$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie procedury opisane poniżej (sekcje 4-7) zostały zoptymalizowane przy użyciu zarówno samców, jak i samic myszy C57BL/6. Podejście to zostało zweryfikowane na myszach o masie ciała od 19 do 40 g.
1. Stworzenie platformy do administrowania IB
- Zegnij podpórkę od pierwotnego kąta 90° między skrzydłem podstawowym a skrzydłem stojącym do 70° (Rysunek 2A).
- Wywierć otwór w środkowej górnej części stojącego skrzydła metalowej podpórki do książek (Rysunek 2A).
- Wywierć otwór o identycznym rozmiarze w odpowiednim miejscu plastikowej deski. Wywierć dwa mniejsze otwory dolnie i bocznie (Rysunek 2A).
- Ułóż jedwabny szew w proporcji 4:0 pomiędzy tymi małymi otworami w plastikowej desce (Rysunek 2A).
- Umieść taśmę rzepową na krawędzi plastikowej tablicy (Rysunek 2A).
- Przymocuj plastikową tablicę do metalowej podpórki za pomocą (Rysunek 2B). Upewnij się, że nakrętka śrubowa jest wystarczająco dokręcona, aby utrzymać deskę na miejscu, umożliwiając jednocześnie regulację kąta, jeśli to konieczne.
- Upewnij się, że plastikowa tablica obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, poruszając się swobodnie.
UWAGA: Ruch w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara jest reprezentowany w tym raporcie jako obrót o (+) stopień, a ruch w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara jest reprezentowany jako obrót o (-) stopień.
- Za pomocą kątomierza ustaw plastikową tablicę pod kątem +30°, +86°, -30° i -74° i zaznacz je odpowiednio na podpórce.
2. Stworzenie rozszerzonych cewników do podawania IB
- Wykonaj cięcie pod kątem prostym ostrym ostrzem na końcówce oryginalnego cewnika 22 G (25 mm, patrz Tabela materiałów) (Rysunek 3, krok 1a).
- Skos (~50°–60°) końcówki drugiego oryginalnego cewnika (25 mm) z ostrzem, a następnie odciąć pod kątem prostym od piasty (Rysunek 3, krok 1b).
- Przyklej dwa cewniki na ich końcach pod kątem nieco mniejszym niż 180° (Ryc. 3, krok 2).
- Stępić skośną końcówkę przez stopienie za pomocą kauteryzacji w niskiej temperaturze (patrz Tabela materiałów).
- Wypoleruj przedłużony cewnik papierem ściernym o rozmiarze "0" na klejonym obszarze i skośnej końcówce przedłużonego cewnika (Rysunek 3, krok 3).
- Zaznacz na przedłużonym cewniku różne kolory w odległości 25 mm, 30 mm i 35 mm (Rysunek 3, krok 3).
- Wskaż skośną stronę przedłużonego cewnika, oznaczając jego piastę markerem.
- Przepłukać przedłużony cewnik wodą demineralizowaną, a następnie przepłukać wnętrze cewnika 70% etanolem. Wysuszyć cewnik na powietrzu.
- Sterylizuj światłem UV przez 10 minut przed użyciem.
3. Przygotowanie do zabiegu
- Wszystkie podawane środki należy umieścić w biologicznym kapturze bezpieczeństwa w sterylnej technice.
- Oczyść miejsce pracy 70% etanolem.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.
- Przymocuj podstawę platformy roboczej do stołu bezpośrednio przed badaczem, przymocowując zaciski C do podstawowego skrzydła podpórki do książek.
- Wygeneruj kilka prowizorycznych spirometrów, czyli urządzeń, które pozwolą na wykrycie pływowego przepływu powietrza u myszy. Krótko mówiąc, umieść 60 μl wysterylizowanej soli fizjologicznej w strzykawce o pojemności 1 ml (bez tłoka) z końcówką ładującą żel.
UWAGA: Zdeponowana kropla soli fizjologicznej zasłania beczkę i porusza się w górę i w dół, gdy jest wystawiona na wentylację pływową3.
- Luźno przymocuj piastę przedłużonego cewnika 22 G do prowizorycznego spirometru.
- Umieść każdy ze szklanych zakraplaczy po obu stronach platformy, aby ułatwić dostęp.
- Podłączyć komorę indukcyjną izofluranu do aparatu do znieczulania gryzoni (patrz tabela materiałów) w komorze bezpieczeństwa biologicznego zgodnej z izofluranem.
4. Nieoperacyjne podejście do intubacji IT
- Znieczulić mysz C57BL/6 (samiec lub samica, 8–10 tygodni, ~25 g) tlenem (2 l/min) i 5% izofluranem (patrz tabela materiałów) w komorze indukcyjnej przez 4 minuty.
- Odessać czynnik doświadczalny, który ma być dostarczony (np. niebieski barwnik Evansa lub dekstran FITC, jak pokazano na Rysunek 4) do dwóch pipet, a następnie umieścić je po obu stronach platformy podczas sedacji.
- Upewnij się, że częstość oddechów wynosi około 24–30 oddechów/min przed wyjęciem myszy z komory indukcyjnej znieczulenia.
UWAGA: Znieczulenie izofluranem trwa zazwyczaj 4 minuty, co jest wystarczające dla wszystkich zabiegów IB. Jeśli operator nie jest biegły w tej technice, ketamina/ksylazyna (80 mg/kg i 10 mg/kg dootrzewnowo, patrz tabela materiałów) może być użyta do bardziej długotrwałego znieczulenia.
- Zawieś mysz za siekacze na udrapowanej linii szwu w pozycji leżącej. Zabezpiecz mysz dwoma lub trzema kawałkami haczyka i luźno owiń taśmę, unikając ograniczenia wentylacji.
- Włącz oświetlacz światłowodowy LED (patrz Tabela materiałów, Rysunek 2C).
- Ustaw operatora za platformą (grzbietem do myszy).
- Ustaw gęsią szyję oświetlacza tak, aby oświetlał obszar krtani przez skórę. Odległość między myszą a źródłem światła wynosi 2–3 cm (Rysunek 2C).
- Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca/łapy przed wykonaniem wszystkich poniższych procedur.
- Przytrzymaj sterylne kleszcze dominującą ręką, a następnie wyciągnij język z jamy ustnej za pomocą kleszczy.
- Przytrzymaj sterylny depresor ręką niedominującą, a następnie spłaszcz nasadę języka za pomocą depresora, aby szeroko odsłonić część ustno-gardłową. Kleszcze można następnie zwolnić, uwalniając dominującą rękę.
- Użyj dominującej ręki, aby zaintubować przedłużony cewnik do tchawicy przez jamę ustną (Rysunek 2C).
- Potwierdź umieszczenie, obserwując, czy bańka w strzykawce porusza się w górę i w dół z każdym oddechem.
- Dodatkowe szczegóły dotyczące intubacji IT zostały opublikowane wcześniej3. Całkowity czas zabiegu, bez znieczulenia, trwa 10–15 s dla dobrze wyszkolonego operatora.
5. Nieoperacyjna intubacja IB i metody porodu
- Podejście IB do selektywnej kaniulacji płatowej dystalnego prawego płuca
- Po wykonaniu kaniulacji IT (krok 4.11) obróć plastikową płytkę o +30° (Rysunek 4A).
- Przytrzymaj piastę cewnika i prowadź go w sposób naturalny równolegle do linii środkowej myszy, rozciągając go na głębokość zależną od masy, jak opisano w tabeli 1.
UWAGA: Należy zwrócić uwagę na opór na tych głębokościach. W tym momencie mysz stanie się lekko tachypneiczna, jak wyjaśniono w reprezentatywnych wynikach. Dla doświadczonego operatora około 90% prób pomyślnie kaniuluje prawe płuco (z odnotowanym przyspieszonym oddechem).
- Dostarczyć 20 μl 0,3% niebieskiego barwnika Evansa (EBD, patrz tabela materiałów) za pomocą końcówki ładującej żel.
- Dozuj 1–2 porcje (po 0,1 ml każdy) powietrza za pomocą szklanego zakraplacza.
UWAGA: Zapewnia to usunięcie resztkowego roztworu EBD (lub środków eksperymentalnych) z wnętrza cewnika.
- Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 sekund.
- Połóż zwierzę na ocieplającym kocu, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.
- Podejście IB do selektywnej segmentowej kaniulacji dystalnego lewego płuca
- Po wykonaniu kaniulacji IT (krok 4.11) obróć plastikową płytkę o -74° (Rysunek 4B).
- Przytrzymaj piastę cewnika i delikatnie dociśnij, aby wsunąć cewnik do lewego oskrzela głównego pnia, jednocześnie wywierając umiarkowany nacisk zarówno w dół (90°), jak i w kierunku podnóżka. Na głębokościach podanych w tabeli 1 operator powinien zwrócić uwagę na opór, gdy dolne segmenty lewego płuca są zaangażowane. Jeśli wystąpi przyspieszony oddech, wycofaj cewnik do pozycji 20–25 mm i spróbuj ponownie.
- Po kaniulacji lewych dolnych segmentów płuc wymagana jest zmiana położenia, aby umożliwić grawitacyjne wspomaganie podawania środka. Obróć plastikową tablicę o -30° (Rysunek 4B).
- Dostarcz 40 μl 0,3% EBD za pomocą końcówki ładującej żel.
UWAGA: Możliwe jest dostarczenie większej objętości środka, ponieważ lewe płuco ma tylko jeden płat .
- Dozować 1–2 porcje (0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanych zakraplaczy.
UWAGA: Zapewnia to usunięcie wszelkich pozostałości EBD (lub środków eksperymentalnych) z wnętrza cewnika.
- Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 sekund.
- Połóż zwierzę na ocieplającym kocu, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.
- Dostosowanie podawania IB w celu umożliwienia podania środka do całego płuca lewego lub prawego
UWAGA: Jeśli operator stara się dostarczyć środki nie do określonego płata prawego płuca lub lewego segmentu płuca, ale raczej do całego płuca (prawego lub lewego płuca), cewnik należy lekko wycofać do odpowiednich oskrzeli pniowych, jak poniżej.
- Prawe podanie całego płuca
- Po kroku 4.11 obróć plastikową tablicę o +30° (Rysunek 5A).
- Przytrzymaj piastę cewnika i prowadź go w sposób naturalny równolegle do linii środkowej myszy, docierając do głębokości niezbędnej do prawostronnej kaniulacji dystalnego płata (Tabela 1).
- Potwierdź pojawienie się objawu przyspieszonego oddechu.
- Obróć mysz o -74°, aby włączyć wspomaganie grawitacyjne dla dostarczania agenta ( Rysunek 5B).
- Wycofać cewnik do pozycji odpowiadającej startowi prawego oskrzela głównego (Tabela 1). Upewnij się, że skos cewnika jest skierowany w dół (Rysunek 5B).
- Dostarczyć 30 μl 0,3% EBD za pomocą końcówki ładującej żel do prawego płuca.
- Dozuj 1–2 porcje (po 0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanego zakraplacza.
- Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 s. Połóż zwierzę na kocu rozgrzewającym, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.
- Podanie całego lewego płuca
- Po kroku 4.11 obróć plastikową tablicę o -74° (Rysunek 6A). Alternatywnie, po kroku 5.3.1.8 może nastąpić rotacja poprzez wycofanie cewnika do tchawicy, co umożliwia obustronne podanie IB.
- Przytrzymaj piastę cewnika i delikatnie dociśnij, aby wsunąć cewnik do lewego cewnika głównego mostka, jednocześnie wywierając umiarkowany nacisk zarówno w dół (90°), jak i w kierunku podnóżka. Głębokość intubacji jest określona w tabeli 1.
- Potwierdź brak objawu przyspieszonego oddechu.
- Obróć mysz o +86°, aby umożliwić grawitacyjną pomoc w podawaniu środka.
- Wycofaj cewnik do lewego oskrzela głównego pnia (te same odległości, co prawe płuco są wystarczające, Tabela 1) i obróć skos cewnika skierowany w dół (Rysunek 6B).
- Dostarczyć 30 μl 0,3% EBD za pomocą końcówki ładującej żel do lewego płuca.
- Dozuj 1–2 porcje (po 0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanego zakraplacza.
- Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 s. Połóż zwierzę na kocu rozgrzewającym, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.
6. Zastosowanie sekwencyjnych metod kaniulacji IB w celu dostarczenia dostosowanych do dawki objętości środka do każdego płuca
- Grupa administracyjna IT
- Wykonaj kaniulację IT zgodnie z opisem w krokach 4.1–4.11.
- Dostarczyć 60 μl 0,05% dekstranu FITC (patrz Tabela Materiałów) za pomocą końcówki do ładowania żelem (Rysunek 1B).
- Dozuj 1–2 porcje (po 0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanych zakraplaczy.
- Utrzymuj pozycję przez 60 s i pozwól na odzyskanie myszy, jak opisano powyżej.
- Symetryczne obustronne podawanie IB
- Wykonaj kroki 5.3.1.1–5.3.1.8 (prawe płuco) i 5.3.2.1–5.3.2.8 (lewe płuco).
- Podawać równe objętości (30 μl) 0,05% dekstranu FITC (lub środka eksperymentalnego) do każdej strony płuca.
- Podawanie obustronnego IB w zależności od dawki
- Wykonaj kroki 5.3.1.1–5.3.1.8 (prawe płuco) i kroki 5.3.2.1–5.3.2.8 (lewe płuco).
- Większą objętość (40 μl) 0,05% dekstranu FITC należy podać do większego prawego płuca, a mniejszą objętość (20 μl) 0,05% dekstranu FITC do mniejszego lewego płuca. Zamiast dekstranu FITC można podać środek eksperymentalny.
7. Stosowanie IB dostosowanego do dawki w celu poprawy symetrii uszkodzenia płuc wywołanego pojedynczą dawką bleomycyny (BLM)
- Grupy administracyjne BLM
- Grupa podawania IB-BLM dostosowana do dawki (1,2 mg/kg, patrz tabela materiałów): myszom dostarczono 60 μl (odpowiednio 20 μl dla lewego płuca i 40 μl dla prawego płuca) roztworu BLM (n = 5). Osoby z grupy kontrolnej (n = 5) otrzymały podobne ilości soli fizjologicznej.
UWAGA: Patrz kroki 5.3.1 i 5.3.2.
- Grupa administracji IT: 60 μl rozwiązania BLM dostarczono do myszy z technikami administrowania IT.
UWAGA: Patrz kroki 6.1.1–6.1.4.
- Pomiar czynności płuc
- W 21 dniu po BLM lub soli fizjologicznej znieczulij myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym (IP) ketaminy (160 mg / kg) i ksylazyny (32 mg / kg).
- Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia przez uszczypnięcie łapy/palca u nogi należy wykonać tracheostomię za pomocą kaniuli 18 G (patrz tabela materiałów).
- Podłącz myszy do respiratora i zmierz mechanikę oddychania zgodnie z wcześniejszym opisem4.
- Pobieranie i przetwarzanie tkanki płucnej
- Po pomiarze mechaniki płuc poddaj znieczulone myszy eutanazji przez nakłucie serca.
- Otwórz ścianę klatki piersiowej i wywołaj obustronną odmę opłucnową.
- Napompuj płuca 1% niskotopliwą agarozą (40 °C)5 w PBS pod stałym ciśnieniem (42 cm H2O).
- Wytnij cztery do pięciu kawałków płuca wzdłuż długiej osi poprzecznie, utrwal w 10% formalinie i zanurz w parafinie.
- Wytnij odcinki 5 μm i zabarwij trichromem Massona, aby uwidocznić osadzanie kolagenu.
8 Opieka pozabiegowa
- Pod koniec procedur przetrwania należy położyć zwierzę na kocu rozgrzewającym, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.