 2 mm od szwu lambdoidalnego, mniej więcej pośrodku kości ciemieniowej).
    3. Mocno przymocuj strzykawkę o pojemności 10 μl do platformy stereotaktycznej.
    4. Wymieszać roztwór chemicznych inhibitorów i pobrać 10 μl roztworu do strzykawki. Należy unikać umieszczania pęcherzyków powietrza w strzykawce.
    5. Wsunąć igłę strzykawki do otworu w zadziorach, utrzymując igłę prostopadle (90°) do czaszki. Gdy igła przechodzi przez czaszkę, wyzeruj współrzędne na stereotaktycznym wyświetlaczu cyfrowym, a następnie przesuwaj końcówkę igły, aż osiągnie głębokość 2,5 mm.
    6. Wyciągnąć igłę 0,5 mm na głębokość 2 mm.
    7. Powoli wstrzyknąć 10 μl roztworu (~1 min). Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w mózgu na ~1 minutę, a następnie wyjąć igłę.
    8. Powtórzyć wstrzyknięcie dla drugiej półkuli (kontrola tylko pojazd).
    9. Za pomocą szwów lub "kleju do skóry" zamknij skórę myszy (jeśli rana jest > 0,5 cm, należy użyć zarówno szwów, jak i "kleju do skóry").
    10. Poluzuj nauszniki i wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego.
    11. Podać leki przeciwbólowe (buprenorfina SR 0,5 mg/kg IP) i umieścić mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aż zwierzę odzyska przytomność.
    12. Gdy mysz będzie czujna i zareaguje, przenieś zwierzę z powrotem do jego pierwotnej klatki.
    13. Powtarzaj procedurę co 2 dni przez 20 dni. Wielokrotne wiercenie obszaru nie jest wymagane w przypadku kolejnych iniekcji.
  4. Odizoluj mózg myszy.
    1. Po zakończeniu schematu dawkowania należy poddać mysz eutanazji w komorze CO2 .
    2. Unieruchamij mysz na powierzchni za pomocą igieł.
    3. Wykonaj boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową za pomocą nożyczek i kleszczy. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.
    4. Za pomocą nożyczek przetnij przeponę i kontynuuj cięcie na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.
    5. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie na tylnym końcu lewej komory.
    6. Natychmiast należy rozpocząć wstrzykiwanie do prawej komory serca ~15 ml PBS w ciągu ~2 min. Zmiana koloru wątroby z czerwonego na bladoróżowy wskazuje na dobrą perfuzję.
    7. Wstrzyknąć do prawej komory serca myszy ~10 ml 4% paraformaldehydu w PBS przez ~2 min.
    8. Odetnij głowę myszy i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
    9. Umieść jedną końcówkę nożyczek w otworze wielkim i naciąć bocznie w czaszce w kierunku oka. Powtórz dla drugiej strony. Staraj się, aby koniec nożyczek był jak najbardziej powierzchowny, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.
    10. Użyj nożyczek, aby wyciąć obszar między oczami i nad nosem myszy.
    11. Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać kości czaszki od półkul mózgowych.
    12. Podnieś mózg szpatułką i użyj nożyczek, aby ostrożnie wyciąć włókna nerwowe czaszki, które mocują go do czaszki.
    13. Umieść mózg na plastikowym naczyniu, wytnij móżdżek i opuszki węchowe, a następnie umieść mózg w 15 ml probówce wypełnionej 4% PFA to PBS.
  5. Kriosekcja mózgu myszy.
    1. Napraw mózg w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Przepłukać mózg PBS w temperaturze 4 °C co najmniej 3 razy przez 5 minut każdy.
    3. Oznacz jednorazowe formy do kriokonserwacji tkanek.
    4. Wytnij przednią część mózgu za pomocą nożyczek i kleszczy (zacznij robić skrawki ~5 mm z miejsc wstrzyknięcia).
    5. Przenieś mózg do kriomoldu z przodu mózgu skierowanym w dół, aby uzyskać przekroje koronalne. Zanurz mózg zawierający formę w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT).
    6. Wlej ciekły azot do plastikowej szalki Petriego o średnicy 10 mm i umieść mózg w krioformie w azocie.
      nuta: Ważne jest, aby ustawić tkankę zgodnie z opisem w kroku 6.5.5, aby pokierować sekcją mózgu.
    7. Gdy OCT stanie się jednolicie biały, umieść zamrożony mózg w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
    8. Zrównoważyć mózg do -20 °C przez co najmniej 30 minut przed sekcją za pomocą kriostatu i kriosekcji (5−6 μm grubości) mózgu, montując 2−3 sekcje na szkiełku. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  6. Określ reaktywację Xi przy użyciu podejścia opartego na immunofluorescencji.
    1. Przed rozpoczęciem procedury barwienia należy wysuszyć skrawki mózgu przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Zanurzyć szkiełka w roztworze do pobierania antygenu (0,1 M kwasu cytrynowego, 0,1 M zasady Tris, pH = 6,0) na bloku grzewczym o temperaturze 100 °C na 5 minut.
    3. Myj szkiełka 4x z 1x PBS przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej.
    4. Zanurzyć szkiełka w roztworze blokującym (0,1 M NH4Cl/PBS/0,2% żelatyny/0,05% niejonowego środka powierzchniowo czynnego) na 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Myj szkiełka 3x buforem do płukania (PBS/0,2% żelatyny) w temperaturze pokojowej przez 5 min każde.
    6. Wybarwić skrawki mózgu przeciwciałami anty-GFP-AlexaFluor647 (1:100) i anty-MAP2 (1:1000) w pożywce inkubacyjnej (PBS/0,2% żelatyny/1% BSA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    7. Zbierz przeciwciała pierwotne (można je ponownie użyć). Myć szkiełka 4x z buforem do płukania przez łącznie 30 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Inkubować skrawki mózgu z kozim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (1:1,000) w pożywce inkubacyjnej i inkubować 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
    9. Myć szkiełka 4x z buforem do płukania przez łącznie 30 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Umieścić kroplę podłoża mocującego z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 50 mm, a następnie odwrócić szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe, pokrywając wszystkie skrawki tkanki.
    11. Obraz pod mikroskopem i dostosuj obrazy pod kątem kontrastu i jasności. Uchwyć obrazy i określ ilościowo liczbę komórek GFP-dodatnich zarówno dla półkul mózgowych myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp leczonych lekiem, jak i poddanych działaniu nośnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby wykazać wykonalność zastosowania modelu mysiego XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp w badaniach nad reaktywacją Xi, przetestowano reaktywację sprzężonego z Xi genu Mecp2-Gfp za pomocą inhibitora XCIF w zarodkowych fibroblastach mysich (MEF). Samice MEF wyizolowano z embrionów XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp w dniu 15.5, zgodnie z opisem w sekcji 3 (Rysunek 1A). Genotypy samic MEF XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp potwierdzono za pomocą PCR genotypująceg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wcześniej zidentyfikowano XCIF, które są selektywnie wymagane do wyciszania genów sprzężonych z Xi w komórkach żeńskichssaków12. Następnie zoptymalizowaliśmy silne inhibitory małocząsteczkowe pod kątem XCIF, takich jak ACVR1 i efektory PDPK1, które skutecznie reaktywują Mecp2 sprzężony z Xi w liniach komórkowych fibroblastów myszy, neuronach korowych myszy i ludzkiej linii komórkowej fibroblastów pochodzącej od pacjenta z RTT. Wyniki te sugerują, że reaktywacja Xi jest prawdopodobnym pode...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Antonio Bedalovowi za dostarczenie odczynników; Rdzeń histologii tkanek Uniwersytetu Wirginii do kriosekcji; Rdzeń cytometrii przepływowej Uniwersytetu Wirginii do analizy cytometrii przepływowej; Christianowi Blue i Saloniemu Singhowi za pomoc techniczną w genotypowaniu. Praca ta została wsparta grantem badawczym Double Hoo dla Z.Z. oraz nagrodą programu pilotażowego przyznaną przez University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award oraz nagrodą Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award dla S.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MICE
Mecp2tm3.1BirdLaboratorium Jacksona#014610
B6; 129-Xist (tm5Sado)dostarczone przez Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
ODCZYNNIKI
22x22 mm szkiełko nakrywkoweFISHERfinest (Fisher Scientific)125488
32% ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15714-S
Strzykawka 50 mlMedline IndustriesNPMJD50LZ
Naczynie hodowlane 60 mmCellStar628160
7-AAD BioLegend420403
chlorek amonu (NH4Cl)Fisher ChemicalA661-3
anty-GFP-AlexaFluor647InvitrogenA-31852
anty-MAP2Aves LabsMAP
BSAPromegaR396D
Buprenorfina SRZoopharm
kwas cytrynowy SigmaC-1857
DMSOFisher BioodczynnikiBP231-100
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)Corning Cellgro10-013-CV
EtanolDecon Labs2701
płodowa surowica bydlęca (FBS)VWR Life Science89510-198
żelatynaSigma-AldrichG9391
szkiełkapodstawowe Fisherbrand22-034-486
kozie przeciwciało wtórne anty-kurczak znakowane FITC AvesLabs F-1005
GSK650394ApexBioB1051
hamilton 10μ l strzykawka Hamilton Sigma-Aldrich28615-U
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco14025-092
KetaminaKetasetNDC 0856-2013-01
Duże/zakrzywione nożyczkiFine Science Tools14519-14
LDN193189Cayman Chemicals11802
lodixanolSigma
chlorek magnezu (MgCl2)Fisher ChemicalM35-212
MetylocelulozaSigmaM0262-100G
podłoże montażowe z DAPI VectashieldH-1200
Końcówka igły, 26 GA x 1,25"PrecisionGlide
Refresh Lacri-Lube93468
optymalna temperatura skrawania (O.C.T.) Mieszanka
PCR
Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep)Corning30-002-Cl
Solanka buforowana fosforanem pH 7,4 (PBS)Corning Cellgro46-103-CM
Chlorek potasu (KCl)Ostrza
Płytka szklana lub plastikowa taca
klej do skóry / klej tkankowy3M Vetbond1469SB
azydek soduFisher ScientificCAS 26628-22-8
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ChemicalS642-212
standardowe kleszcze do hemostatuFine Science Tools13013-14
Pęseta standardowaFine Science Tools11027-12
Nożyczki do prostych tęczówekFine Science Tools14058-11
sacharozaFisher ScientificBP220-1
Tris-baseBioreagents FisherBP152-5
Triton X-100Fisher BioreagentsBP151-500
Trypsyna-EDTA Gibco15400-054
XylazineAkornNDC: 59399-111-50
WYPOSAŻENIE
Mikroskop komórkowy Zeiss AxioObserver ZeissZeiss AxioObserver
Frez 0,45 mm IDEALMicroDrill67-1000
BD FACScalibur
inkubator do hodowli komórkowychThermo Scientific HERACELL VIOS 160i13-998-213
Leica 3050S kriostat
platforma
termocykler
Timer
Beckman Coulter Optima L-100 XP
Łaźnia wodna (37 º C)Fisher Scientific Isotemp 2239
1343517Maść okulistyczna 305111 ThermoFisher skalpela Fisher Scientific P330-500 homogenizator szkła wirówkowego badawczystereotaktycznaUltrawirówka

Bibliografia

  1. Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
  2. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  3. Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
  4. Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
  5. Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
  6. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  7. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
  8. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
  9. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383(2016).
  10. Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
  11. Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
  12. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
  13. Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
  14. Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
  15. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
  16. Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
  17. Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
  18. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  19. Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inaktywacja chromosomu Xreaktywacja Mecp2wstrzykiwanie stereotaktyczneinhibitory XCIFprzetwarzanie tkanki m zgowejbarwienie immunofluorescencyjneanaliza cytometrycznaMecp2 z etykiet GFP

Powiązane artykuły