Artykuł metodologiczny

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

DOI:

10.3791/59452

⸱

10 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole pokazujemy i rozwijamy, jak używać ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania i oczyszczania kardiomiocytów, a ponadto, jak poprawić efektywność ich przeszczepu za pomocą wstępnego leczenia inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym czynnikiem w poprawie skuteczności terapii komórkowej w regeneracji mięśnia sercowego jest bezpieczne i efektywne zwiększenie szybkości wszczepiania komórek. Y-27632 jest bardzo silnym inhibitorem kinazy białkowej zawierającej zwinięte cewki związane z Rho (RhoA/ROCK) i jest stosowany w celu zapobiegania apoptozie komórek wywołanej dysocjacją (anoikis). Wykazujemy, że wstępne leczenie Y-27632 indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CMs+RI) przed implantacją powoduje poprawę szybkości przeszczepiania komórek w mysim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego (MI). W tym miejscu opisujemy pełną procedurę różnicowania, oczyszczania i wstępnego traktowania komórek hiPSC-CM za pomocą Y-27632, a także wynikającego z tego skurczu komórek, pomiarów stanów przejściowych wapnia i przeszczepu do mysich modeli MI. Proponowana metoda zapewnia prostą, bezpieczną, skuteczną i tanią metodę, która znacznie zwiększa szybkość wszczepiania komórek. Metoda ta może być stosowana nie tylko w połączeniu z innymi metodami w celu dalszego zwiększenia efektywności przeszczepu komórek, ale także stanowi korzystną podstawę do badania mechanizmów innych chorób serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie oparte na komórkach macierzystych wykazały znaczny potencjał w leczeniu uszkodzeń serca spowodowanych przez MI1. Zastosowanie zróżnicowanych hiPSCs stanowi niewyczerpane źródło hiPSC-CMs2 i otwiera drzwi do szybkiego rozwoju przełomowych metod leczenia. Pozostaje jednak wiele ograniczeń w translacji terapeutycznej, w tym wyzwanie związane z bardzo niskim wskaźnikiem wszczepiania wszczepionych komórek.

Dysocjacja komórek za pomocą trypsyny inicjuje anoikis3, który jest przyspieszany tylko wtedy, gdy te komórki są wstrzykiwane do trudnych warunków, takich jak niedokrwienny mięsień sercowy, gdzie niedotlenione środowisko przyspiesza bieg w kierunku śmierci komórki. Spośród pozostałych komórek duża część jest wypłukiwana z miejsca implantacji do krwiobiegu i rozprzestrzenia się po całym obwodzie. Jednym z kluczowych szlaków apoptotycznych jest szlak RhoA/ROCK4. Opierając się na wcześniejszych badaniach, szlak RhoA/ROCK reguluje organizację cytoszkieletu aktyny5,6, który jest odpowiedzialny za dysfunkcję komórki7,8. Inhibitor ROCK Y-27632 jest szeroko stosowany podczas dysocjacji i pasażu komórek somatycznych i macierzystych, w celu zwiększenia adhezji komórek i zmniejszenia apoptozy komórek9,10,11. W tym badaniu Y-27632 jest stosowany w leczeniu hiPSC-CM przed przeszczepem w celu zwiększenia szybkości wszczepiania komórek.

Ustanowiono kilka metod mających na celu poprawę szybkości przeszczepiania komórek, takich jak szok cieplny i powlekanie macierzy błony podstawnej12. Oprócz tych metod, technologia genetyczna może również promować proliferację kardiomiocytów13 lub odwracać komórki niemięśnia sercowego do kardiomiocytów14. Z punktu widzenia bioinżynierii, kardiomiocyty są umieszczane na rusztowaniu z biomateriału w celu poprawy wydajności przeszczepu15. Niestety, większość z tych metod jest skomplikowana i kosztowna. Wręcz przeciwnie, proponowana tutaj metoda jest prosta, opłacalna i skuteczna i może być stosowana jako leczenie podstawowe przed przeszczepem, a także w połączeniu z innymi technologiami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Alabama w Birmingham i były oparte na wytycznych National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use (Publikacja NIH nr 85-23).

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i płytek hodowlanych

  1. Przygotowanie podłoża
    1. W przypadku pożywki hiPSC zmieszać 400 ml podłoża podstawowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) (tabela materiałów 1) i 100 ml suplementu hPSC 5x; mieszaninę przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. W przypadku pożywki RPMI 1640/B27 minus insulina (RB-) wymieszaj 500 ml RPMI 1640 i 10 ml suplementu B27 bez insuliny.
    3. W przypadku pożywki RPMI 1640/B27 (RB+) wymieszaj 500 ml RPMI 1640, 10 ml suplementu B27 i 5 ml antybiotyku penicylina-streptomycyna (pen-strep).
    4. Dla pożywki oczyszczającej16, wymieszaj 500 ml RPMI 1640 bez glukozy, 10 ml suplementu B27, 5 ml antybiotyku pen-strep i 1,000 μL roztworu DL-mleczanu sodu (o końcowym stężeniu 4 mM).
    5. Aby uzyskać roztwór neutralizujący, wymieszaj 200 ml RPMI 1640, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2,5 ml antybiotyku pen-strep i 50 μl Y-27632 (przy końcowym stężeniu 10 μM).
    6. W przypadku pożywki do zamrażania wymieszać 9 ml FBS, 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i 10 μl Y-27632 (przy końcowym stężeniu 10 μM).
    7. W przypadku roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej (EMS) należy rozmrozić zagęszczoną macierz zewnątrzkomórkową (tabela materiałów 1) w temperaturze 4 °C, aż do osiągnięcia równomiernie spójnego stanu ciekłego. Schłodzone końcówki i probówki do pipet przed przygotowaniem podwielokrotności matrycy po 350 μl każda na lodzie i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed pokryciem płytek rozcieńczyć jedną rozmrożoną porcję w 24 ml lodowatego podłoża DMEM/F12 (EMS); przechowywać EMS w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
      nuta: Wszystkie etapy powlekania należy wykonać na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się macierzy błony podstawnej.
    8. Do roztworu Tyrode'a weź 90% końcowej wymaganej objętości wody klasy kultur tkankowych, dodaj odpowiednią ilość następujących odczynników i mieszaj aż do rozpuszczenia. Następnie użyj 1 N NaOH, aby dostosować pH do 7,4. Dodaj więcej wody do końcowego stężenia 140 mmol/l chlorku sodu, 1 mmol/l chlorku magnezu, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L chlorku potasu, 10 mmol/L glukozy i 1,8 mmol/L chlorku wapnia. Sterylizować przez filtrację, używając membrany 0,22 μm.
  2. Powlekanie płytki do hodowli komórkowych
    1. W przypadku płytek hodowlanych hiPSC należy nałożyć 1 ml EMS na każde zagłębienie płytki 6-dołkowej i inkubować płytkę przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Odessać roztwór DMEM/F12 przed wysiewem komórek.
    2. W celu pokrycia żelatynowego rozpuść 0,2 g żelatyny w proszku w wodzie klasy kultur tkankowych, aby uzyskać 0,2% (w/v) roztwór. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 min. Pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 2 ml roztworu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przed pasażowaniem komórek należy odessać roztwór i pozostawić płytkę do wyschnięcia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej wewnątrz okapu do hodowli tkankowych.

2. utrzymanie hiPSC i różnicowanie Ddifferentiate kardiomiocytów

  1. Hoduj hiPSC w pożywce hiPSC (patrz krok 1.1.1) z codzienną zmianą pożywki, aż komórki osiągną 80%-90% konfluencji na studzienkę.
    nuta: Do celów konserwacyjnych hiPSC są zazwyczaj gotowe do przejścia co 4 dni.
  2. Aby przejść przez hiPSC, odessać pożywkę i przemyć studzienkę 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek macierzystych (tabela materiałów 1) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5–7 min.
    nuta: Czas inkubacji zależy od gęstości komórek i szybkości dysocjacji, które można zaobserwować pod mikroskopem.
  3. Zneutralizować roztwór do odłączania komórek macierzystych za pomocą 1 ml pożywki hiPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632. Zebrać mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę przez 5 minut przy 200 x g, odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hiPSC zawierającej 5 μM Y-27632.
  4. Wysiewać hiPSC na nowej 6-dołkowej płytce pokrytej EMS w stosunku od 1:6 do 1:18. Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę hiPSC bez Y27632.
  5. Aby zamrozić komórki, należy ponownie zawiesić zdysocjowane hiPSC w pożywce zamrażającej o stężeniu 0,5–1 miliona/500 μl, umieścić zawiesinę w kriowialach i przechowywać je w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Po 24 godzinach przenieść zamrożone fiolki do ciekłego azotu.
  6. Aby to zmienić, zastąp pożywkę hiPSC 2 ml pożywki RB uzupełnionej 10 μM inhibitorem GSK-3β CHIR99021 (CHIR) przy 80%-90% konfluencji komórek. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę 3 ml pożywki RB i inkubować przez dodatkowe 48 godzin (dzień 3).
  7. W dniu 3 zmień pożywkę na 3 ml pożywki RB z 10 μM inhibitorem Wnt IWR1 przez 48 godzin (dzień 5), a następnie zastąp pożywkę 3 ml pożywki RB i utrzymuj przez 48 godzin (dzień 7).
  8. W 7 dniu zastąp pożywkę 3 ml pożywki RB i zmieniaj pożywkę co 3 dni. Spontaniczne bicie hiPSC-CM należy obserwować między 7 a 10 dniem.

3. Oczyszczanie hiPSC-CMs i wstępna obróbka małych cząsteczek

UWAGA: Do dysocjacji hiPSC-CM użyto wysoce oczyszczonych, rekombinowanych enzymów dysocjacji komórek (Tabela Materiałów 1).

  1. W 21 dniu po różnicowaniu hiPSC-CM odessać pożywkę i przemyć komórki 1x sterylnym PBS. Inkubować komórki z 0,5 ml enzymów dysocjujących komórki na studzienkę przez 5–7 minut w temperaturze 37 °C. Wielokrotnie pipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu dokładnej dysocjacji komórek.
  2. Po dysocjacji komórek dodać 1 ml roztworu neutralizującego do każdej studzienki, zebrać mieszaninę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze neutralizującym.
  3. Ponownie posadź komórki na pokrytych żelatyną płytkach 6-dołkowych o gęstości 2 milionów komórek na dołek.
  4. Po 24–48 godzinach zastąp pożywkę pożywką oczyszczającą na 3–5 dni.
    nuta: Oczyszczanie jest zakończone, gdy ponad 90% komórek w każdym polu widzenia mikroskopu bije. Aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu kardiomiocytów, nie należy przedłużać czasu oczyszczania powyżej 5 dni. Jeśli pierwsza runda nie przyniesie wymaganej czystości, zastąp pożywkę oczyszczającą pożywką RB+ na 1 dzień, a następnie zakończ drugą rundę oczyszczania.
  5. Przed przeszczepem należy hodować komórki w grupie leczonej przez 12 godzin w pożywce RB+ uzupełnionej 10 μM Y-27632. Podobnie należy przeprowadzić leczenie werapamilem na komórkach w pożywce RB+ za pomocą 1 μM werapamilu przez 12 godzin (hiPSC-CMs+VER).
  6. Po poddaniu działaniu substancji należy przemyć hiPSC-CMs 1x PBS i inkubować komórki z 0,5 ml enzymów dysocjacji komórek na dołek przez maksymalnie 2 minuty. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby dokładnie zdysocjować komórki. Zneutralizować komórki roztworem neutralizującym, zebrać mieszaninę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Zawiesić komórki w PBS w stężeniu 0,1 miliona komórek/5 μl w celu przygotowania do wstrzyknięcia.

4. Zawał mięśnia sercowego i przeszczep komórek

UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne są wstępnie sterylizowane w autoklawie i utrzymywane w stanie aseptycznym podczas wielu operacji za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami (Tabela materiałów 2).

  1. Znieczulenie myszy NOD/scid (tabela materiałów 2) wziewnym izofluranem (1,5%-2%). Monitoruj poziom znieczulenia na podstawie reakcji myszy na uszczypnięcie palca u nogi. Umieść maść optyczną weterynarza na oczach, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu.
  2. Podawać podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu złagodzenia bólu przed zabiegiem.
  3. Ustaw i zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na rozgrzanym stole operacyjnym, usuń włosy z brzusznej okolicy szyi i lewej klatki piersiowej za pomocą kremu do depilacji, odsłoń skórę i zdezynfekuj ją 70% alkoholem.
  4. Wytnij 0,5 cm nacięcie na środku szyi za pomocą nożyczek chirurgicznych, oddziel podskórny tłuszcz sterylnymi kleszczami i odsłoń tchawicę. Wprowadzić doustnie kaniulę intubacyjną do tchawicy, podłączyć kaniulę do respiratora dla małych zwierząt i dostosować ustawienia wentylacji (ustaw objętość oddechową na 100–150 μl, a częstość oddechów na 100x–150x na minutę).
  5. Po ustabilizowaniu się myszy wytnij 0,5 cm nacięcie na środku skóry lewej klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby tępo oddzielić warstwę mięśniową i wykonaj małe nacięcie w piątej przestrzeni międzyżebrowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Umieść retraktor w nacięciu, aby otworzyć jamę piersiową i zlokalizować lewą zstępującą tętnicę wieńcową (LAD). Pod mikroskopem chirurgicznym preparacyjnym podwiązaj LAD za pomocą 8-0 szew niewchłanialny.
  6. Bezpośrednio po indukcji zawału mięśnia sercowego należy wstrzyknąć 5 μl hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs+RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs+VER lub równą objętość PBS do mięśnia sercowego myszy w każdym miejscu (3 x 105 komórek/zwierzę, 1 x 105 komórek/miejsce), jeden w obszar zawału i dwa w obszary wokół zawału.
    nuta: Ponieważ 5 μl to bardzo mała objętość, nie jest łatwo dokładnie kontrolować objętość poprzez bezpośrednie zasysanie jej strzykawką. Pokrywkę sterylnej szalki Petriego można odwrócić, a 5 μl komórek można najpierw nanieść na pokrywkę za pomocą pipety. Ze względu na napięcie powierzchniowe nie rozprzestrzenia się, ale skondensuje się w niewielką płynną masę. Może być łatwo wchłonięty i wstrzyknięty do mięśnia sercowego myszy.
  7. Wyeliminuj resztki powietrza w jamie klatki piersiowej, wypełniając ją ciepłym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej. Zszyj żebra, mięśnie i skórę w kolejności za pomocą wchłanialnego szwu 6-0. Wyłączyć wstrzykiwanie znieczulenia izofluranem. Trzymaj zwierzęta operowane na poduszce grzewczej i uważnie je obserwuj, aż odzyskają pełną świadomość. Następnie umieść zwierzęta w czystej klatce. Nie należy zwracać zwierząt do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.
  8. Po zabiegu chirurgicznym należy wstrzykiwać myszom dootrzewnowo buprenorfinę (0,1 mg/kg) co 12 godzin przez 3 kolejne dni i wstrzykiwać im ibuprofen (5 mg/kg) co 12 godzin przez jeden dzień. Wykonaj kolejne badania analityczne w określonych punktach czasowych.
    nuta: Postępuj zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji opieki nad zwierzętami dotyczącymi analgezji.

5. Zapis stanów przejściowych wapnia i kurczliwości

  1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm należy umieścić w autoklawie (tabela materiałów 2) i pęsetę w małej szklanej zlewce w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 15 min. Szkiełka nakrywkowe i pęsetę schłodzić w temperaturze 4 °C.
  2. Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywkowe w 12-dołkowej płytce i odpipetuj 300 μl macierzy zewnątrzkomórkowej na każde szkiełko nakrywkowe.
    nuta: Nie pozwól, aby matryca wystawała poza krawędź szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec zmniejszeniu ilości powłoki matrycy. Inkubować 12-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Odessać pożywkę na pokrytej żelatyną 6-dołkowej płytce z oczyszczonymi hiPSC-CMs, przemyć ją 1x PBS, a następnie wytrawić 0,5 ml enzymów dysocjujących komórki przez 1,5 min. Dodać 1 ml roztworu neutralizującego, pipetować kilkakrotnie nie więcej niż 5x–10x pipetą o pojemności 1 ml i odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 3 min.
  4. Odessać powlekaną macierz zewnątrzkomórkową z szkiełek nakrywkowych. Policz liczbę komórek i ponownie zawieś komórki w roztworze neutralizującym do stężenia 40 000/300 μl, a następnie dodaj 300 μl zawiesiny komórek na każde szkiełko nakrywkowe. Wyhodować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. Po 24 godzinach delikatnie odessać zobojętniony roztwór, dodać 500 μl pożywki RB+ do każdego dołka płytki i kontynuować hodowlę przez 2 dni.
  6. Dodać Y-27632 (10 μM), aktywator kinazy Rho (RA, 100 nM), werapamil (1 μM) lub równą objętość PBS do pożywki hodowlanej hiPSC-CMs, 12 godzin przed wykryciem przejściowego wapnia i kurczliwości.
    nuta: Oprócz wykrywania przejściowości wapnia i kurczliwości komórek po 12 godzinach obróbki chemicznej, testowano również wykrywanie tych parametrów po 12, 24, 48 i 72 godzinach od wycofania chemicznego.
  7. Wyjmij płytkę, wyrzuć podłoże i umyj płytkę 1x PBS. Zmienić pożywkę na DMEM wolny od czerwieni fenolowej zawierający 0,02% (w/v) poliolu środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów 1), wskaźnik wapnia 5 μM (tabela materiałów 1) i odpowiadający mu Y-27632 (10 μM), RA (100 nM), werapamil (1 μM) lub równą objętość PBS, i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Wyrzuć supernatant, przemyj komórki 3x bezbarwnikową pożywką DMEM i pozwól pożywce odpocząć przez 30 minut, aby odestryfikować barwnik mapujący.
  9. Umieścić szkiełko nakrywkowe z nasionami komórek w otwartej komorze kąpieli i włożyć komorę do systemu mikroinkubacji o temperaturze 37 °C z automatycznym regulatorem temperatury (tabela materiałów 2), perfuzjować go roztworem Tyrode'a i ciągle dodawać inhibitor kinazy Rho (RI), RA lub PBS do roztworu perfuzyjnego.
  10. Użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Tabela materiałów 2) i laserowej głowicy skanującej (Tabela materiałów 2), aby zarejestrować spontaniczne stany przejściowe wapnia za pomocą skanowania linii x-t, przy użyciu lasera argonowego 488 nm do wzbudzenia barwnika i filtra barierowego 515 ± 10 nm do zbierania światła emisyjnego. Rejestruj spontaniczne skurcze hiPSC-CM za pomocą funkcji kontrastu interferencji różnicowej w mikroskopie konfokalnym (tabela materiałów 2).
    nuta: Zapisy stanów przejściowych wapnia przetworzono i przeanalizowano za pomocą oprogramowania MATLAB R2016A (Tabela materiałów 4). Testy zmian skurczu komórek przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ (Tabela materiałów 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyte w tym badaniu hiPSC-CM pochodziły od człowieka z genem reporterowym lucyferazy; dlatego też wskaźnik przeżycia przeszczepionych komórek in vivo został wykryty za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI)17 (Rysunek 1A,B). W przypadku histologicznych wycinków serca podwójnie dodatnie komórki podwójnie dodatnie swoistej dla ludzkiego sercowego troponiny T (hcTnT) i ludzkiego antygenu jądrowego (HNA) sklasyfikow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy tego badania obejmują uzyskanie czystych hiPSC-CM, poprawę aktywności hiPSC-CM poprzez wstępne leczenie Y-27632 i wreszcie przeszczepienie precyzyjnej ilości hiPSC-CM do mysiego modelu MI.

Kluczowe kwestie, które zostały tutaj poruszone, polegały na tym, że po pierwsze, zoptymalizowaliśmy metody oczyszczania bez glukozy19 i opracowaliśmy nowatorski, wydajny system oczyszczania. Procedura systemowa obejmowała zastosowanie enzymów dysocjacji komórek, ponown...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Josephowi C. Wu (Uniwersytet Stanforda) za uprzejme dostarczenie konstrukcji Fluc-GFP oraz Dr. Yanwen Liu za doskonałą pomoc techniczną. Badanie to jest wspierane przez granty National Institutes of Health RO1 HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (dla J.Z.) i HL121206A1 (dla L.Z.) oraz grant R56 HL142627 (dla WZ), American Heart Association Scientist Development Grant 16SDG30410018 oraz University of Alabama w Birmingham Faculty Development Grant (dla W.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
Accutase (roztwór do odrywania komórek macierzystych)STEMCELL Technologies#07920
B27 bez insulinyFisher ScientificA1895601
Suplement B27Fisher Scientific17-504-044
CHIR99021Technologie komórek macierzystych72054
DMEM (1x), wysoki poziom glukozy, HEPES, bez czerwieni fenolowejThermofisher20163029
Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (wskaźnik wapnia)Invitrogen/ThermofisherF14201
Bez glukozy RPMI 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Technologie komórek macierzystych72562
Matrigel (macierz zewnątrzkomórkowa)Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR (pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych)STEMCELL Technologies85850
Antybiotyk Pen-strepFisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127 (poliol powierzchniowo czynny)Sigma-AldrichP2443
Aktywator Rho IICytoszkieletCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
DL-mleczan soduSigma-AldrichL4263
TrypLE (enzymy dysocjacji komórek)Fisher Scientific12-605-010
VerapamilSigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Sprzęt i zaopatrzenie
IVIS Lumina III Instrumenty bioluminescencyjnePerkinElmerCLS136334
15 mm Szkiełka nakrywkoweWarnerCS-15R15
WirówkaEppendorf5415R
Mikroskop konfokalnyOlympusIX81
CryostatThermo ScientificNX50
Podwójny automatyczny regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-344B
Zasilacz do elektroforezyBIO-RAD1645050
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX83
pco1200 s
Laserowa głowica skanującaOlympusFV-1000
Niskoprofilowa otwarta komora kąpielowa (montowana w powyższym systemie mikroinkubacji)System mikroinkubacjiWarner InstrumentsRC-42LP
Warner InstrumentsDH-40iL
Minivent Wentylator dla myszyAparat Harvard845
myszy NOD/SCIDJackson Laboratory001303
Prefabrykowane żele białkoweBIO-RAD4561033
Pakiety transferowe PVDFBIO-RAD1704156
System Trans-BlotBIO-RADTrans-Blot Turbo
Sterylizator gorących kulekFine Science Tools18000-45
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało
Anty-ludzka nukleolina (Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Troponina sercowa TR& Systemy DMAB1874
Troponina sercowa CAbcamab137130
Troponina sercowa IAbcamab47003
Cy5-osioł anty-myszLaboratorium ImmunoResearch Jacksona715-175-150
Cy3-osioł anty-królikJackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-osioł anty-myszJackson Laboratorium ImmunoResearch715-095-150
GAPDHAbcamab22555
Ludzka troponina sercowa TAbcamab91605
Integryna β 1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-kadherynaAbcamab18203
Łańcuch lekki fosfo-miozyny 2Technologia sygnalizacji komórkowej3671s
NazwaCompany<strong>Numer katalogowyComments
Software
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g
Szybka kamera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  3. Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
  4. Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524(2018).
  5. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  6. Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
  7. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  8. Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
  9. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  10. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148(2010).
  11. Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
  12. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  13. Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
  14. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  15. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  16. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  17. Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
  18. Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
  19. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  20. Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012(2014).
  21. Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206(2012).
  22. Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
  23. Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibicja kinazy Rhowst pne traktowanie Y 27632stopie prze ywalno ci przeszczepionych kom rekmodel zawa u mi nia sercowegoenzymy do dysocjacji kom rekpomiary przej ciowych zmian st enia wapniamikroskopia konfokalnaanaliza Western blottest aktywno ci lucyferazy

Powiązane artykuły